Header Page 1 of 145.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRẦN THỊ THÚY HẰNG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NHẬN DIỆN
VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
PHENOL

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGs. Ts. NGUYỄN HỮU HIỆP

NĂM 2013

Footer Page 1 of 145.


Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013

Trường ĐHCT

Header Page 2 of 145.

TÓM TẮT
Trong số những hợp chất thơm, phenol được biết đến như một thành
phần phổ biến trong đất và chất thải bị ô nhiễm từ nhiều ngành công nghiệp:

Header Page 3 of 145.

ABSTRACT

Among aromatic compounds, phenol is known as a common constituent
of soil and wastes contaminated from many industries including oil refineries,
pharmaceutical, petroleum, textiles and coal refining etc. The toxicity of
phenol causes negative effects to human, environment, fauna and aquatic
organisms. Isolation, selection and identification bacterial strains capable of
degrading phenol to form the basis of an environmental cleaning solution by
biological methods. The study was carried out from 12/2013 to 08/2013. In
this study, the bacterial strains were isolated in MSB medium (Minerral basal
salts) with phenol as sole source of carbon. Thirty-seven bacterial strains
capaple of degrading phenol were isolated from soil and waste water in Tra
Vinh, Vinh Long, Can Tho and Soc Trang provinces. Among them, 35 strains
were rod shape, 2 trains were globular shape; 34/37 strains were motile, 3/37
strains were not motile; 29/37 trains were gram negative, 8/37 trains were
gram positive. P3, P10 and P36 could degrade phenol the best. After seven
days in the medium containing 0,5 g/L of phenol, P3, P10 and P36 could
degrade phenol at 39,8%, 95,2% and 83,2%, respectively. The results of 16S
rRNA sequence analysis showed that P3 strain was Peanibacillus sp. and P10,
P36 were Rhodococcus sp.
Key words: Biodegradation, Paenibacillus sp., phenol-degrading
bacteria, Rhodococcus sp., 16s rRNA.

Footer Page 3 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iv


Chương 3: Phương tiện và phương pháp nghiên cứu................................. 13
3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................ 13
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................... 1313
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ........................................................... 1313
3.1.3 Hóa chất ................................................................................................ 14
3.1.4 Vật liệu .................................................................................................. 16
3.2 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 16
3.2.1 Chuẩn bị thí nghiệm .............................................................................. 16
Footer Page 4 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

vi

Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH


Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013

Trường ĐHCT

Header Page 5 of 145.

3.2.2 Phân lập vi khuẩn từ đất và nước thải nhiễm phenol .............................. 16
3.2.3 Khảo sát một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập ................. 16
3.2.4 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn đã phân lập có khả năng phân hủy
phenol ..................................................................................................... 19
3.2.5 Kiểm tra khả năng tổng hợp enzyme của các dòng vi khuẩn đã tuyển
chọn. ....................................................................................................... 20
3.2.6 Khảo sát sự sinh trưởng của vi khuẩn đã tuyển chọn ở các nồng độ
phenol khác nhau .................................................................................... 21

Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013

Trường ĐHCT

Header Page 6 of 145.

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Giá trị LD50 đối với một số loài động vật ở cạn ................................. 6

Bảng 2.2: Giá trị LD50 đối với một số loài động vật thủy sinh ...........................6
Bảng 2.3: Vi khuẩn phân hủy phenol ................................................................7
Bảng 3.1: Nồng độ phenol ở các nghiệm thức trong thí nghiệm...................... 21
Bảng 4.1: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn đã phân lập...................................... 25
Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập sau 72
giờ........................................................................................................... 27
Bảng 4.3: Một số đặc tính của các dòng vi khuẩn phân lập ............................. 29
Bảng 4.4: Kích thước vùng sáng do vi khuẩn tạo ra khi tổng hợp protease ..... 31
Bảng 4.5: Mật số dòng vi khuẩn P3 ở các nồng độ phenol khác nhau ............. 35
Bảng 4.6: Mật số dòng vi khuẩn P10 ở các nồng độ phenol khác nhau ........... 36
Bảng 4.7: Mật số dòng vi khuẩn P36 ở các nồng độ phenol khác nhau ........... 37

