ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------

TRẦN ĐĂNG TUẤN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH OXALAT TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ
DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------

TRẦN ĐĂNG TUẤN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH OXALAT TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ
DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN THỊ ÁNH HƢỜNG

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................2
1.1.

Giới thiệu chung về các chất phụ gia thực phẩm ........................................2

1.1.1. Giới thiệu chung về phụ gia thực phẩm..........................................................2
1.1.2. Phân loại phụ gia thực phẩm ..........................................................................2
1.1.2.1. Phân loại theo nguồn gốc...............................................................................2
1.1.2.2. Phân loại theo tác dụng..................................................................................2
1.1.3. Lợi ích và tác hại của phụ gia thực phẩm.......................................................2
1.2. Thông tin chung về oxalate, tartrate và citrate ...............................................3 1.3.
Ứng dụng và tác hại của các oxalate, tartrate và citrate ................................4 1.3.1.
Oxalate ..............................................................................................................4 1.3.2.
Tartrate..............................................................................................................5 1.3.3.
Citrate................................................................................................................5 1.4. Vấn
đề sử dụng oxalate, tartrate và citrate trên thế giới và ở Việt Nam ......6 1.4.1. Vấn đề
sử dụng oxalate, tartrate và citrate trên thế giới ................................6 1.4.2. Vấn đề sử
dụng oxalate ở Việt Nam ................................................................6 1.5. Các phƣơng
pháp xác định oxalate, tartrate và citrate ..................................7 1.5.1. Phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ..........................................7 1.5.2. Phương pháp
Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) ...........................9 1.5.3. Phương pháp sắc
ký ion ...................................................................................9 1.5.4. Các phương pháp
điện di mao quản..............................................................10 1.6. Phƣơng pháp điện di
mao quản ......................................................................12 1.6.1. Mao
quản.........................................................................................................13 1.6.2. Dung dịch
đệm pH và pha động trong phương pháp điện di mao quản.........14 1.6.3. Nguồn điện thế
cao..........................................................................................15 1.6.4. Kỹ thuật bơm mẫu
trong phương pháp điện di mao quản ..............................15



3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của hệ đệm ..................................................................25
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu ........28
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thế tách.................................................................30
3.1.4. Khảo sát các chất ảnh hưởng .......................................................................31
3.2.

Đánh giá phƣơng pháp phân tích ...............................................................32

3.2.1. Lập đường chuẩn ..........................................................................................32
3.2.2. Giới hạn LOD, LOQ của phương pháp........................................................36
3.2.3. Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) độ đúng (độ thu hồi) ...................................37
3.3.

Phân tích mẫu thực tế ..................................................................................41


3.3.1. Phân tích mẫu bia .........................................................................................41
3.3.2. Phân tích mẫu mì gói ....................................................................................45
3.3.3. Phân tích mẫu trà túi lọc lipton (trà trái cây, vị dâu) ..................................46
3.3.4. Phân tích mẫu nước trà khô vỉa hè ..............................................................46
3.3.5. Phân tích đối chứng phƣơng pháp CE-C4D với phƣơng pháp HPLC ....47
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................50


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thông tin chung về 3 hợp chất oxalic, tartaric và citric ............................3
Bảng 1.2. Các chất thường dùng làm pha động trong CE và giá trị pK của chúng .15
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến diện tích pic (Spic) và thời gian di
chuyển (tdc) của oxalate, tartrate và citrate.........................................................28
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thế điện di đến diện tích pic (Spic) và thời

