MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1
Đặt vấn đề ...................................................................................................1
Mục đích nghiên cứu ...................................................................................3
Phạm vi nghiên cứu .....................................................................................3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4
1.1. Lý thuyết về chất kích thích tăng trưởng họ Beta-agonist ......................4
1.1.1. Clenbuterol ........................................................................................7
1.1.2. Salbutamol ........................................................................................9
1.2. Tình hình nghiên cứu về nhóm Beta-agonist ở nước ngoài và trong nước .. 10
1.2.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài.................................................. 11
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước .................................................. 13
1.3. Thực trạng sử dụng Beta-agonist trong thịt ở trong nước và trên thế
giới............................................................................................................ 15
1.4. Một số phương pháp được sử dụng để phân tích Beta-agonist ............. 16
1.4.1. Phương pháp ELISA ........................................................................ 17
1.4.2. Phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) ............. 20
1.5. Một số vấn đề cơ bản về thẩm định phương pháp phân tích sàng lọc ... 21
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ....................................................................................................... 23
2.1. Vật liệu nghiên cứu: ........................................................................... 23
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 23
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 23
2.1.3. Thời gian nghiên cứu ....................................................................... 23
2.1.4. Hóa chất và thuốc thử ...................................................................... 23
2.1.5. Thiết bị, dụng cụ .............................................................................. 23
2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 23
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 24
2.3.1. Xác định sự có mặt của Salbutamol trong thịt lợn bằng phương
pháp ELISA .............................................................................................. 26
2.3.2. Xác định sự có mặt của Clenbuterol trong thịt lợn bằng phương



DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
- Clen: Clenbuterol
- ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
- HPLC: High-performance liquid chromatograph
- LC/MS/MS: Sắc ký lỏng khối phổ
- LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
- LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)
- NN&PTNT: Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
- ppb: Phần tỷ (Parts per billion)
- Sal: Salbutamol
- TACN: Thức ăn chăn nuôi
- TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii


DANH MỤC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1.

Nhóm chất β2-agonist


37

Bảng 3.4.

Kết quả phân tích Clenbuterol mẫu trắng đánh giá LOD

39

Bảng 3.5.

Kết quả phân tích Clenbuterol mẫu thêm chuẩn đánh giá LOD

39

Bảng 3.6.

Kết quả phân tích Salbutamol mẫu trắng đánh giá LOD

40

Bảng 3.7.

Kết quả phân tích Salbutamol mẫu thêm chuẩn đánh giá LOD

41

Bảng 3.8.

Kết quả phân tích Clenbuterol và Salbutamol mẫu thêm chuẩn

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Cấu trúc hóa học của nhóm chất β1-agonist

4

Hình 1.2

5

Hình 1.3

Cấu trúc hóa học nhóm chất β2 -agonist có tác dụng kéo
dài
Cấu trúc hóa học nhóm chất β2 -agonist có tác dụng ngắn

6

Hình 1.4

Cấu trúc hóa học nhóm chất Beta-agonist chưa được phân

7

loại
Hình 1.5


quả phân tích
pháp Elisa và

48

Hình 3.2

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ix


MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Ngày nay khi xã hội phát triển càng cao thì nhu cầu đời sống con người
cũng cao hơn, chất lượng an toàn thực phẩm chiếm một vị trí rất quan trọng. Các
ngành, các cơ quan quản lý Nhà nước cũng đang có những đề án, chương trình
nhằm nâng cao chất lượng quản lý và sử dụng các chất kháng sinh trong các lĩnh
vực cụ thể. Tuy nhiên, việc quản lý và hướng dẫn sử dụng thuốc kháng sinh còn
chưa được đồng bộ và triệt để, tình trạng sử dụng các chất kháng sinh còn khá
tùy tiện. Dẫn đến sự tồn dư các chất kháng sinh, gây nguy hại đến sức khỏe
người tiêu dùng.
Trong lĩnh vực dược phẩm, Beta-agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều
trong điều trị bệnh hen suyễn hay tắc nghẽn phổi mãn tính, hai chất điển hình là
Salbutamol và Clenbuterol.
Nhu cầu của người sử dụng ngày càng cao, càng thúc đẩy sự tăng trưởng
và tăng lượng nạc cho gia súc, gia cầm. Dẫn đến việc sử dụng kích thích tố tăng
trưởng, hormone tăng trọng ngày càng phổ biến từ nhà sản xuất thức ăn chăn
nuôi đến người chăn nuôi. Clenbuterol và Salbutamol được đưa vào trong thức

