i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÝ THỊ BÍCH HẠNH

TINH SẠCH CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP
CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG BACILLUS
PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Đỗ Thị Tuyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn


ii

THÁI NGUYÊN - 2015
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dƣới đây là do tôi và nhóm
cộng sự nghiên cứu tại phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ
sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ
tháng 5 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015.


Lý Thị Bích Hạnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn


iv

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
APS

Ammonium presulphate

AFC

Antifungal compound

B. subtilis

Bacillus subtilis

BCF

Biological Control Fungi

CFU

Connoly-Forming unit


Minimal Inhibitory Concentration

FTIR

Fourirer ransform infrared spectroscopy

TLC

Thin Layer Chromatography

Pr

Protein

R. solani

Rhizoctonia solani

SDS

Sodium doecyl sulfate

TB

Trung bình

TEMED

N, N, N’, N’, - Tetramethyl ethylene diamine

3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Khái quát về chất đối kháng sinh trƣởng nấm .......................................... 3
1.2. Vai trò của vi khuẩn B. subtilis trong kiểm soát sinh học ......................... 5
1.2.1. Đại cƣơng về vi khuẩn B. subtilis ........................................................... 5
1.2.2. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính kháng nấm .................................. 6
1.3. Tình hình nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm trên thế giới ... 8
1.4. Tình hình nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm tại Việt Nam .....13
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................ 16
2.1. Vật liệu và hóa chất .................................................................................. 16
2.1.1. Chủng giống .......................................................................................... 16
2.1.2. Hóa chất................................................................................................. 16
2.1.3. Các loại đệm và dung dịch .................................................................... 16
2.1.4. Môi trƣờng ............................................................................................ 17
2.1.5. Thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 18
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 18
2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh và thu nhận dịch ngoại bào .................. 18
2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính ức chế sinh trƣởng nấm..................... 19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn


vi

2.2.3. Thử hoạt tính kháng nấm bằng khoanh giấy lọc ................................... 20
2.2.4. Phƣơng pháp tủa muối amonium sulfate .............................................. 20
2.2.5. Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose ............................... 20
2.2.6. Phƣơng pháp sắc ký lọc gel Biogel P100.............................................. 21
2.2.7. Xác định hàm lƣợng protein tổng số ..................................................... 23

Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc chủng B.subtilis AS trên môi trƣờng PDA ....... 5
Hình 2.1. Quy trình tinh sạch protein kháng nấm từ chủng B. subtilis AS .... 22
Hình 2.2. Đƣờng chuẩn Brardford .................................................................. 23
Hình 3.1. Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS đối
với nấm F. oxysporum sau 5 ngày. ................................................................. 28
Hình 3.2. Hoạt tính ức chế nấm của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS
đối với nấm R. solani sau 3 ngày. ................................................................... 30
Hình 3.3. Sắc ký đồ các phân đoạn qua cột sắc ký trao đổi ion DEAEcellulose ........................................................................................................... 32
Hình 3.4. Điện di đồ các phân đoạn protein tinh sạch qua cột DEAE –
celulose ........................................................................................................... 33
Hình 3.5. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A, D) và R. solani (B, C)
...................................................................................................34_Toc434515732
Hình 3.6. Sắc ký đồ các phân đoạn proteintinh sạch có hoạt tính kháng nấm
sau khi qua cột Biogel P100 ............................................................................ 36
Hình 3.7. Điện di đồ các phân đoạn protein có hoạt tính kháng nấm qua cột
Biogel P100 ..................................................................................................... 36
Hình 3.8. Các phân đoạn protein tinh sạch có hoạt tính kháng nấm qua cột
Biogel P100,. .................................................................................................. 38
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A) ......40
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của proteinase K đến hoạt tính kháng nấm F. oxysporum
(A) và nấm R. solani (B) .................................................................................. 42
Hình 3.11. Khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử F. oxysporum của protein
tinh sạch từ chủng B. subtilis AS. ................................................................... 44
Hình 3.12. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein tinh sạch từ chủng B.
subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm F. oxysporum ........................................ 45
Hình 3.13. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein tinh sạch từ chủng B.
subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm nấm R. solani. ....................................... 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