Hình 1.1 Sơ đồ phân tích hệ điện di mao quản .........................................................12
Hình 1.2 Mặt cắt ngang của mao quản ......................................................................13
Hình 1.3 Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản ....................................................14
Hình 1.4 Ảnh hƣởng của dòng EOF đến tốc độ của các ion trong quá trình điện di 14
Hình 1.5 Các kĩ thuật bơm mẫu trong phƣơng pháp điện di mao quản ....................16
Hình 1.6 Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc...................18
Hình 1.7 Sơ đồ biểu diễn cấu trúc (A) và mạch điện tƣơng đƣơng (B) của cảm biến
đo độ dẫn không tiếp xúc .....................................................................................18
Hình 2.1 Hệ thiết bị điện di mao quản CE-C4D tự chế, bán tự động ........................22
Hình 3.1 Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của thành phần đệm .................................26
Hình 3.2 Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của chất hoạt hóa bề mặt ........................27
Hình 3.3 Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của pH. .....................................................28
Hình 3.4 Điện di đồ khảo sát thời gian bơm mẫu .....................................................29
Hình 3.5 Điện di đồ khảo sát chiều cao bơm mẫu ....................................................30
Hình 3.6 Điện di đồ khảo sát thế điện di . .................................................................31
Hình 3.7 Điện di đồ khảo sát chất ảnh hƣởng ...........................................................32
Hình 3.8 Đƣờng chuẩn của oxalate theo diện tích pic ..............................................34
Hình 3.9 Đƣờng chuẩn của tartrate theo diện tích pic...............................................34
Hình 3.10 Đƣờng chuẩn của citrate theo diện tích pic ..............................................34
Hình 3.11 Điện di đồ phân tích 1-oxalate, 2-tartrate, 3-citrate trong mẫu bia chai Hà
Nội và mẫu bia lon Hà Nội ..................................................................................43


Hình 3.12 Điện di đồ phân tích 1-oxalate, 2-tartrate, 3-citrate trong mẫu bia lon
Halida và mẫu bia chai Sài Gòn Special..............................................................44
Hình 3.13 Điện di đồ phân tích 1-oxalate, 2-tartrate, 3-citrate trong mẫu bia lon
Haliken .................................................................................................................44
Hình 3.14 Điện di đồ phân tích 1-oxalate, 2-tartrate, 3-citrate trong mẫu mỳ tôm
Hảo Hảo và mẫu mỳ tôm Ba Miền ......................................................................46
Hình 3.15 Điện di đồ phân tích 1-oxalate, 2-tartrate, 3-citrate trong mẫu trà túi lọc

EOF

Dòng điện di thẩm thấu

GC

Sắc ký khí

His

Histidine

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Leff

Chiều dài hiệu dụng của mao quản

Ltot

Tổng chiều dài mao quản

LOD

Giới hạn phát hiện

LOQ


MỞ ĐẦU
Hiện nay, tình hình an toàn vệ sinh thực phẩm ở nƣớc ta đang rất đƣợc quan
tâm, với nhiều vụ ngộ độc tập thể xảy ra hàng loạt và ở nhiều khu vực khác nhau. Có
nhiều nguyên nhân dẫn đến mất an toàn thực phẩm, trong đó có nguyên nhân xuất phát
từ việc sử dụng các chất phụ gia thực phẩm. Gần đây, dƣ luận đặc biệt quan tâm đến sự
xuất hiện của oxalate trong một số sản phẩm thực phẩm nhƣ bia, mỳ tôm,…gây ảnh
hƣởng xấu tới sức khỏe ngƣời sử dụng. Theo các nghiên cứu, oxalate là một trong những tác
nhân chính gây nên bệnh sỏi thận [12, 23] do tạo kết tủa với các ion kim loại nhƣ
magie, canxi… (kết tủa này chiếm tới 80% về khối lƣợng của sỏi thận).
Cùng với oxalate, axit tƣơng ứng của tartrate, citrate là những chất phụ gia
thực phẩm thƣờng xuất hiện đồng thời trong nhiều loại thực phẩm. Sự xuất hiện của
citrate đồng thời với oxalate sẽ làm giảm nguy cơ hình thành sỏi thận do citrate có khả
năng ức chế quá trình kết tinh hình thành canxi oxlate [13]. Vì vậy, ngoài việc phân tích,
kiểm tra hàm lƣợng oxalate, quy trình sẽ kết hợp phân tích, kiểm tra xác định đồng thời
hàm lƣợng của tartrate và citrate trong mẫu thực phẩm.
Có nhiều phƣơng pháp khác nhau để xác định hàm lƣợng các chất oxalate,
tartrate, citrate nhƣ: sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), phƣơng pháp sắc ký khối phổ
(GC-MS), sắc ký ion [13, 15],....Các phƣơng pháp này thƣờng chỉ đƣợc trang bị ở các
phòng thí nghiệm hiện đại với chi phí khá lớn và yêu cầu đội ngũ kỹ thuật cao. Trong
nghiên cứu này, với mục tiêu xây dựng một phƣơng pháp phân tích nhanh, hiệu quả,
đơn giản với chi phí thấp, hƣớng tới nhu cầu phân tích ở tuyến địa phƣơng, chúng tôi
đã xây dựng, phát triển quy trình phân tích đồng thời các chất oxalate, tartrate, citrate
trong thực phẩm bằng phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không
tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C4D) trên cơ sở hệ thiết bị tự chế, bán tự động.
1