nhiều về khả năng ứng dụng theo mục đích sử dụng và điều kiện thực tế tại
phòng thử nghiệm ở Việt Nam. Việc đánh giá loại kit ELISA phù hợp cho phân
tích định tính dư lượng Beta-agonist trong thịt lợn phải phù hợp với quy định
trong Quyết định số 2002/657/EC do Ủy ban Châu Âu thiết lập cho phương pháp
bán định lượng và cần được khẳng định bằng phương pháp định lượng Sắc ký
lỏng khối phổ (LC/MS/MS).
Để góp phần giúp cơ quan có thẩm quyền, đặc biệt là Sở Nông nghiệp và
Phát triển nông thôn Hà Nội lựa chọn loại kit ELISA phù hợp cho phân tích định
tính dư lượng Beta-agonist trong thịt lợn, góp phần xây dựng các chiến lược
phòng ngừa chất tồn dư độc hại trong thực phẩm có nguồn gốc động vật, đảm
bảo cung cấp thực phẩm an toàn cho nguời tiêu dùng. Xuất phát từ sự cấp bách
của tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên cứu về Betaagonist được công bố trong và ngoài nước, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Đánh
giá khả năng định tính nhóm Beta-agonist trong thịt bằng kit Beta-agonist

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


ELISA của hãng Randox (Anh)”
Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc quản lý, bảo đảm vệ sinh an toàn
thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.
Mục đích nghiên cứu
Đánh giá sự phù hợp của kit ELISA trong việc sàng lọc định tính Betaagonist (Clenbuterol và Salbutamol) trong thịt.
Tạo thuận lợi cho các cơ quan quản lý nhà nước trên địa bàn Hà Nội lựa
chọn kit thử nhanh, phù hợp để nâng cao chất lượng quản lý an toàn thực phẩm.
Phạm vi nghiên cứu
Beta-agonist là một nhóm các hợp chất tự nhiên, có nguồn gốc từ các
Catecholamines, hiện có khoảng hơn 20 hợp chất khác nhau. Hiện nay tại Việt
Nam, những chất thường được sử dụng trong chăn nuôi là Clenbuterol,

Bảng 1.1. Nhóm chất β2-agonist
Nhóm
Điển
hình

Tác dụng ngắn
Levoalbuterol
Salbutamol (Albuterol,
Ventolin)
Terbutaline
Pirbuterol (Maxair)
Procaterol
Orciprenaline
Metaproterenol
(Alupent)
Fenoterol
Bitolterol mesylate
Ritodrine

Tác dụng kéo dài
Tác dụng siêu dài
Salmeterol (Serevent Indacaterol
Diskus)
Formoterol (Foradil)
Bambuterol
Clenbuterol

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học nhóm chất β2 -agonist có tác dụng kéo dài

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

cho người có sử dụng Clenbuterol đều bị cấm bởi FDA (FARAD, 2014).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