giới. Trong đó chiếm 83% là bệnh do vi nấm gây ra, chủ yếu là các bệnh nhƣ:
đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sƣơng… đặc biệt bệnh do nấm Fusarium và
Rhizoctonia gây ra chiếm tỉ lệ tƣơng đối lớn.
Hiện nay, các biện pháp hóa học vẫn đƣợc sử dụng rất phổ biến và rộng
rãi với một lƣợng rất lớn vì nó mang lại hiệu quả phòng trừ cao, rẻ tiền. Tuy
nhiên bên cạnh đó, nó cũng gây ra những tác hại rất to lớn đến môi trƣờng và
sức khỏe con ngƣời, tạo ra sự kháng thuốc với nhiều loại bệnh hại. Vì vậy gây
nên nhiều khó khăn trong công tác phòng trừ bệnh.
Để khắc phục những nhƣợc điểm do biện pháp hóa học gây ra nhƣ trên,
hiện nay trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, việc sử dụng các chế phẩm sinh
học thay thế một phần thuốc hóa học để phòng trừ một số bệnh cây trồng do
vi sinh vật gây ra đang là xu hƣớng chủ yếu. Chế phẩm sinh học diệt nấm có
nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng có tác dụng tích cực đối với nông nghiệp, ƣu
việt hơn so với việc dùng thuốc hóa học. Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ
vi khuẩn để diệt nấm gây hại trên cây trồng sẽ mang lại những lợi ích lâu dài
cho ngƣời sản xuất nhƣ: làm tăng năng suất của cây trồng, giảm chi phí đầu
tƣ, làm đất không bị bạc màu, thân thiện với môi trƣờng sinh thái, không ảnh
hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời và vật nuôi, góp phần quan trọng trong
việc phát triển nền nông nghiệp hữu cơ bền vững và hiệu quả.
Vi khuẩn Bacillus theo nhiều tài liệu đã công bố đƣợc biết đến với vai
trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh cây trồng. Chúng có khả năng sinh
tổng hợp nhiều hợp chất kháng nấm khác nhau nhƣ các chất kháng sinh,


2

lipopeptide, bacillomycin, iturin, mycosubtilin và fengycin. Một số chủng
Bacillus subtilis đã đƣợc ứng dụng để kiểm soát bệnh cây trồng do nấm gây ra.
Việc nghiên cứu phòng trừ nấm bệnh cây trồng bằng các chế phẩm sinh
học đã đƣợc hình thành và phát triển ở Việt Nam nhƣng vẫn còn nhiều hạn

những chất có khả năng ức chế sự sinh trƣởng hoặc tiêu diệt sự phát triển của
các loại nấm.Các chất này đã đƣợc ứng dụng để phòng và chữa trị các bệnh
do nấm gây ra, đặc biệt là các loại nấm gây bệnh hại trên cây trồng nhƣ lạc, cà
chua, đậu tƣơng, cây cà phê và nhiều loại cây khác. Các protein và peptide có
hoạt tính kháng nấm đều đƣợc tách chiết phần lớn từ động vật, thực vật, vi
khuẩn và nấm. Năm 1993, Lijima và cộng sự đã xác định đƣợc protein chống
nấm Candida albicans, Shizosaccharomyces pombe có trong hemolymph của
ấu trùng Sarcophaga (2,5 mg protein tinh khiết thu đƣợc từ 10ml hemolymph
với nồng độ ức chế sự tăng trƣởng 50% là 30 pg/ml) [25].
Hoạt tính kháng nấm cũng đƣợc phát hiện ở thực vật nhƣ tính kháng
nấm của heme preoxidase từ cây mây Acoru peroxidase có vai trò trong việc
ức chế các sợi nấm của Phaseolina macrophomina, Fusarium moniliforme và
trichosporium vesiculosum [23]. Một chất ức chế protease cysteine đƣợc công
bố có khả năng kháng nấm từ hạt kê. Chất này ức chế mạnh hoạt động của
nấm T. reesei một loại nấm gỗ, nồng độ tối thiểu để ức chế sự tăng trƣởng của
sợi nấm hay bào tử nảy mầm là 1 µg/ml (250mg/đĩa). Ngoài ra chúng còn ức
chế một số loại nấm gây hại thực vật khác nhƣ: Claviceps, Helminthosprium,
Curvularia, Alternaria và các loài thuộc chi Fusarium [27].
Một protein kháng nấm đƣợc tách chiết từ vi khuẩn Bacillus
amyloliquefaciens MET0908 có khả năng kiểm soát sự sinh trƣởng của nấm
Colletotrichum lagenarium gây bệnh trên dƣa hấu. Protein này còn có thể
hoạt động đƣợc trên vách tế bào C. lagenarium [28].
Đặc biệt hoạt chất kháng nấm còn đƣợc phân lập từ quả thể của nấm
hypsizygus marmoreus là Hypsin một protein chịu nhiệt ức chế sự tăng trƣởng


