ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------

NGUYỄN KHẮC KHÁNH
Tên đề tài:

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ
cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Psedomonas
aeruginosa)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

:

Chính quy

Chuyên ngành/ngành:

Công nghệ Sinh học

Khoa

:

CNSH & CNTP

Khóa học


Khoa

: CNSH & CNTP

Khóa học

: 2012-2016

Giảng viên hƣớng dẫn:

BS. NGUYỄN THỊ HUYỀN
TS. NGUYỄN VĂN DUY

Thái Nguyên, năm 2016


ii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc tới TS. Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi và hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến BS. Nguyễn Thị Huyền,
Trưởng khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên,
KTV. Nguyễn Thị Thủy, CN. Trần Trung Anh, Khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện
Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên đã hỗ trợ,giúp đỡ tôi và đã cung cấp các
chủng sinh vật để thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm thuộc khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm

Hình 4.3 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở các điều kiện phản ứng
khác nhau......................................................................................................... 33
Hình 4.4 . Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR sử
dụng khuôn của chủng S. aureus và P. aeruginosa ......................................... 35
Hình 4.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR ở
các nồng độ DNA pha loãng khác nhau.......................................................... 37
Hình 4.6. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khi sử dụng các khuôn khác
nhau ................................................................................................................. 38


v

MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài.......................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu của đề tài .................................................................................. 2
1.2.2. Yêu cầu của đề tài: .................................................................................. 2
1.3. Ý nghĩa đề tài ............................................................................................. 3
1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
2.1.Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa4
2.1.1. Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus ........................................... 4
2.1.2. Giới thiệu chung về Pseumonase aeruginosa .......................................... 9
2.2. Tình hình nghiên cứu về Staphylococcus aureus và Pseudomonas
aeruginosa trong nước và trên thế giới............................................................ 12
2.2.1. Tình hình nghiên cứu về Staphylococcus aureus .................................. 12
2.2.2. Tình hình nghiên cứu về Pseudomonas aeruginosa .............................. 14
2.3. Các phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus và Pseudomonas

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 29
4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng vi khuẩn nghiên cứu..... 29
4.2. Kết quả xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời S. aureus và P.
aeruginosa bằng kỹ thuật multiplex PCR........................................................ 30
4.2.1. Kết quả thử nghiệm khả năng khuếch đại gen mục tiêu của các cặp mồi
sử dụng trong nghiên cứu ................................................................................ 30
4.2.2. Kết quả xác định điều kiện chung của phản ứng PCR sử dụng các cặp
mồi riêng rẽ ..................................................................................................... 32


vii

4.2.3. Kết quả thử nghiệm khả năng khuếch đại của phản ứng multiplex PCR
......................................................................................................................... 35
4.2.4. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR ....... 36
4.2.5. Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR ................ 38
4.3. Kết quả thử nghiệm phát hiện nhanh và đồng thời S. aureus và P.
aeruginosa từ mẫu thu thập tại bệnh viện ....................................................... 39
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 41
5.1. Kết luận .................................................................................................... 41
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 42


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) là một trong những thách thức và mối

xác và nhanh chóng xác định đúng vi sinh vật gây bệnh. Một số kỹ thuật sinh
học phân tử được ứng dụng rộng rãi như : kỹ thuật PCR, kỹ thuật multiplex
PCR, ELISA...trong đó kỹ thuật PCR với độ đặc hiệu cao và thời gian cho kết
quả nhanh chóng đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Xuất phát từ tình hình thực tiễn và dựa trên điều kiện cơ sở vật chất của
khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại Học Nông
Lâm Thái Nguyên tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu
ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu
vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Psedomonas
aeruginosa).”
1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài
1.2.1. Mục tiêu của đề tài
Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng
(Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)
bằng kỹ thuật multiplex PCR.
1.2.2. Yêu cầu của đề tài:
- Tách chiết được DNA tổng số của các chủng vi khuẩn S. aureus và P.
aeruginnosa.
- Tối ưu được phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời S.
aureus và P. aeruginosa
- Thử nghiệm thành công phản ứng multiplex PCR trên các mẫu vi
khuẩn phân lập tại Bệnh viện.