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về các chất phụ gia thực phẩm
1.1.1. Giới thiệu chung về phụ gia thực phẩm

kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm,….
Tuy nhiên, khi sử dụng phụ gia thực phẩm không đúng liều lƣợng, chủng loại
nhất là những phụ gia không cho phép dùng trong thực phẩm sẽ gây những tác hại cho
sức khỏe nhƣ: Gây ngộ độc cấp tính nếu dùng quá liều cho phép. Gây ngộ độc mạn tính
dù dùng liều lƣợng nhỏ, thƣờng xuyên, liên tục, một số chất phụ gia thực phẩm tích lũy
trong cơ thể, gây tổn thƣơng lâu dài. Nguy cơ gây hình thành khối u, ung thƣ, đột biến
gen, quái thai, nhất là các chất phụ gia tổng hợp. Nguy cơ ảnh hƣởng tới chất lƣợng
thực phẩm nhƣ phá huỷ các chất dinh dƣỡng, vitamin...[4].
Vì vậy, Khi sử dụng chất PGTP phải tuân thủ các quy định sử dụng dựa trên
các tiêu chuẩn cụ thể theo ISO (International Standard Organization) và Hội đồng tiêu
chuẩn thực phẩm CAC (Codex Alimentarius Commision) gồm hơn 130 nƣớc thành
viên, trong đó có Việt Nam. Mỗi quốc gia sẽ qui định cụ thể về các chất PGTP đƣợc
dùng cho nƣớc mình. Tóm lại, ở Việt Nam, các chất PGTP phải nằm trong danh mục
cho phép sử dụng và đảm bảo các yêu cầu về kĩ thuật, hàm lƣợng và vệ sinh an toàn thực
phẩm theo quy định do Bộ Y tế ban hành.
1.2. Thông tin chung về oxalate, tartrate và citrate
Các chất oxalic, tartric và citric là một trong số các chất phụ gia thực phẩm
nằm trong danh mục đƣợc phép sử dụng ở Việt Nam với hàm lƣợng nhất định.
Bảng 1.1. Thông tin chung về 3 hợp chất oxalic, tartaric và citric
Tên chất

Axit oxalic

Axit tartaric

Axit citric

Danh pháp

Axit etanedioic

phântử (g/mol)

pKa(1;2;…)
Độ tan trong nƣớc

90,03 (khan)

nóng chảy (oC)

192,123

126,07

g/mol(khan)

(ngậm nƣớc)
1,23; 4,19

3,04; 4,37

0,143

1,33

3,15; 4,77; 6,40
1,33

(L hoặc D-tartaric)

(g/ml ở20°C)

ạ
i
c
ủ
a
c
á
c
o
x
a
l
a
t
e
,
t
a
r
t
r
a
t
e
v
à
c
i
t
r

t

t
h
ự
c

e



p
h
ẩ
m
,

Ứ
n
g

p
h
ụ

d

g
i
a

dùng trong
gia
đ
ì
n
h
,
c
h
ẳ
n
g
h
ạ
n
m
ộ
t
s
ố
c
h
ấ
t
t
ẩ
y
r
ử
a

c
h
a
x
i
t
o
x
a
l
i
c
đ
ƣ
ợ
c

d
ù
n
g
đ
ể
p
h
ụ
c
c
h
ế

 Sử dụng trong công nghệ sinh học, hoạt hóa một số dung dịch tẩy rửa, …
 Tác hại
Axit citric đƣợc hầu hết các quốc gia và tổ chức quốc tế công nhận là an
toàn để sử dụng trong thực phẩm. Nó hiện diện tự nhiên trong gần nhƣ mọi dạng
sự sống, các lƣợng axit citric dƣ thừa dễ dàng trao đổi và bài tiết ra khỏi cơ thể.
Tuy nhiên, việc tiếp xúc với axit citric khô hay đậm đặc có thể gây ra kích ứng da
và mắt, vì thế phải sử dụng các trang bị bảo hộ lao động
5