Clenbuterol có thể gây ra những tác dụng phụ: căng thẳng, nhiễm độc giáp, nhịp
tim nhanh, huyết áp cao,... Sử dụng quá nhiều so với khuyến cáo khoảng 120 mg
có thể gây ra chấn động cơ, đau đầu, chóng mặt và kích ứng dạ dày. Có thể xác
định sự hiện diện của nó trong tinh dịch hay nước tiểu (MedicineNet, 2015).
Vào tháng Chín năm 2006, hơn 330 người ở Thượng Hải cho biết đã có
ngộ độc thực phẩm do ăn thịt lợn nhiễm clenbuterol đã được làm thức ăn cho các
loài động vật để giữ cho thịt nạc.
Vào tháng Hai năm 2009, ít nhất 70 người ở một tỉnh của Trung Quốc
(Quảng Đông) bị ngộ độc thực phẩm sau khi ăn nội tạng lợn cho là chứa
clenbuterol dư lượng (Wang Ying, 2009).
Trong tháng 3 năm 2011, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc đã mở chiến dịch
đàn áp về phụ gia bất hợp pháp trong thức ăn cho lợn, sau khi một công ty con
của Tập đoàn Shuanghui, nhà sản xuất thịt lớn nhất Trung Quốc, sử dụng
Clenbuterol trong các sản phẩm thịt lợn. Tổng cộng có 72 người ở tỉnh Hà Nam,
nơi Shuanghui đặt trụ sở, đã bị bắt vì sản xuất, bán hoặc sử dụng clenbuterol
(Xinhua, 2011). Tình hình đã được cải thiện đáng kể ở Trung Quốc kể từ tháng 4
năm 2011 khi lệnh cấm của Clenbuterol đã được công bố bởi Bộ Nông nghiệp
Trung Quốc.
* Clenbuterol trong y học
- Một số tên gọi khác của clenbuterol trong y học: Spiropent,
Ventipulmin...
- Trong y học, clen có tác dụng làm dãn phế quản, dãn cơ trơn ở cuống
phổi,clen còn là dược phẩm được chỉ định để điều trị các chứng bệnh có liên

Essential Medicines, một danh sách gồm các loại thuốc quan trọng nhất cần thiết
trong một hệ thống y tế cơ bản (WHO, 2014).
Salbutamol kết hợp với các thụ thể β2-adrenergic với ái lực cao hơn các
thụ thể β1. Trong đường hô hấp, sự họat hóa các thụ thể β2 làm giãn các cơ ở khí
quản và do đó khí quản mở rộng ra và lượng không khí vào phổi sẽ tăng lên.
Salbutamol sulfate cho hiệu quả khá nhanh chỉ trong vòng 5-15 phút sau khi xịt
mũi.
Trong sản khoa, họat động của các thụ thể β2 làm giản cơ trơn tử cung và
vì vậy nó có tác dụng làm trì hoãn việc đẻ non.
Salbutamol thường được sử dụng để điều trị co thắt phế quản (do bất kỳ
nguyên nhân nào, do chất gây dị ứng hen suyễn hoặc do tập luyện), cũng như
bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


Salbutamol cũng được sử dụng trong sản khoa, nó được sử dụng như một
thuốc giảm co để thư giãn các cơ trơn tử cung để trì hoãn sinh non.
Salbutamol được sử dụng để điều trị tăng kali máu cấp tính vì nó kích
thích kali chảy trong các tế bào do đó làm giảm mức độ trong máu.
Salbutamol cũng đã được thử nghiệm trong teo cơ tủy sống và cho thấy lợi
ích khiêm tốn. Thuốc được suy đoán để điều chỉnh nối thay thế của gen SMN2,
tăng lượng protein SMN bị thiếu được coi là nguyên nhân gốc rễ của bệnh
(Lewelt, 2011 và Van Meerbeke, 2011).
Các tác dụng phụ thường gặp nhất là run tốt, lo lắng, đau đầu, chuột rút cơ
bắp, khô miệng,... Các triệu chứng khác có thể bao gồm nhịp tim nhanh, loạn
nhịp tim, đỏ bừng mặt, thiếu máu cục bộ cơ tim (hiếm) và rối loạn giấc ngủ, hành
vi. Hiếm khi xảy ra, nhưng quan trọng, là phản ứng dị ứng co thắt phế quản