3

1.3. Ý nghĩa đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho việc xây dựng bộ kít phát hiện nhanh
và đồng thời tụ cầu vàng (S. aureus) và trực trùng mủ xanh (P. aeruginosa).

huyết thanh 6, 7, 42E, 47, 53, 54, 75, 77, 83A, 84 và 85; và nhóm IV chỉ có 1
kiểu huyết thanh 42D [37].


5

2.1.1.2. Hình thái và cấu tạo của Staphylococcus aureus
Staphylococcus là những vi khuẩn Gram dương hình cầu và không di
động với đường kính khoảng 0,5-1,5μm. Tế bào Staphylococcus xếp hình
chùm nho không di động , vi khuẩn này có thành tế bào kháng với lysozyme
và khá nhạy với lysotaphin, ngoài ra vi khuẩn này không sinh bào tử và cư trú
trên da và màng nhày của con người cũng như động vật máu nóng [37].

Hình 2.1. Hình ảnh hiển tế bào Staphylococcus aureus
(Nguồn: Wikipedia ( />Ngày nay các nhà khoa học đã thành công trong việc giải trình tự gen
của các chủng tụ cầu vàng được ký hiệu như sau: Newman, COL,
UMRSA252, MW2, MSSA476, N315, Mu50, RF122 ... Steven cùng cộng sự
đã giải trình tự thành công bộ gen của chủng S.aureus COL với kích thước
2809422 bp, kết quả này đã được đăng ký trên Genbank với mã số :
CP000046.1 cho hệ gen và CP000045 cho hệ gen plasmid. Theo kết quả này
thì bộ gen của S. aureus có chứa ít các cặp G-C điều này đã làm nảy sinh mối
lo ngại về sự chuyển gen giữa tụ cầu vàng và các tác nhân gây bệnh gram
dương khác [41] Trong số các chủng S.aureus phân lập từ các mẫu thực
phẩm, tỷ lệ chủng có khả năng sản sinh nội độc tố enterotoxin do nhóm gen


6

SE mã hóa được ước tính chiếm khoảng 25% số chủng, tại Pháp trong số 332
chủng S.aureus được phân lập từ thức ăn có 57% chủng có chứa các gen mã hóa



7

agar), khuẩn lạc của S.aureus tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng
đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường
manitol) [27].
2.1.1.4.Đặc tính và các yếu tố độc lực
Trên lâm sàng việc phân biệt các chủng tụ cầu có khả năng gây bệnh và
không gây bệnh thường dựa vào sự hiện diện của enzyme Coagulase, enzyme
này gắn với prothrompin trong huyết tương và hoạt tính hóa quá trình sinh
fibrin từ tiền chất fibinogen. Enzyme này cùng với yếu tố kết cụm( clumping)
một enzyme vách vi khuẩn giúp tụ cầu vàng tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của
nó. Tính chất này là yếu tố bệnh sinh cực kỳ quan trongjvaf yếu tố cũng đóng
vai trò quan trọng trong chẩn đoán. Tụ cầu vàng còn sản xuất nhiều yếu tố
độc tố độc lực khác có liên quan đến cấu tạo của vách vi khuẩn như :
Vỏ polysaccharide: một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ
polysaccharide vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ tế bào vi
khuẩn chống lại hiện tượng thực bào.
Hầu hết các chủng tụ cầu vàng đều có khả năng tổng hợp một loại
protein bề mặt có khả năng gắn với mảnh thụ thể (Fc) của các glubuline miễn
dịch, chính nhờ hiện tượng này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống. Vì mảnh
Fc của các globuline miễn dịch có vai trò trong hiện tượng opsonin hóa chúng
là các receptor cho các đại thực bào. Qúa trình gắn trên giúp tụ cầu vàng tránh
tránh không bị thực bào
Ngoài ra phần lớn các chủng tụ cầu vàng đều có khả năng sản xuất một
chất kết dính gian bào , nhờ chất này vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học
bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc.
Các yếu tố độc lực ngoại bào, tụ cầu vàng còn sản sinh một số enzyme
quan trọng góp phần tạo nên độc lực mạnh mẽ của chủng vi khuẩn này như:

