BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
LƯU THỊ THÚY

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ SỬ DỤNG VI
KHUẨN LACTIC SINH BACTERIOCIN TRONG
BẢO QUẢN CÁ GIÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch
Mã số: 60 54 10
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN VĂN DUY
TS. VŨ NGỌC BỘI Nha Trang - 2012
- i -
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng
được ai công bố trong bất kỳ công trình nào.

Tác giả luận văn
Ngọc Bội – Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nha Trang đã tận
tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm đề tài, hai thầy đã cung cấp và truyền đạt
cho tôi những kiến thức quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Cảm ơn sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo phòng thí nghiệm Viện Công nghệ
Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang, gia đình và bạn bè luôn luôn
chia sẽ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu. - iii -

2.1.1 Nước dưa 31
2.1.2 Chủng vi khuẩn chỉ thị 31
- iv -
2.1.3 Cá giò 32
2.1.4 Thiết bị chuyên dụng 32
2.1.5 Hóa chất, môi trường 33
2.2 Phương pháp nghiên cứu 33
2.2.1 Phân lập vi khuẩn lactic 33
2.2.2 Xác định đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn lactic 33
2.2.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 34
2.2.4 Xác định cơ chế kháng khuẩn của chủng phân lập 34
2.2.5 Xác định mức độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic 35
2.2.6 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp của vi khuẩn lactic 35
2.2.7 Xác định phổ ức chế của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 36
2.2.8 Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic trên cá Giò nguyên liệu 36
2.2.9 Xác định tổng vi khuẩn hiếu khí 37
2.2.10 Thí nghiệm kiểm tra khả năng kháng Salmonella, Vibrio của vi khuẩn
lactic trong quá trình bảo quản 37
2.2.11 Thí nghiệm bảo quản cá Giò bằng vi khuẩn lactic 37
2.2.12 Đánh giá chất lượng của cá 38
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40
3.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ nước dưa muối lên men truyền thống 40
3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 41
3.3 Phổ ức chế của 5 chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn 43
3.4 Xử lý dịch chiết tế bào với enzym proteinase K và α-Chymotrypsin 49
3.5 Cơ chế kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô của chủng vi khuẩn lactic T13 50
3.6 Đặc điểm sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng T13 trên môi trường MRS 51
3.7 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 53
3.7.1 Ảnh hưởng cuả nguồn cacbon đến sinh trưởng phát triển của vi khuẩn
lactic T13 53


Stt Ký hiệu

Nghĩa

1

CFU
Colony forming unit
(Đơn vị hình thành khuẩn lạc)
2 LAB

Lactic acid bacteria
(Vi khuẩn lactic)
3 MRS de Man, Rogosa and Shatpe
(Môi trường nuôi cấy Lactobacillus)
4 PCA Plate Count Agar
(Môi trường nuôi cấy vi khuẩn tổng số)

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định phổ ức chế của vi khuẩn lactic đối với
một số vi khuẩn gây bệnh 36
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian bảo quản cá giò 38
Hình 3.1 Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic T13 trên môi trường thạch MRS 40
Hình 3.2 Tế bào của chủng vi khuẩn lactic T13 sau khi nhuộm Gram được quan
sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X-100 40
Hình 3.3 Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nước dưa thể hiện tính kháng với
chủng chỉ thị Salmonella Sal 1 trên môi trường XL 42
Hình 3.4 Hình ảnh vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic với chủng
chỉ thị Vibrio C1 (A) và Bacillus B1.1 (B) 42
Hình 3.5 (A) Vòng kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn lactic với chủng
Salmonella Sal1 và Bacillus (B1.1, B2.3) 46
Hình 3.5 (B) Vòng kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn lactic với chủng E. Coli
(H10b, L2.1, TN3, TN4.1, TN4.2, TN5.2 ) 47
Hình 3.5 (C) Vòng kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn lactic với chủng chỉ thị
E. coli GA, Vibrio (C1, V3.3, CR6, CR7), S. aureus 48
Hình 3.6 Hình ảnh vòng kháng khuẩn của dịch bacteriocin từ chủng T13 khi xử
lý với proteinase K (A) và với α-chymotrypsin (B) 49
Hình 3.7 Ảnh hưởng của dịch bacteriocin thô của vi khuẩn lactic T13 lên sự sinh
trưởng của Bacillus B1.1 50
Hình 3.8 Mối quan hệ giữa sự sinh trưởng tính theo mật độ quang và khả năng
sinh bacteriocin tính theo đường kính vòng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn
lactic T13 nuôi trên môi trường MRS, ở pH 6,8 và nhiệt độ 37
O
C 52
- ix -
Hình 3.9 Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T13 đối với Bacillus B1.1 trên
môi trường thạch mềm TSA bổ sung xanh metylen ở nhiệt độ 37
0
C. 53