4

của sợi nấm trong các loài nấm khác nhau bao gồm Mycosphaerella
arachidicola, Physalospora piricola, F. oxyproum, và Botrytis cinerea với giá

lị cho bệnh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Đến năm 1949, khi Henry và các
cộng sự tách đƣợc chủng thuần khiết của B. subtilis thì chúng mới đƣợc dùng
để điều trị bệnh về rối loạn tiêu hóa. Ngày nay, vi khuẩn B. subtilis đã trở nên
phổ biến và đƣợc sử dụng rộng rãi trong y học, thực phẩm… và đặc biệt là
kiểm soát sinh học trong nông nghiệp.
Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn B. subtilis thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillacea
Chi: Bacillus
Loài: B.subtilis

Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc chủng B.subtilis AS
trên môi trƣờng PDA

Vi khuẩn B. subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đƣờng ruột,
chúng đƣợc phân bố hầu hết trong tự nhiên nhƣ: cỏ khô, bụi đất, nƣớc …
phần lớn chúng tồn tại trong đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu CFU/g.
B. subtilis là trực khuẩn hình que, hai đầu tròn, Gram dƣơng, kích
thƣớc từ 0,5- 0,8 µm x 1,8-3µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động
8-12 lông. Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm ở giữa tế bào. Kích thƣớc từ


6

0,8-18µm. Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid,
có khả năng chịu nhiệt, chịu ấm, tia tử ngoại, phóng xạ.
Điều kiện phát triển nuôi cấy là môi trƣờng hiếu khí , nhiệt độ nuôi cấy

nhiều loại hoạt chất có hoạt tính đối kháng vi sinh vật. Loài này thƣờng tổng
hợp các loại peptide kháng sinh nhỏ không phải từ ribosome (

là do nấm gây ra với hàng tỷ euro thiệt hại mỗi năm [9]. Trong đó các loại
bệnh hại cây trồng thì bệnh do nấm F. oxysporum và R. solani gây ra, nấm
bệnh gây chết héo mạch dẫn và bệnh thối thân, thối rễ, lở cổ rễ ở nhiều loại
cây rau quả và cây lƣơng thực lạc, cà chua, khoai tây, đậu tƣơng … [28].
Việc sử dụng ngày càng nhiều các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học
trong nông nghiệp sẽ ảnh hƣởng tiêu cực đến môi trƣờng, dẫn đến mất cân
bằng trong quần thể vi sinh vật có ích, tạo môi trƣờng bất lợi đối với các sinh
vật có ích phát triển, và tạo điều kiện để nấm bệnh, các loại côn trùng có hại
kháng thuốc hơn, đồng thời cũng tiêu diệt các loại thiên địch có ích. Dƣ lƣợng
thuốc diệt nấm, thuốc trừ sâu hóa học còn lại trên sản phẩm nông nghiệp và
trên đất sẽ làm ô nhiễm nguồn nƣớc ngầm, gây ra các tác hại nghiêm trọng
đối với sức khỏe của ngƣời và vật nuôi. Vì vậy một số nƣớc phát triển, thuốc
diệt nấm có nguồn gốc hóa học bị hạn chế hoặc cấm sử dụng [22].
Hiện nay trên thế giới, việc sử dụng các chế phẩm sinh học thay thế
một phần thuốc hóa học để phòng trừ một số bệnh do vi nấm gây ra đang là
hƣớng chủ yếu. các chế phẩm sinh học diệt nấm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối
kháng để diệt nấm gây hại trên cây trồng sẽ mang lại những lợi ích lâu dài cho
ngƣời sản xuất.
Vì vậy mà các nhà khoa học quan tâm đặc biệt tới việc nghiên cứu và
sản xuất các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh, các nghiên cứu đều tập
trung mạnh về hóa sinh, di truyền và bản chất của các hợp chất di vi sinh vật
tạo ra có khả năng hạn chế sự sinh trƣởng và phát triển của các loài vi sinh vật
có hại.
Kumar và cộng sự (2009) đã phân lập đƣợc chủng B.subtilis MTCC
8114 trong một số mẫu đất vƣờn, hoạt tính vòng ức chế nấm khi thử nghiệm
bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm là 14-16mm và 22-14mm bằng phƣơng
pháp khuếch tán vòng trên thạch đối với nấm Microsporum fulvum và