giúp S. aureus tránh không bị đại thực bào.


9

2.1.2. Giới thiệu chung về Pseumonase aeruginosa
2.1.2.1. Danh pháp, phân loại
Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn thuộc giới Vi khuẩn (Bacteria),
ngành Proteobacteria, lớp Gamma Proteobacteria, bộ Pseudomonadales, họ
Pseudomonadaceae, chi Pseudomonas, loài Pseudomonas aeruginosa [38].
2.1.2.2. Hình thái và cấu tạo
Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn gram âm hiếu khí với khả năng di
chuyển một cực và có hình que . Ngoài khả năng gây bệnh cho người và động
vật thì P.aeruginosa còn có khả năng gây bệnh trên các loài thực vật .
Pseudomonas aeruginosa có vẻ ngoài được mô tả óng ánh và có mùi giông
như nho khi được nuôi cấy in vitro.Ngoài ra, P.aeruginosa có khả năng sinh
trưởng trong môi trường thiếu một phần hay hoàn toàn khí oxy [39].

Hình 2.2. Hình ảnh khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa
(Nguồn:wikipedia( />2.1.2.3. Đặc điểm sinh học
Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram âm hiếu khí, là trực khuẩn
với hai đầu tròn không có vỏ và nha bào, có lông roi ở một đầu nên di động
nhanh . Pseudomonas aeruginosa mọc dễ dàng trên các môi trường thông
thường với nhiệt độ thích hợp là 37 °C , pH = 7,2 - 7,5. Ở môi trường lỏng P.
aeruginosa phát triển làm đục đều và trên bề mặt có váng, ở môi trường rắn
tạo nên khuẩn lạc dạng S tròn đều, to nhẵn, có loại khuẩn lạc nhỏ sù xì, dạng


10



- Protease: gần 90% các chủng P.aeruginosacó khả năng phân giải
protein. P. aeruginosatiết ra 2 loại protease quan trọng là alcaline và elastase.
Nhiều chủng tiết ra collagenase. Các protease này thường có tác dụng hiệp
đồng. Elastase có thể phá hủy lớp chun keo thành mạch máu gây tổn thương
xuất huyết, tạo nên những ổ hoại tử trong thành mạch máu. Enzyme này còn
gây ức chế hiện tượng opsonin hoá, làm giảm khả năng thực bào của bạch cầu
đa nhân trung tính. Ngoài tác động trực tiếp, các protease còn có khả năng
làm thay đổi sức đề kháng của vật chủ thông qua việc bất hoạt bổ thể, phá hủy
cấu trúc của các globulin miễn dịch.
- Hemolysine có 2 loại gồm: Glycolipide (hemolysine chịu nhiệt): không
có tính enzyme, không có tính kháng nguyên và ít độc. Glycolipide đóng vai
trò như một chất tẩy hoà tan các lipid là những chất cần cho hoạt động của
phospholipase C và Phospholipase C (hemolysine không chịu nhiệt): là một
enzyme tan máu nằm trong một polypeptid đơn. Phospholipase C thường tác
động hiệp đồng với glycolipide và protease alcaline gây xuất huyết, hoại tử tại
chỗ tổn thương.
- Cytotoxine (leucocidin): là một protein rất độc với bạch cầu đa nhân
trung tính và các tế bào lympho.
- Exoenzyme S: là một protein, có thể có 2 dạng: dạng không hoạt động
và không có tính enzyme và dạng hoạt động, có tính enzyme.
- Enterotoxin và yếu tố thấm qua thành mạch: các độc tố này còn ít được
biết đến. Một số nghiên cứu đã chứng minh, trong thực nghiệm
enterotoxin gây nên tình trạng ứ dịch trong đường ruột; độc tố này có thể
là một trong những nguyên nhân gây viêm ruột non. Khi gây nhiễm qua
da, yếu tố này có thể thấm vào trong lòng mạch, gây ban đỏ kèm theo xuất
huyết ra ngoài lòng mạch.