LỜI MỞ ĐẦU

Mục tiêu và tính cấp thiết của đề tài
Nguyên liệu thủy sản nói chung và cá giò nguyên liệu nói riêng là loại nguyên
liệu dễ bị hư hỏng nếu không được bảo quản một cách hợp lý. Hiện các loại nguyên
liệu thủy sản chủ yếu được bảo quản theo phương pháp ướp đá nhưng để bảo quản
trong thời gian dài thì cần phải có đủ lượng đá để giữ nhiệt độ trong lòng khối nguyên
liệu ≤4
0
C. Thêm vào đó khi bảo quản nguyên liệu thủy sản theo phương pháp ướp đá
thường phải có dụng cụ chứa đựng lớn. Nhưng thực tế cho thấy việc bảo quản nguyên
liệu thủy sản sau đánh bắt và thu hoạch của người dân còn nhiều hạn chế như thiếu
lượng đá, thiếu dụng cụ chứa đựng, điều kiện vệ sinh nơi bảo quản còn hạn chế… Vì
thế chất lượng nguyên liệu thủy sản bảo quản của người dân thường rất hạn chế. Để
giữ nguyên liệu thủy sản lâu dài người dân thường lạm dụng các loại hóa chất độc hại
như hàn the, urê, trong bảo quản nguyên liệu thủy sản gây nên tình trạnh mất an toàn
thực phẩm. Do đó hiện nay vấn đề “ an toàn vệ sinh thực phẩm” đang là vấn đề được
toàn xã hội quan tâm. Vì vậy việc nghiên cứu, tìm kiếm phương pháp bảo quản nguyên
liệu an toàn với người sử dụng là yêu cầu rất cấp thiết.
Nhiều nhà khoa học đang quan tâm nghiên cứu thay thế những chất bảo quản hóa
học bằng các phương pháp sinh học không gây mất an toàn cho người tiêu dùng tiêu
dùng thực phẩm. Một trong các hướng là nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic sinh
bacteriocin. Bacteriocin là một loại protein có trọng lượng phân tử nhỏ do vi khuẩn
sinh ra để chống lại các vi khuẩn khác có trong môi trường sống của chúng. Trong số
này, vi khuẩn lactic được công nhận là an toàn để sử dụng trong quá trình lên men
thực phẩm truyền thống
[18]
. Trong quá trình sống ngoài việc sinh ra bacteriocin, vi
khuẩn này còn sinh ra acid lactic và acid lactic cũng là tác nhân ức chế sinh trưởng của

xuất cho các doanh nghiệp chế biến thủy sản và đảm bảo tính an toàn cho người tiêu dùng.
Mục đích của đề tài
Phân lập và tuyển chọn những chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước
dưa muối nhằm thử nghiệm ứng dụng vào bảo quản cá giò tươi nguyên liệu.
Nội dung nghiên cứu của đề tài
1. Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin.
2. Xác định phổ ức chế vi khuẩn gây bệnh thực phẩm của vi khuẩn lactic.
3. Xử lý dịch chiết tế bào với enzyme proteinaza K và α-Chymotrypsin.
4. Cơ chế kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô của chủng vi khuẩn lactic.
5. X ác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic trên môi trường MRS.
6. Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic sinh
bacteriocin.
- 3 -