khi tiếp xúc với axit citric. Việc sử dụng quá nhiều axit citric cũng dễ làm tổn
hại men răng. Tiếp xúc gần với mắt có thể gây bỏng và làm mất thị giác.
Đôi khi hàm lƣợng quá cao axit citric có thể gây tổn hại cho tóc, do nó
mở lớp cutin của tóc. Nó có thể làm mất các chất cần thiết cho tóc và làm tóc bị
bạc màu.
1.4. Vấn đề sử dụng oxalate, tartrate và citrate trên thế giới và ở Việt Nam
1.4.1. Vấn đề sử dụng oxalate, tartrate và citrate trên thế giới
 Vấn đề sử dụng oxalate trên thế giới
Hiện tại, Ủy ban chuyên gia của FAO/WHO về phụ gia thực phẩm
(JECFA) chƣa có nghiên cứu toàn diện về ảnh hƣởng của axit oxalic cũng nhƣ
muối oxalate trong thực phẩm đối với sức khỏe con ngƣời và vẫn đƣa axit
oxalic vào danh mục các chất hỗ trợ chế biến trong thực phẩm. Trên cơ
sở danh mục của Codex, một số các quốc gia trên thế giới nhƣ Nhật Bản, Hàn
Quốc…
 Vấn đề sử dụng tartrate và citrate trên thế giới
Tartrate và citrate đƣợc sử dụng nhiều trong quá trình chế biến nhiều loại
thực phẩm, nƣớc giải khát… Với vai trò là một chất điều vị, chống oxi hóa... Các chất
này đƣợc các quốc gia và tổ chức quốc tế cho phép sử dụng với vai trò là chất
phụ gia thực phẩm.
1.4.2. Vấn đề sử dụng oxalate ở Việt Nam

dụng tartrate và citrate với vai trò là chất phụ gia thực phẩm. Các chất này thƣờng đƣợc
sử dụng để điều vị và chống oxi hóa thực phẩm.
1.5. Các phƣơng pháp xác định oxalate, tartrate và citrate
1.5.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động
là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu
phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến
đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ
chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử).
7


Phƣơng pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ
phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay, phƣơng pháp HPLC ngày càng phát triển và
hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Hiện nay
nó áp dụng trong nhiều lĩnh vực, xác định nhiều loại chất khác nhau trong
đó nhiều tác giả đã dùng phƣơng pháp này để xác định oxalate, tartrate và citrate.
Trong công trình nghiên cứu của Muhammad Iqbal Bhanger và các cộng sự
[13] đã sử dụng phƣơng pháp HPLC để xác định đồng thời axit oxalic và axit citric
trong nƣớc tiểu để giám sát nồng độ của axit oxalic và axit citric trong quá trình
hình thành sỏi thận. Pha động trong phƣơng pháp gồm KH 2PO4 (25%) và
(C4H9)4NHSO4 (2,5 mmol) ở pH 2,0. Hiệu suất thu hồi cho axit oxalic và axit citric
tƣơng ứng là 97% và 102%.
Bằng cách sử dụng phƣơng pháp HPLC, Ruben Rellan-Alvarez [19] đã xác
định đồng thời 10 axit hữu cơ có phân tử lƣợng thấp trong đó có axit oxalic với giới hạn
phát hiện 255pmol, P < 0,05, hiệu suất thu hồi đạt 108%. Phƣơng pháp đã đƣợc áp dụng
xác định đồng thời 10 axit hữu cơ trong mẫu chiết xuất từ lá củ cải đƣờng, cà chua và
nƣớc cam ép thƣơng mại.
Trong công trình nghiên cứu của Fengwu Wu, Zhike He, Qingyao Luo,
Yun'e Zeng, sự phát quang hóa học của Ru(phen)2+ đƣợc áp dụng trong phƣơng 3

