Bộ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
VƯƠNG THỊ VIỆT HỒNG
■ ■
NGHIÊN c ú u ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
BETAMETHASON VÀ DEXCLORPHENIRAMIN MALEAT
TRONG VIÊN NÉN CEDESFARNIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 2003 -2007)
Người hướng dẫn: TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
ThS. Tông Thị Thanh Vượng
Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá Phân tích
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện: 01.2007 - 05
HÀ NỘI - 05.2007
LỜI CẢM ƠN
<
%fi.oá Cuận này được thực hiện và Hoàn thành tại 6ộ môn J-Coá
<Thân tích, Trường Đại dọc (Dược Hà Nội Lời ẩầu tiên tôi jận 6ày tỏ
Còng 6iết ơn sâu sắc tói TS.lĩiấi Nguyên 0~Cùng Tĩiu và TĩiS-'Tống Tñi
‘Thanh Vượng ẩã trực tiêị) hướng dan tôi thực hiện kỊioá Cuận nảy.
Đổng thời tôi củng J(in cám ơn sự giúp đõ của các thầy cô
giáo, cán 6ộ fịỹ thuật viên trong ỗộ môn J~Coá (Phẩn tích ẩẵ giúp tôi
hoàn thành Ñfioá [uận.
Tôi xin cầm ơn (Ban Çiàm diệu, các thầy cô giáo, kỹ thuật
viên, cán 6ộ công nhẩn viên các phòng 6an trong toàn trường da giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại Trường.
Cuối cùng tôi xịn cám ơn ßia (ñnh và Sạn 6è ấã Cuôn ấộng
viên fifiícÑ. tệ, giúp cfõ tôi tận tỉnh.
Hà mi, 19.0S.2007
Vương Thị Việt Jiông

- 1 -
2.2.7. Xác định độ đúng của phương pháp 31
2.3. BÀN LUẬN 1 32
KẾT LUẬN 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 35
- 2 -
CÁC CHỮVIẾT TẮT
CE Điện di mao quản
CZE Điện di mao quản vùng
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
UV-VIS Quang phổ tử ngoại khả kiến
ĐẶT VẤN ĐỀ
<
Sức khoẻ là vốn quý nhất của con người. Ngày nay nhu cầu chăm sóc
và bảo vệ sức khoẻ của nhân dân ngày một tăng. Cùng với sự phát triển
nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, công nghệ bào chế các thuốc cũng
ngày càng phát triển. Yêu cầu về kiểm soát chất lượng cũng được đặt ra
ngày càng chặt chẽ hơn. Các thuốc có hơn một thành phần ngày càng trở
nên phổ biến trên thế giới cũng như ở Việt Nam, nhằm tăng cường tác dụng
điều trị và hạn chế tác dụng không mong muốn cho người sử dụng. Trong
các thuốc đa thành phần, có nhóm thuốc chống viêm-dị ứng đã được lưu
hành sử dụng từ lâu, các hoạt chất trong nhóm này có mặt rất nhiều trong
công thức thuốc đa thành phần. Một trong các dạng phối hợp có mặt trên thị
trường hiện nay là Cédesfamin của Công ty cổ phần Dược Đồng Nai có tác
dụng chống viêm, chống dị ứng đã được sản xuất vói công thức:
Betamethason 0,25 mg.
Dexcỉorpheniramin maleat 2 mg.
Để định tính và định lượng 2 thành phần hoạt chất trên trong các
dược điển thông dụng hiện hành [6, 14, 17, 18, 19] chủ yếu chỉ có các
chuyên luận cho thuốc chứa từng thành phần. Vì vậy các phương pháp định

Betamethason là một corticosteroid tổng hợp, có tác dụng
glucorticoid rất mạnh và kéo dài. Betamethason có tác dụng chống viêm,
chống thấp khớp và chống dị ứng.
Chỉ định: Trong nhiều bệnh như thấp khớp, bệnh Colagen, dị ứng,
bệnh ngoài da, bệnh nội tiết, bệnh ở mắt, hô hấp, máu, ung thư và nhiều
bệnh khác có đáp ứng với liệu pháp corticosteroid.
Liều dùng: Người lớn uống 0,5-5 mg/ ngày
Chống chỉ định: Bệnh nhân bị tiểu đường, tâm thần, loét dạ dày và
- 6 -
hành tá tràng, trong nhiễm khuẩn và vi rút, trong nhiễm nấm toàn thân và
người quá mẫn cảm với Betamethason. 1
Tác dụng không mong muốn: Giống như các corticosteroid khác bao
gồm: rối loạn về nước và điện giải, cơ xương, tiêu hoá, da, thần kinh, nội
tiết, mắt, chuyển hoá và tâm thần.
Các dạng bào chế:
Viên nén 0,25 và 0,5 mg (Biệt dược Celeston); ống tiêm 4mg/mL;
thuốc mỡ nhỏ mắt, nhỏ tai, mỡ gel dùng ngoài [11].
1.1.2. Các phương pháp định tính: [6, 8,11,12,13,14,17,18,19]
Đo phổ hồng ngoại
Đo góc quay cực: [a]^=+118° 4- +126°
Sắc ký lớp mỏng:
-Bản mỏng Silicagen GF 254.
- Dung môi triển khai:
Nước- methanol- ether- methylen clorid (1,2 : 8 : 15 : 7)
Hỗn hợp dung môi cloroíorm- diethylamin
Hỗn hợp butanol bão hòà nước : toluen : ether (5:10: 85)
- Phun hiện màu bằng H2SO4/ ethanol (1/2) hoặc soi dưới đèn
365nm so sánh với vết chuẩn
Đo phổ tử ngoại
Phản ứng với phenyl hydrazin/H2S04 thu được dẫn chất hydrazol hấp