Footer Page 6 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

viii

Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH



Hình 4.12: Đường chuẩn phenol ..................................................................... 38
Hình 4.13: Sự sinh trưởng và phân hủy phenol của dòng P3 ở nồng độ 0,5
g/ L ......................................................................................................... 39
Hình 4.14: Sự sinh trưởng và phân hủy phenol của dòng P10 ở nồng độ 0,5
g/ L ......................................................................................................... 39
Hình 4.15: Sự sinh trưởng và phân hủy phenol của dòng P36 ở nồng độ 0,5
g/ L ......................................................................................................... 40
Footer Page 7 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

ix

Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH


Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013

Trường ĐHCT

Header Page 8 of 145.

Hình 4.16: Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng vi khuẩn trên gel
agarose 1% .............................................................................................. 40
Hình 4.17: Kết quả trình tự gen 16S rRNA của dòng P3................................. 41
Hình 4.18: Kết quả trình tự gen 16S rRNA của dòng P10 ............................... 42
Hình 4.19: Kết quả trình tự gen 16S rRNA của dòng P36 ............................... 43

Footer Page 8 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học



Coefficient of Variantion

ĐKTƯ

Đa khoa Trung ương

EPA

Enviromental Protection Agency

g

Gam

KCN

Khu công nghiệp

kg

Kilogram

L

Litre

LB

Luria Bertani


Phenol

PBHC

Phân bón hóa chất

PCR

Polymerase chain reaction

ppm

Parts per million

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TNHH

Trách nhiệm hữu hạn

VK

Vi khuẩn

là một trong những mối đe dọa chính, là thử thách mà nhân loại phải đối mặt
hiện nay.
Nguồn:http://www.aquapure.com.vn/index.php?option=com_knowledge&view=detail&id=9&Itemid
=4&lang=vi

Tác nhân gây ô nhiễm môi trường phổ biến bao gồm các hợp chất hữu
cơ: các chất dệt nhuộm, chất tẩy rửa, hóa chất, thuốc sát trùng, thuốc trừ sâu,
thuốc diệt cỏ, các hợp chất béo, aromatic,…(Bahnemann, 2004; Vidal, 1998);
hợp chất vô cơ như kim loại nặng, thủy ngân, bạc, niken, chì, các loại khí độc
hại,…và các sinh vật gây bệnh như vi khuẩn, nấm và virus (Vinu and Madras,
2010). Trong đó, các chất gây ô nhiễm mạnh, độc tính cao phần lớn đều có
chứa nhân vòng thơm. Một trong những sản phẩm trung gian của sự chuyển
hóa các chất nhân vòng thơm này thường là phenol. Từ đó cho thấy sự hiện
diện của phenol trong môi trường là một con số không nhỏ.
Phenol là một chất hữu cơ khó phân hủy, gây hại đến sức khỏe con
người, động vật và ảnh hưởng đến cân bằng sinh thái. Theo tiêu chuẩn Việt
Nam TCVN 5945-2005, tiêu chuẩn thải cho phép của phenol là rất nhỏ, chỉ từ
0,5 – 1 mg/L. Trong khi đó, hàm lượng phenol trong nước thải của nhiều khu
công nghiệp, khu chế xuất lại vượt mức cho phép. Theo Annadurai et al.
(2000) nồng độ phenol trong nước thải ở mức 10 - 300 mg/L. Do đó, việc xử
lý chất gây ô nhiễm môi trường như phenol là thật sự cần thiết.
Trong khoảng hơn một thập kỷ qua, một số phương pháp xử lý phenol đã
được tiến hành nghiên cứu, chẳng hạn như phân hủy nhiệt, oxy hóa học, oxy
hóa quang điện, oxy hóa quang hóa. Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi
chi phí lớn và vẫn có thể gây ra ô nhiễm thứ cấp. Qua thử nghiệm thực tế, xử
lý bằng phương pháp sinh học đã và đang khẳng định tính ưu việt của nó. Đó

Footer Page 10 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học