định hàm lƣợng oxalate trong sỏi thận. Các bƣớc tiến hành là: hòa tan của oxalate
trong sỏi thận bằng HCl, loại bỏ các cation bằng cách sử dụng nhựa trao đổi cation, bốc
hơi nƣớc, pha loãng với ethyl acetate, tạo các este của axit oxalic trimetylsilyl với
chlorotrimethylsilane. Với việc xử lý mẫu hích hợp, phƣơng pháp này cũng đã đƣợc áp
dụng cho mẫu nƣớc tiểu và mẫu thực phẩm. Các kết quả thu đƣợc: khoảng tuyến tính là
0,2-5,0 mg oxalate/l, giới hạn phát hiện 0,06 mg oxalate /l, hệ số biến thiên của phƣơng
pháp 1,3%. Hai mƣơi bảy mẫu sỏi thận đã đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp này. Kết
quả hàm lƣợng trung bình của axit oxalic trong sỏi axit uric là 0,11 mg/g (SD = 0,08, n
= 13). Oxalate đƣợc tìm thấy trong sỏi struvite với hàm lƣợng trung bình là 0,2 mg axit
oxalic/g (SD = 0,13, n = 8). Trong sỏi đá hydroxyapatite, hàm lƣợng oxalate cao nhất,
có thể lên đến 0,801 mg axit oxalic/g [24].
1.5.3. Phương pháp sắc ký ion

9


Sắc ký ion là kỹ thuật tách các cấu tƣ̉ anion hay cation tƣ̀ hỗn hợp qua cột sắc
ký dựa trên ái lực khác nhau của mỗi ion đối với pha tĩnh và pha động.
Để cung cấp thông tin cho quá trình chuẩn đoán và điều trị bệnh liên quan
đến chuyển hóa oxalate. Bằng cách sử dụng phƣơng pháp sắc ký ion, Hoppe B và các
cộng sự [10] đã xác định đồng thời oxalate, citrate và sulfate trong huyết tƣơng của các
mẫu đƣợc lấy từ 50 trẻ sơ sinh và trẻ em (23 nam, 27 nữ độ tuổi từ 0,2 đến 17 tuổi) với
chức năng thận bình thƣờng. Máu đƣợc lấy vào ống Li-Heparin, đặt trong nƣớc đá.
Sau khi lấy, mẫu máu ngay lập tức bảo quản bằng HCl với tỷ lệ 40µM/ml. Mẫu đƣợc
phân tích bằng hệ thống sắc ký ion với pha động là dung dịch NaOH. Khoảng tuyến tính
thu đƣợc từ 5mM đến 52,5mM với thời gian phân tích là hơn 21 phút. Kết quả thu đƣợc
về hàm lƣợng oxalate là (6,43 +/- 1,06 µmol/L), citrate (79,3 +/- 27,4 µmol/L) và
sulfate (235,0 +/- 85,3 µmol/L). Kết quả cũng cho thấy không có sự khác biệt cụ thể về
độ tuổi và giới tính. Phƣơng pháp cho độ tin cậy cao và tái lặp tốt (hệ số phƣơng sai
1,95-4,75%).

Electropherograph (Isco Inc., Lincoln, NE, USA) hoạt động ở -20 kV và ở 28 °C với
mao quản 75 cmx75 id (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, USA) có chiều dài hiệu
dụng là 50cm. Chất phân tích đƣợc phát hiện bằng cách sử dụng kỹ thuật hấp thụ gián
tiếp. Giữa mỗi lần phân tích mao quản đƣợc rửa trong 2 phút bằng dung dịch đệm chứa
10% methanol, 10 mM natri cromat tetrahydrate và 4 mM OFM Anion-BT. Giới hạn định
lƣợng đạt đƣợc là 0,01g/100 g. Nghiên cứu này đƣợc áp dụng để xác định axit oxalic
trong rau và một số loại đồ uống.
Một nghiên cứu đáng tin cậy khác của Corinne Rivasseau [8] sử dụng phƣơng
pháp điện di mao quản vùng (CZE) với detector UV đã định lƣợng đƣợc axit citric,
malic, succinic, oxalic, formic, fumaric, acetic, và phosphoric chứa trong thực vật với
thời gian tích ngắn trong khi vẫn giữ độ phân giải tốt bằng cách tối ƣu chiều dài mao
quản, điện áp tách, thành phần và pH của dung dịch đệm. Quá trình phân tích đƣợc thực
hiện trong một mao quản không tráng silica, chiều dài hiệu dụng 30cm, đảo ngƣợc
dòng điện di thẩm thấu và thế điện di là -30 kV. Dung dịch đệm chứa 3.10-4 mol/L
tetradecyltrimethylammonium và 10- 2 mol/L trimellitate pH

11