X 25cm), pha động là nước: acetonitril (63 : 37), detertor uv 240nm, tốc độ
dòng l,0ml/phút. Định lượng bằng so sánh với chất chuẩn hay chất nội
chuẩn. Các chất nội chuẩn được sử dụng có thể là propyl paraben, methyl
testosteron tuỳ theo dạng muối.
1.2. DEXCLORPHENIRAMIN MALEAT [1, 3, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 18, 19]
1.2.1. Công thức cấu tạo, một sô tính chất và tác dụng dược lý:
ch3
,COOH
'COOH
N
I
CH3
Công thức phân tử: CI6H19C1N2.C4H40 4
Khối lượng mol: 390,9.
Tên khoa học: (+)-2 {p-Chỉoro-a Ị2-(dimethylamino) ethyl}benzyl]
pyridine maleate.
Tính chất:
Bột kết tinh trắng, không mùi, là đồng phân hữu tuyền của
Clorpheniramin (racemic). Độ chảy: 110- 115°c. Dễ tan trong nước (1/1,1),
alcol (1/2), cloroform (1/1,7), rất ít tan trong ether, tan troilg methanol và
methyl clorid.
Dung dịch nước có phản ứng acid với quỳ pH = 4-5
Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng:
Dexclopheniramin maleat là thuốc kháng histamin HI
Cơ chế tác dụng: Dexclorpheniramin maleat đối kháng cạnh tranh với
histamin tại receptor H I của tế bào đích, vì vậy nó ngăn được tác dụng của
histamin lên tế bào đích, ngăn chặn các biểu hiện dị ứng.
Tác dụng mạnh hơn Clorpheniramin maleat 2 lần với cùng liều
lượng, do đồng phân tả tuyền không có tác dụng, có giới hạn an toàn cao.
Chỉ định: Chống dị ứng như viêm mũi dị ứng, mày đay, ban da, dị

Thể tiêm sắt ký: 20 |iL
1.3. VÀI NÉT VỀ ĐIỆN DI MAO QUẢN: [4, 10, 15]
1.3.1. Cơ chê của quá trình điện di trong mao quản:
Điện di mao quản là một kỹ thuật tách phân tích được Việt hoá từ
thuật ngữ Capillary Electrophoresis, thường được gọi tắt là CE.
Nguyên tắc của quá trình tách trong điện di mao quản là dựa trên cơ
sở tính chất điện di khác nhau của các phần tử chất tan. Quá trình này xẩy
ra trong mao quản trên nền của dung dịch chất điện ly có pH thích hợp,
dưới tác dụng của một điện trường E xác định đặt vào hai đầu mao quản.
Cơ chế của điện di là sự di chuyển của các phần tử chất tan trong
mao quản dưới tác dụng của lực điện trường nhất định (.Electric Field
Force, được viết tắt là EFF) và tính chất của dòng chảy điện thẩm (Electro-
Osmotic Flow, được viết tắt là EOF). EOF là một ỉoại của dòng chảy khối
của chất lỏng trong mao quản. Nó có quan hệ mật thiết với lớp điện tích
trên thành mao quản. EOF sẽ quyết định thời gian tồn tại của chất tan trong
mao quản. Nó tồn tại bao trùm lên dòng di chuyển của chất tan, nghĩa là
chất tan di chuyển trong dòng này [15].
Hình 1.1 - Sự di chuyển của ion và phân tử trong mao quản
Thế tạo ra điện trường E đặt vào hai đầu mao quản được dùng trong
kỹ thuật CE ỉà rất lớn, thông thường từ 10 - 30 kV. Chính lực điện trường
này làm động lực cho các phần tử chất tan di chuyển theo một hướng nhất
định và các chất có điện tích và độ lớn khác nhau sẽ di chuyển với các tốc
độ khác nhau. Do đó mà tạo nên sự tách của các chất phân tích.
Mao quản sử dụng trong CE thường có độ dài từ 25 đến 100 cm,
đường kính trong (id) 25 - 100 Ịim. Loại mao quản có đường kính trong
khoảng 50 - 75um là thích hợp nhất vì hiệu ứng nhiệt nhỏ, dễ khống chế
nhiệt độ mao quản. Mao quản được chế tạo từ nhiều vật liệu khác nhau,
nhưng phổ biến nhất là silica nung chảy ựused silica). Trên thực tế hầu hết
các nghiên cứu đã thực hiện bằng CE cho tới nay đều tiến hành trên loại
mao quản này. Đây cũng là loại mao quản chúng tôi sử dụng trong nghiên