cho các con vật sử dụng “doping” với clenbuterol để tăng khối cơ.
• Người tiêu thụ gan động vật sử dụng thức ăn chứa clenbuterol có biểu
hiện run rẩy, tim đập nhanh, đau đầu, chóng mặt và buồn nôn.
• Dư lượng của clenbuterol tồn tại trong võng mạc mắt và trong tóc lâu tới
vài tháng.
Các tác giả Warriss P. D và cộng sự (1990 và 1991), Fawcett J. P và cộng
sự (2004) đã nghiên cứu ảnh hưởng của salbutamol lên thịt heo, một số chuyển
hóa về mặt sinh học của gia súc khi sử dụng hợp chất này. Do tính độc hại của
các hợp chất thuộc nhóm Beta-agonist, từ nhiều năm, các nhà nghiên cứu trên thế
giới đã không ngừng phát triển các các phương pháp, quy trình để xác định
clenbuterol, salbutamol nói riêng và các hợp chất thuộc nhóm Beta-agonist nói
chung. Nhiều phương pháp khác nhau được nghiên cứu: phương pháp ELISA,
sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng (LC), sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), sắc ký
lỏng ghép khối phổ (LC-MS). Các trị số thường được dùng cho việc đánh giá độ
chính xác của các phương pháp phân tích chủ yếu là giới hạn phát hiện (LOD)
hoặc giới hạn định lượng (LOQ), hiệu suất thu hồi, các trị số này trên nguyên tắc
cần đáp ứng các quy định và tiêu chuẩn đã có của Châu Âu và của Codex.
Theo các tài liệu đã công bố, từ năm 1990 đến 1999, nhiều tác giả đã
nghiên cứu phương pháp phân tích clenbuterol, salbutamol bằng LC-MS, LCMS/MS với các giá trị LOD cho clenbuterol trong nhiều nền mẫu khác nhau
(thịt, gan, thận, thức ăn gia súc, mẫu máu..) thường đạt từ 0,02 đến 0,5 ppb; với
phương pháp phân tích Beta-agonist trên các nền mẫu sinh học bằng sắc ký khí

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


(GC-MS), các nghiên cứu được công bố cho giá trị LOD < 0,5 ppb hoặc không
công bố giá trị LOD. Riêng trong năm 1999, Guy và cộng sự thuộc trung tâm
nghiên cứu Nestlé - Switzerland đã thông báo phương pháp phân tích clenbuterol



Nhìn chung, Beta-agonist không được phép sử dụng làm chất tăng trọng
trong thức ăn chăn nuôi ở nhiều nước trên thế giới, hàm lượng tối đa cho phép
(MRLs) hiện nay chỉ có quy định cho clenbuterol với MRL là 0,1 ppb trong thịt,
0,5ppb trong gan theo Châu Âu hoặc 0,2 ppb trong thịt và 0,6 ppb trong gan theo
Codex Alimentarius. Riêng đối với Việt Nam, Beta-agonist tuyệt đối bị cấm sử
dụng trong TACN và do đó không được có trong thịt gia súc, gia cầm (Bộ NN và
PTNT, 2009)
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước
Việc phân tích Clenbuterol, Salbutamol tại nhiều phòng thí nghiệm ở Việt
Nam vào năm 2006, chủ yếu được thực hiện với phương pháp ELISA (dựa vào
phản ứng kháng nguyên - kháng thể). Tuy nhiên, không có nhiều công trình lớn
về ứng dụng phương pháp này để định tính Beta-agonist trong thịt, bởi ELISA có
tính sàng lọc và có thể cho kết quả dương tính giả. Theo quyết định 2002/657/
EC của châu Âu, một phương pháp sàng lọc, dù đã được chứng minh có thể áp
dụng được cho đối tượng kiểm nghiệm, vẫn phải được xác minh lại bằng một
phương pháp có tính khẳng định hơn nếu nghi ngờ về kết quả.
Năm 2006, trong hội thảo về hormon tăng trưởng do Viện Khoa Học Kỹ
Thuật Nông nghiệp miền Nam và Hiệp hội thức ăn chăn nuôi tổ chức, Cục Chăn
nuôi (Bộ NN&PTNT) đã công bố kết quả kiểm tra (từ 20/6 - 3/11/2006) theo đó
cơ quan chức năng đã phát hiện 47/428 mẫu dương tính với clenbuterol.
Năm 2007, Phạm Xuân Viết và cộng sự, Trường Đại Học Dược Hà Nội đã
nghiên cứu phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao, một tứ cực, để định lượng
salbutamol trong huyết tương, hiệu suất chiết salbutamol ở các nồng độ 10, 75,
200ppb khoảng 80%.
Năm 2008, Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí nghiệm TPHCM đã
nghiên cứu và xây dựng qui trình phân tích clenbuterol bằng sắc ký khí ghép
khối phổ (GC/MS) đạt hiệu suất thu hồi từ 65- 88%; giá trị LOD đối với TACN
là 0,16 ppb (clen), 0,11 ppb (sal); giá trị LOD đối với thịt là 0,05 ppb (clen), 0,07