12

13

vụ ngộ độc thức ăn trong cả nước. Trong tổng số 25 vụ ngộ độc tập thể thì có
11 vụ xảy ra trong các trường học, trong dó có đến 9 thủ phạm do nhiễm
S.aureus. Đặc biệt cũng trong năm 2006 đã xảy ra 1 vụ nhiễm S. aureus ở trẻ
em, điều tra cho thấy 2/6 trẻ bị sốc vacxin có nhiễm S. Aureus [4]. Trong năm
2007 nước ta có 2 vụ ngộ độc thực phẩm tập thể và thủ phạm là S. aureus.
Vào tháng 9 năm 2007 ở tỉnh Phú Thọ xảy ra 1 vụ ngộ độc tập thể với gần
100 học sinh tại trường mầm non Vĩnh Lại bị ngộ độc thực phẩm do nhiễm t.
aureus. Vào tháng 12 năm 2007 tại thành phố Hồ Chí Minh xảy ra 2 vụ ngộ
độc thực phẩm tập thể, điều chú ý là 2 vụ ngộ độc này đều xảy ra trong trường
học do nhiễm S. aureus.Trong đó, có 31 em tại trường tiểu học Âu Cơ và 44
em tại trường mầm non Vường Hồng[4]. Trong năm 2009 trên cả nước có
tổng cộng 116 vụ ngộ độc thực phẩm trong đó có 6 vụ do nhiễm S. aureus.
Đáng chú ý vào tháng 7 năm 2009 tại Hải Dương đã xảy ra 1 vụ ngộ độc do
nhiễm S. aureus và số người bị ngộ độc trong vụ này lên tới 258 người. Từ
năm 2010 đến nay cả nước có 67 vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó có 5 vụ là
do S.aureus gây nên[4].
2.2.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về Staphylococcus aureus
Trên thế giới các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm khoảng
70% tổng số ca ngộ độc thực phẩm. Ở các nước châu Á S. aureus là nguyên
nhân hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc. Tại châu Mỹ tiêu biểu là Hoa Kỳ những
vụ ngộ độc thực phẩm chủ yếu đều do S.aureus gây ra, theo thống kê cho thấy
từ 1972-1976 ngộ độc S. aureus chiếm 21,4% trong tổng số các vụ ngộ độc.
Từ năm 1983-1987 con số này thấp hơn với chỉ 5,2%. Theo một thống kê
mới nhất thì đến tháng 9 năm 2009 Hoa Kỳ có 32 vụ ngộ độc thực phẩm có
thủ phạm chính là . aureus chiếm 10,3% trong tổng số các vụ ngộ độc[4].Các
đánh giá gần đây cho thấy tại Hoa Kỳ hàng năm có khoảng 48000 người tử
vong vì S. aureus. Ước tính có khoảng 19000 người mĩ tử vong vì S. aureus