11

ngô, nhƣng có thể thấy chủng B.subtilis D1/2 có tiểm năng rất lớn trong việc
kiểm soát bệnh hại cây trồng và sản xuất chế phẩm kháng nấm [61].
Năm 2012 , Malfnovan và cộng sự khi sử dụng phƣơng pháp sắc ký
lỏng khối phổ đã phát hiện tới 8 loại hợp chất polypeptide mạch vòng có hoạt
tính kháng nấm trong dịch chiết ngoại bào của chủng B. subtilis HC8. Dựa
vào thời gian lƣu và khối lƣợng phân tử, đã xác định đƣợc các hợp chất kháng
nấm này chủ yếu thuộc 3 họ kháng sinh lớn đó là iturin, fengycin và surfactin.
Trong đó thì họ kháng sinh fengycin cho kết qủa tác động mạnh nhất đến việc
ức chế sự phát triển của nấm đối kháng. Chủng B. subtilis HC8 đƣợc xác định
là chủng đầu tiên có khả năng sinh tổng hợp ngoại bào cả 3 họ kháng sinh lớn,
đây là chủng vi khuẩn có tiềm năng rất lớn trong kiểm soát dịch bệnh hại cây
trồng. [42].
Tan và cộng sự (2013) đã phân lập đƣợc vi khuẩn B. subtilis B25 từ đất
vùng rễ chuối, thí nghiệm cho thấy chủng B25 có khả năng đối kháng mạnh
mẽ đối với nấm Fusarium. Ngoài ra chúng còn có khả năng ức chế tốt đối với
các nấm corynespora casiicola, Alternaria solani, Botrytis cinerea … Sau khi
soi dƣới kính hiển vi điện tử cho thấy protein kháng nấm của B. subtilis B25
có khả năng ức chế mạnh đối với nấm dẫn đến sợi nấm sƣng lên, biến dạng,
bất thƣờng [58].
Năm 2013, khi quan sát hình thái và phân tích dữ liệu phân tử, bao gồm
cả trình tự gen 16S rDNA và gyraseA (gyrA) các mẫu vi khuẩn đƣợc lấy từ
bùn Gomsohang và Mohang ở đảo Jeju Hàn Quốc, Ji và cộng sự đã phân lập
đƣợc chủng Bacillus amyloliquefaciens CNU114001 có hoạt tính đối kháng
đáng kể đối với các loại nấm gây bệnh. Bằng sắc ký cột silica gel, sắc ký lớp
mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao, đã xác định đƣợc hoạt chất kháng nấm là
iturin. Các hoạt chất bán tinh khiết hạn chế đáng kể sự phát triển của nấm sợi

soát gỉ sắt (rỉ sắt trên cây đậu tƣơng, Châu Á), mốc sƣơng, mốc lông tơ và
bệnh bạc lá.