7. X ác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic trên da cá giò nguyên liệu.
8. Đánh giá khả năng sử dụng vi khuẩn lactic trong bảo quản nguyên liệu cá giò tươi.
khuẩn gần gũi. Một vài chủng vi khuẩn lactic còn có thể tổng hợp những peptide
kháng khuẩn khác. Những chất kháng sinh có bản chất protein này đang được ứng
dụng để nâng cao chất lượng bảo quản và an toàn vệ sinh thực phẩm [12,17].
1.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic [5]
Về mặt hình thái vi khuẩn lactic có rất nhiều điểm khác nhau nhưng nhìn chung
về mặt sinh lý chúng tương đối đồng nhất, gồm một số đặc điểm chung như sau:
- Vi khuẩn Gram dương, bất động và không sinh bào tử.
- Khả năng tổng hợp nhiều hợp chất của vi khuẩn này rất yếu.
- Là loại vi khuẩn kị khí tùy nghi, có khả năng lên men kị khí cũng như hiếu khí.
- Có khả năng chống chịu tốt trong môi trường acid.
- Thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydrocacbon và tiết ra lactic acid; chúng là
nhóm lên men bắt buộc, không chứa cytochrome, catalase và men.
- Vi khuẩn lactic có thể sống từ kị khí tới vi hiếu khí. Vi khuẩn lactic có nhu cầu
về chất sinh trưởng rất phức tạp. Không một đại diện nào của nhóm này có thể phát
triển trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose. Đa số chúng cần hàng
loạt các vitamin (lactoflavin, tiamin, pantotenic acid, nicotinic acid, folic acid, biotin)
và các amino acid …
- 5 -

- Vi khuẩn lactic lên men được mono và disaccharide. Các vi khuẩn lactic không
lên men được tinh bột và các polysaccharide khác. Ngoại trừ loài L.delbrueckii là đồng
hóa được tinh bột. Một số khác chủ yếu là các vi khuẩn lên men lactic dị hình sử dụng
được pentose và citric acid. Một số vi khuẩn lactic có hoạt tính protease: thủy phân
được protein của sữa thành peptide và amino acid. Hoạt tính này ở các loài là khác
nhau, thường trực khuẩn là cao nhất.
- Vi khuẩn lactic có khả năng sinh ra chất kháng sinh để ức chế các vi khuẩn gây bệnh.
1.1.2 Phân loại
Dựa vào khả năng lên men lactic từ các nguyên liệu chứa đường, người ta có thể
chia thành hai nhóm vi khuẩn lactic: vi khuẩn lactic dị hình và vi khuẩn lactic đồng hình.
- Vi khuẩn lactic dị hình

0
C, có khả năng chịu được nồng độ muối 4%. Khi lên men đường như glucose,
maltose, lactose, xylose, arabinose, saccharoe, monnitol, salicin, chúng tạo ra lactic
- 6 -

acid, acetic acid CO
2
, và diacetyl. Chúng không khả năng lên men được raffinose,
insulin, glycerol và sorbitol.
Streptococcus falcalis thường sống thành chuỗi tế bào hình cầu, nhiệt độ sinh
trưởng ở 10-45
0
C. Chúng có khả năng chịu được nồng độ muối 5% và có khả năng lên
men đường glucose, maltose, trehalose và silicin.
- Vi khuẩn lactic đồng hình
Vi khuẩn lactic đồng hình là nhũng vi khuẩn trong tế bào của chúng có chứa
enzym aldolase và enzym triosophotphatizomerase. Khi lên men các loại đường chúng
sinh ra chủ yếu là lactic acid.
Một số vi khuẩn lactic điển hình:
Lactobacillus axitophilus là trực khuẩn, có kích thước rộng 0,6-0,9µm, dài 1,5-
6,0 µm. Trong tự nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, đôi khi chúng tạo thành những chuỗi
ngắn. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+) và có khả năng chuyển động. chúng có
khả năng lên men một số loại đường như glucose, maltose, galactose, lactose,
mannose, saccharose để tạo ra lactic acid. Chúng hoàn toàn không có khả năng lên
men xylose, glycerol, mannitol, sorbitol…
Lactobacillus bulgaricus là loài thuộc trực khuẩn có kích thước rất dài liên kết
với nhau tạo thành chuỗi. Chúng không có khả năng di chuyển. Chúng có khả năng lên
men các loại đường như glucose, galactose, lactose. Nhưng không có khả năng lên
men xylose, dextrin, mannitol, inulin…
Lactobacillus casein là trực khuẩn nhỏ có kích thước ngắn, chúng có thể tạo