15

viện cho kết quả: năm 2003 mẫu nước tại BVĐK khu vực Bồng Sơn không có
vi khuẩn gây bệnh, năm 2004 mẫu nước ngâm dây máy hút, rửa tay, nước tắm
trẻ em sơ sinh lấy từ sô đựng nước của cả 2 bệnh viện đều bị nhiễm P.
aeruginosa và P.aeruginosa kháng thuốc. Hai loại vi khuẩn gây bệnh trong
mẫu nước chủ yếu là P. aeruginosa (71,4%) và trực khuẩn đường ruột gram
âm (28,6%) [8]. Trong một báo cáo của Lê Bảo Huy và cộng sự, tác nhân gây
bệnh viêm phổi bệnh viện đa phần là vi khuẩn Gram âm chiếm 86,15%, trong
đó P. aeruginosa chiếm 41,15%. Vi khuẩn này có sức đề kháng khá cao đối
với những kháng sinh chuyên dùng để trị và hay dùng ở Việt Nam (nhất là các
khoa ICU: khoa điều trị tích cực): imipenem (66,7%), ticarcillin/a.clavulanic
(45%), ceftazidime (74,1%), cefepime (77,8%), ciprofloxacin (96,3%) [5].
Ngoài ra theo một báo cáo Nguyễn Thị Thu Ba và cộng sự (2014) thì riêng
với vi khuẩn Pseudomonas spp. và P. aeruginosa tỷ lệ gặp ở năm 2014 cao
hơn so với năm 2013, tính chung cho cả hai loại là 7,59% vs 4,96%. Chủ yếu
gặp ở bệnh phẩm đàm từ Khoa Hồi Sức Cấp Cứu và Phòng mổ. Tại BV Đa
khoa Tỉnh Bình Định tỷ lệ gặp chung cho Pseudomonas năm 2012 là 9,6%(
theo báo cáo của Nguyễn Thị Thu Ba và cộng sự).
Riêng đối với VK Pseudomonas, nếu công tác vệ sinh bệnh phòng
không tuân thủ, đặc biệt tải lau nhà không được giặt sạch và phơi khô thì cũng
góp phần vào việc làm lây lan VK Pseudomonas trong bệnh viện . Nội dung
này cần được Khoa KSNK giám sát và nhắc nhở thường xuyên cho đơn vị vệ
sinh bệnh viện.
2.2.2.2. Trên thế giới
Lateef A. (2005), đã khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn trên các
mẫu bệnh phẩm, thực phẩm, nước uống cho thấy: P. aeruginosa đã có mặt
trong các mẫu bệnh phẩm, dược phẩm, đất bị nhiễm dầu, nước (nước sông,

khá tốt khi kết hợp với các kháng sinh như oxfloxacin[24]. Theo báo cáo
N.B. Hirulkar và Bhavna Soni (2011) trong

nghiên cứu phân lập


17

P.aeruginosa trong nước uống thì có tổng số 22 mẫu được phát hiện nhiễm
P.aeruginosa khi được phân lập cho thấy kháng 55% là Ciprofloxacin, tiếp
theo là Gentamicin (51%), Nitrofurantoin (51%), Erythromycin (50%),
Cotrimoxazole (50%), Ofloxacin ( 50%), tetracycline (46%), Norfloxacin
(46%), Cephalexin (46%),

Metronidazole (46%), Ampicillin (41%),

Penicillin (41%) và Amoxycillin (41%)[20].
2.3. Các phƣơng pháp phát hiện Staphylococcus aureus và Pseudomonas
aeruginosa
2.3.1. Phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus
2.3.1.1. Phương pháp vi sinh
Staphylococcus aureus có thể được phát hiện thông qua cá mẫu bệnh
phẩm của bệnh nhân, thông qua phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn,
cấy chuyển, kỹ thuật xác định tính chất hóa sinh quy trình này phải trải qua
nhiều bước: đồng nhất mẫu, tăng sinh chọn lọc, xác định tính chất hóa
sinh[12].
- Ưu điểm của phương pháp: thao tác đơn giản, dễ làm, không phải đầu
tư dụng cụ và thiết bị đắt tiền
- Nhược điểm của phương pháp: độ nhạy không cao, thời gian để phát
hiện là vi khuẩn gây bệnh do S.aureus khá dài, tốn nhiều nhân công, cần có