13

1.4. Tình hình nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm tại Việt Nam
Ở Việt Nam, các nghiên cứu tập trung nhiều vào việc sản xuất các chế
phẩm phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng dùng làm thuốc bảo vệ thực vật. Hầu
hết các nghiên cứu đã thực hiện tập trung vào sản xuất các sản phẩm sinh học
chứa các chủng nấm đối kháng (chủ yếu là các chủng Trichoderma) hoặc vi
khuẩn đối kháng (chứa B. subtilis). Các chế phẩm thƣơng mại phần lớn chứa
các chủng nấm đối kháng ở dạng phân bón.
Việc ứng dụng các vi sinh vật đối kháng nấm bệnh cây đã đƣợc thực
hiện rất sớm ở Việt Nam và đạt đƣợc những thành tựu to lớn nhƣ sử dụng vi
sinh vật đối kháng nấm nhƣ một sinh vật chức năng trong sản xuất phân bón
hữu cơ vi sinh, các chế phẩm lên men xốp sử dụng nhóm vi nấm
Trichoderma. Có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm
Trichoderma để phòng trừ nấm bệnh cây trồng [8].
Nghiên cứu các biện pháp sinh học phòng chống nấm bệnh cây đã đƣợc
quan tâm và thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu trong nƣớc trong những
năm vừa qua: Viện Công nghệ sinh học và Viện sinh học nhiệt đới (Viện KH
CNVN), Viện bảo vệ thực vật và Viện Thổ nhƣỡng và nông hóa (Bộ NN
PTNT), Đại học Nông lâm Tp HCM, Đại học Cần thơ.
Các công bố cho thấy, các nhóm vi sinh vật nhƣ Trichoderma [5],
Bacillus [6], Pseudomonas [7], và Serratia [4] đã đƣợc phân lập, tuyển chọn
và đƣợc đánh giá là những tác nhân tiềm tàng cho phát triển các chế phẩm
sinh học để phòng chống nấm bệnh cây.
Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học cùng Bộ
NN&PTNT đã nghên cứu và tạo ra chế phẩm BCF từ 3 chủng vi sinh vật

Đặc biệt trong những năm qua, chế phẩm antiforhis có tác dụng phòng
chống bệnh thối rễ, lở cổ rễ cây trồng do nấm F. oxysporum và R. solani có
nguồn gốc từ trong đất đã đƣợc phát triển trên cơ sở sử dụng hỗn hợp các
chủng P. sluorescens, P. cholororaphis và chủng B. pumilus tại phòng Vi sinh


15

vật đất, Viện công nghệ sinh học. Chế phẩm đã đƣợc khảo nghiệm trên diện
hẹp trong trong điều kiện in vitro tại Viện bảo vệ thực vật (Bộ NN  PTNT);
kết quả cho thấy chế phẩm antiforhis cho hiệu quả giảm bệnh gần bằng hoặc
tƣơng đƣơng các hóa chất diệt nấm, tùy theo từng chất. Kết quả khảo nghiệm
trên đồng ruộng cũng cho thấy, việc tƣới chế phẩm antiforhis có tác dụng làm
giảm tỷ lệ cây con và cây trồng bị chết do bệnh thối rễ trên cây ăn quả các
loại, cây cải bắp, cây cà chua, cây ớt ngọt [6].
Trong thời gian qua, tại Phòng Vi sinh vật đất (Viện CNSH), một số
chủng vi khuẩn thuộc nhóm Burkholderia và Chryseomonas đã đƣợc phân lập
từ các mẫu vật khác nhau ở Việt Nam. Thử khả năng đối kháng nấm F.
oxysporum và R. solani của các chủng này đã đƣợc tiến hành. Kết quả cho
thấy, các chủng này có khả năng sinh tổng hợp các chất ngoại bào với hoạt
tính ức chế sinh trƣởng hay nảy mầm của bào tử nấm rất mạnh.
Nhƣ vậy, trên thị trƣờng Việt Nam, các loại sản phẩm sinh học phòng
trừ bệnh nấm R. solani và F. oxysporum chủ yếu là các sản phẩm có chứa
nấm đối kháng. Các nghiên cứu phòng trừ nấm bệnh cây bằng các tác nhân
sinh học đã đƣợc hình thành và phát triển ở Việt Nam tuy nhiên vẫn còn nhiều
hạn chế.


16


Dung dịch Bradford working

425 ml H20, 15 ml 95% ethanol, 30 ml 88%
phosphoric acid, 30 ml dung dịch bradford
gốc.

Đệm điện di protein

20 mM Tris-HCl, 192 mM glycine; 0,1%
SDS; pH 8,8

Dung dịch A

Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8

Dung dịch B

Đệm 0,5 M Tris-HCl; pH 6,8

Dung dịch C

30%acrylamide; 0,8% bis-acrylamide

Dung dịch D

10% SDS

Dung dịch APS

10% ammonium persulfate