0
C, chịu được 65-75
0
C.
Vi khuẩn này được sử dụng nhiều trong sản xuất sữa chua, phomai.
Lactobacillus plantarum là trực khuẩn Gram (+), có kích thước tế bào 0,7-1,0
µm, 3,0-8,0 µm. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 30
0
C. Có khả năng chịu được nồng độ
muối 5,5%. Vi khuẩn này được dùng nhiều trong chế biến sữa.
1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng và các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi
khuẩn lactic [5]
Một số lớn vi khuẩn lactic không thể sử dụng được các hợp chất hữu cơ phức tạp
có chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển của mình chúng phải sử dụng nguồn
nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng
hợp các chất hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ. Vì vậy để sinh trưởng và phát triển bình
thường ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các acid amin, vi khuẩn lactic còn cần những
hợp chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ như các sản phẩm thủy phân protein từ thịt, casein,
pepton…
Nguồn cacbon tốt nhất là các loại đường mono và disaccharide, còn các
polysaccharide thì hầu như không thể lên men. Tốc độ lên men các loại đường
monosaccharide, disaccharide và oligosaccharide là khác nhau. Nếu khi nhân giống
người ta dùng một loại đường thông thường thì vi khuẩn có thể thích nghi với loại
đường đó và về sau chúng phát triển có hiệu quả trên môi trường chứa loại đường này
mà không làm ảnh hưởng đến khả năng lên men đối với các nguồn cacbon khác.
Các vi khuẩn lactic rất cần vitamin cho sự phát triển. Thường phải bổ sung vào
môi trường các chất chứa vitamin như khoai tây, cà rốt, dịch tự phân nấm men và
- 8 -

nhiều chất khác. Vitamin đóng vai trò là coenzym trong quá trình trao đổi chất của tế

0
C, pH thích hợp từ 6,3÷6,5. Lactobacillus casei

Streptococcus cremoris

Lactobacillus salivarius

Hình 1.1 Hình ảnh tế bào của một số chủng vi khuẩn lactic [35, 36, 37]
1.1.4 Ứng dụng
Từ xa xưa, vi khuẩn lactic được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực. Chúng được
dùng để sản xuất acid lactic theo cách lên men đồng hình. Nguyên liệu dùng để sản
xuất lactic là rỉ mật, đường, tinh bột đã được đường hóa. Nồng độ đường sử dụng cho
quá trình lên men lactic từ 8÷20%. Nếu nguyên liệu là rỉ mật phải làm trong để loại bỏ
- 9 -

các hợp chất chứa nitơ. Quá trình lên men lactic xảy ra rất tốt trong môi trường acid,
tuy nhiên vi khuẩn lactic không có khả năng chịu được nồng độ acid quá cao. Khi
nồng độ acid quá cao sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic vì vậy cần
phải điều chỉnh độ pH của môi trường từ 6,3÷6,5. Trong thực tế sản xuất người ta
thường xuyên bổ sung cacbonatcanxi để giữ pH của môi trường không thay đổi. Acid
lactic thu được sẽ ở dạng muối canxilactat. Trong quá trình lên men lactic có nhiều vi
khuẩn tham gia vì vậy sản phẩm thu được ngoài acid lactic còn có CO
2
và một số sản
phẩm phụ khác.
Ứng dụng vi khuẩn lactic trong công nghệ thực phẩm [2]
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên. Chúng tham gia vào

phẩm có hương vị đặc trưng.
Ứng dụng để ủ thức ăn gia súc
Một ứng dụng khác mà từ lâu người ta đã biết là sử dụng quá trình lên men lactic
để ủ chua thức ăn gia súc. Phương pháp ủ chua thức ăn gia súc đặc biệt cần thiết đối
với các trại chăn nuôi gia súc. Nguyên liệu dùng làm thức ăn cho gia súc nếu đem phơi
khô sẽ làm giảm 50% giá trị của chúng. Nhưng nếu ta đem ủ chua thì chỉ giảm khoảng
10% giá trị. Đặc biệt bằng phương pháp ủ chua sẽ tăng nhiều chỉ số dinh dưỡng khác
của thức ăn.
Ngoài ra để sản xuất phomat người ta dùng enzym đông kết tủa casein trong sữa,
sau đó tiếp tục cho lên men lactic với nồng độ muối loãng. Tùy loại phomat mà trong
quá trình ủ chín người ta sử dụng các loài vi sinh vật khác nhau. Các vi sinh vật
thường được sử dụng để làm chín phomat là vi khuẩn propionic, nấm mốc…
Ứng dụng trong y học
Ứng dụng vi khuẩn lactic để chữa bệnh đường ruột
Thực ra việc ứng dụng này đã được biết đến từ lâu Việt Nam. Khi người ta bị tiêu
chảy, thầy thuốc khuyên hàng ngày uống 1-2 chén nước dưa chua. Phương pháp này tỏ
ra rất hiệu nghiệm trong điều kiện ngành dược chưa phát triển. Dựa vào hiệu quả sử
dụng của vi khuẩn lactic trong việc chữa trị tiêu chảy, Pháp đã sản xuất và đưa ra thị
trường từ hàng chục năm nay một sản phẩm mang tên là Biolactyl. Sản phẩm này
chuyên trị tiêu chảy bằng nhiều vi khuẩn lactic.
Hiện nay vi khuẩn lactic còn được quan tâm nhiều do chúng có khả năng sinh
bacteriocin [12], một loại protein có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo
thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Nhiều loại bacteriocin còn có
khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào lớp peptidoglycan để làm suy yếu
- 11 -