tra mức độ tồn dư clenbuterol và salbutamol trong thịt heo, thịt gà trên thị trường
hoặc do chúng tôi tự nuôi với thức ăn có chứa clenbuterol và salbutamol.
+ Năm 2009, nhóm tác giả Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Nhựt Xuân
Dung, Phạm Thị Ánh, Chu Phạm Ngọc Sơn nghiên cứu ảnh hưởng của
clenbuterol, salbutamol trên sự tăng trọng gà, heo và đánh giá độ tồn lưu của
chúng trên gà heo bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực
(LC/MS/MS).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14


+ Vào tháng 4 năm 2011, nhóm tác giả Nguyễn Thị Thu Thủy, Lâm Văn
Xự, Phạm Thị Ánh, Chu Phạm Ngọc Sơn, Trần kim Tính đã báo cáo về phân tích
salbutamol trong thịt và thức ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS (Nguyễn Thị Thu
Thủy và cs, 2011).
1.3. Thực trạng sử dụng Beta-agonist trong thịt ở trong nước và trên thế giới
Theo Thông tư số 57/2012/TT-BNNPTNT ngày 07 tháng 11 năm 2012
của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN và PTNT, 2012), giới hạn
cho phép của Clenbuterol và Salbutamol trên các nền mẫu được quy định như
sau:
Bảng 1.2. Giới hạn cho phép Clenbuterol và Salbutamol trên các nền mẫu
Loại mẫu

Clenbuterol (ppb)

Salbutamol (ppb)

Thức ăn chăn nuôi


0,2

5,0

Gan

0,2

5,0

Máu

0,2

5,0

Theo kết quả điều tra của Chi cục Thú y Thành phố Hồ Chí Minh năm
2005, trong 500 mẫu thịt lợn lấy tại TPHCM có 30% mẫu dương tính với chất
clenbuterol. Tháng 11/2009 Chi cục Thú y TP.HCM phối hợp với Sở Y tế
TP.HCM kiểm tra định kỳ thịt lợn đã phát hiện có đến 10% của 500 mẫu thịt
dương tính với clenbuterol. Gần đây, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm đã kiểm tra
sự có mặt của các chất beta-angonist trong các mẫu thức ăn gia súc sản xuất công

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 15


nghiệp, nước tiểu của lợn đang nuôi, thịt và nội tạng của lợn đã giết mổ bán tại

Page 16


Phương pháp phân tích bằng sắc ký khí có ưu điểm là cho độ nhạy, độ
chính xác và độ ổn định cao. Tuy nhiên, nhược điểm là thời gian phân tích lâu,
do cả hai chất Salbutamol và Clenbuterol đều khó bay hơi nên phải tạo dẫn xuất
để chuyển thành những chất dễ bay hơi và bền nhiệt.
1.4.1. Phương pháp ELISA
Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm
hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là
đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó
kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là
nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một
chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng
thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng
nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất
như peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn được gọi bởi một
tên gọi khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay)
Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên
hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn
dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn
hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau. ELISA được dùng để xác định
nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh.
Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên,
kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước:
- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể
- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải
phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay
đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm.

(capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies).
Sandwich ELISA có thể được chia làm hai hệ thống:
* Sandwich ELISA trực tiếp
- Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu
sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau.
- Vì phương pháp này có ưu điểm hơn hẳn những phương pháp khác mà
chúng tôi chọn phương pháp này để chẩn đoán bệnh virus đang nghiên cứu.
Chú ý: Nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau có
thể dẫn đến vấn đề nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện. Mối

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 18


quan hệ về kích thước và vị trí không gian của các epitope cũng có ảnh hưởng
đến thử nghiệm.
* Sandwich ELISA gián tiếp
Chuyên biệt hơn Direct sanwich ELISA do antispecies kháng thể được
gắn enzyme không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên.
d. Phản ứng ức chế /cạnh tranh
Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa là hai chất tham gia phản ứng cùng ái lực
bắt cặp với chất thứ ba. Phản ứng cạnh tranh đúng đắn thì hai chất cạnh tranh
phải được đưa vào đồng thời.
Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh. Cả hai phản ứng đều có sự tham
gia của hai kháng thể phản ứng với kháng nguyên. Nếu một kháng thể được ủ
trước phản ứng đó được gọi là ức chế (blocking/ inhibition assays). Phản ứng
cạnh tranh mang nghĩa cả hai kháng thể được thêm vào đồng thời với nhau.
* Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA
- Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng;

Quá trình tách diễn ra trong cột sắc ký. Tại cột, sự tách của các chất được
diễn ra bởi sự tương tác giữa pha tĩnh với pha động. Do các cấu tử chất phân tích
có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển ra khỏi cột với tốc độ khác
nhau. Khi hợp chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, chúng đi vào MS. Tại phần MS
chất cần phân tích sẽ bị bắn phá thành những mảnh nhỏ hơn, mang tính đặc trưng
cho từng chất.
Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS/MS) là kết nối phần lỏng (HPLC)
với phần đầu dò khối phổ có dòng điện ion hóa (mass spectrometry - MS). Sau
khi các cấu tử tách ra khỏi nhau sẽ lần lượt đi vào buồng ion hóa, tại đây chúng
bị va chạm với dòng electron mang năng lượng cao làm các phân tử mẫu trung
hoà bị bật ra các electron và phá vỡ phân tử thành các mảnh ion, mảnh gốc hay
phân tử trung hoà nhỏ. Các mảnh ion hình thành có khối lượng (m) và điện tích
của ion (z). Sau đó chúng được gia tốc ở trong ống tứ cực, được tách biệt khỏi
nhau nhờ bộ phận thiết bị riêng là một nam châm có từ trường hoặc kèm thêm
một điện trường. Sau đó các ion được phát hiện bởi các đetector MS. Tại đó
chúng được chuyển thành tín hiệu điện. Trên sắc đồ nhận được, sẽ có các tín hiệu
ứng với các cấu tử được tách gọi là pic. Dựa vào các mảnh có khối phổ đặc thù
làm cơ sở để khẳng định sự có mặt của chất cần phân tích có trong mẫu. Thời
gian từ khi bơm mẫu đến khi rửa giải gọi là thời gian lưu (TR). Mỗi chất có
những ion đặc trưng (định tính) cho chất cần tách. Diện tích mảnh đặc thù lựa
chọn là thước đo định lượng cho chất cần phân tích.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 20