thành tế bào. Vì vậy, bacteriocin được dùng nhiều trong bảo quản thực phẩm, sữa tươi,
nước giải khát, xử lý môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi và đặc biệt là bảo quản
nguyên liệu thủy sản.
1.2 Bacteriocin

- 12 -

thực phẩm, kéo dài hạn sử dụng, hoặc được xem như là chất phụ gia có tác dụng phụ
trợ hoặc bảo vệ. Bacteriocin cố định cũng được ứng dụng trong bao bì thực phẩm có
hoạt tính sinh học [18].
Nisin một bacteriocin đầu tiên được thương mại hóa và đang trở thành chất phụ
gia trong công nghiệp thực phẩm tại hơn 50 nước trên toàn thế giới [22]. Đây là một
polypeptide thuộc lớp Lantibiotic, trong mạch có 34 acid amin được tạo ra nhờ quá
trình lên men của Lactococcus lactis [23]. Tuy nhiên, độ bền của nisin chỉ thể hiện tốt
trong điều kiện acid. Khi tăng pH từ 3 tới 7, nisin trở nên không bền với ảnh hưởng
của nhiệt độ, giảm một nửa hoạt tính khi xử l í ở nhiệt độ 121
o
C trong 15 phút.
Trong những năm gần đây việc ứng dụng bacteriocin như một công nghệ bảo
quản mới và được chú ý lớn. Một số bacteriocin thể hiện tính chất phụ gia hay có hiệu
quả khi được sử dụng kết hợp với tác nhân kháng khuẩn khác bao gồm chất bảo quản
hóa học, hợp chất phenol cũng như protein kháng khuẩn khác. Đây có thể cũng là
phương pháp tiếp cận hấp dẫn để tránh phát triển của các chủng đối kháng. Để tăng
hiệu quả bảo quản, người ta có thể sử dụng kết hợp của bacteriocin với các phương
pháp xử lý vật lý như xử lý áp suất cao hoặc xung điện từ trường. Hiệu quả của
bacteriocin thường bị ảnh hưởng bởi nhân tố môi trường như pH, nhiệt độ, cấu trúc và
thành phần thực phẩm cũng như hệ vi sinh vật thực phẩm. Thực phẩm được xem như
hệ sinh thái phức tạp trong đó vi khuẩn có nhiều mối tương tác bao gồm sự cân bằng
giữa vi khuẩn có lợi và vi khuẩn có hại. Sự phát triển gần đây trong lĩnh vực vi sinh
vật phân tử giúp chúng ta hiểu rõ hơn về hiệu quả của bacteriocin trong thực phẩm.
Đồng thời gần đây những nghiên cứu về sinh học phân tử của bộ gen vi khuẩn có thể
tiết lộ các các nguồn sinh bacteriocin mới [18].
1.2.1 Phân loại bacteriocin
Bacteriocin được phân loại theo nhiều cách, trong đó chủ yếu dựa vào chủng sản
xuất và cơ chế kháng khuẩn. Lớp I lantibiotic là những peptide hoạt động theo cơ chế


- Chuỗi ngắn
kích thước nhỏ
dưới 6 kDa,
thường có các
axit amin lạ

- Bền nhiệt

- Lưỡng cực

- Điện tích
dương

- Chuỗi dài

- Bền nhiệt

- Điện tích dương

- Chuỗi dài (>15
kDa)

- Kém bền nhiệt

- Có cấu trúc
domain

- Dạng vòng