Thế Zeta C, được xác định chủ yếu bằng điện tích bề mặt của thành
mao quản. Điện tích phụ thuộc vào pH, vì vậy trị số EOF thay đổi theo pH.
Ở pH càng cao, các nhóm silanol mất proton H+ càng nhiều nên trị số dòng
EOF càng lớn. Phụ thuộc vào điều kiện điện di cụ thể, với pH trong khoảng
2-12 dòng EOF có thể thay đổi.
Ngoài pH dung dịch điện di, dòng EOF sẽ thay đổi khi:
- Lực ion của dung dịch tăng lên, làm giảm thế Zeta nên dòng EOF giảm.
- Trong một số trường hợp dung dịch đệm nước có thêm một số dung dịch
hữu cơ như methanol, acetonitril (để hoà tan chất phân tích), hằng số điện
môi của dung dịch điện di giảm xuống kéo theo sự giảm của dòng EOF.
❖ Hai đặc điểm của EOF:
* Đặc điểm đầu tiên của dòng EOF là tạo nên một dòng chuyển khối
phẳng trong mao quản. Bởi vì lực tạo ra sự di chuyển của EOF phân bố
đồng nhất dọc theo mao quản, cho nên không có sụt áp trong mao quản:
dòng đồng nhất từ đầu này đến đầu kia của mao quản. Nếu dùng bom đẩy
dung dịch như trong LC thì dòng chảy sẽ có dạng parabol (do hiệu ứng
thành: các phân tử giữa dòng di chuyển với tốc độ cực đại, các phân tử gần
thành di chuyển với tốc độ chậm hơn nhiều và dần tới có tốc độ bằng 0).
Tuy nhiên tính chất tạo dòng chuyển khối phẳng của dung dịch điện
di chỉ xuất hiện khi đường kính trong mao quản (dị) < 200 |im. Nếu đường
kính trong của mao quản vượt quá xa 200 ¡am thì sức căng bề mặt khổng
đủ tạo ra sự di chuyển đồng nhất giữa phần chất lỏng ở giữa và ở gần thành
mao quản.
* Đặc điểm thứ hai của dòng EOF là đưa tất cả các tiểu phân có mặt
trong dung dịch điện di (bất kể có điện tích hay không) di chuyển theo cùng
một hướng. Với điều kiện thông thường (thành mao quản tích điện âm),
dòng này di chuyển về catod. Các anion cũng sẽ di chuyển về phía catod vì
- 13-
tốc độ EOF lớn hom nhiều so vói tốc độ điện di.
Cạtion di chuyển nhanh nhất do lực điện di và EOF cùng hướng, tiếp

14
-
muối alkyl amoni bậc 4. Đầu thân nước mang điện tích dương sẽ cố định
với nhqm SiO' của thành mao quản nhờ tương tác ion. Phần sơ nước của
hydrocarbon sẽ liên kết (tương tác sơ nước) với các phân tử muối alkyl
amoni tự do. Đầu mang điện tích dương của muối này sẽ hút các anion của
dung dịch. Các anion hydrat hoá này sẽ di chuyển về phía anod kéo toàn bộ
khối dung dịch trong mao quản đi theo, tạo ra EOF di chuyển về phía anod.
-

—

»
■EOF
Hình 1.4 - Đổi chiều EOF nhờ các chất hoạt động bề mặt cation.
Các muối alkyl amoni bậc 4 thường dùng cho đổi chiều EOF là:
Cetyl trimetyl amoni bromid (CTAB) hoặc clorid (CTAC), Tetradecyl
trimetyl amoni bromid (TTAB). Ngoài ra có thể dùng dietylen triamin
(DETA).
1.3.1.2. Các thông số phân tích của CE:
**** Thời gian di chuyển tM {migration times):
Thòi gian cần thiết để một chất tan di chuyển từ khi đưa vào mao
quản đến thời điểm được phát hiện bởi detector được gọi là thời gian di
chuyển tM.
Quãng đường di chuyển là chiều dài hiệu dụng của mao quản. Đó là
độ dài từ điểm tiêm mẫu đến điểm phát hiện. Tốc độ di chuyển gồm hai
thành phần:
- Tốc độ điện di của ion: vep = ụ ep.E = Mcp-—
'ề
- 15-

với Ah=H2-Hj m = ^ÌM2+Mi)
16-
I.3.I.3. Phân loại CE
TỊieo cơ chế, bản chất và đặc điểm của sự tách trong mao quản mà
người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu khác nhau như trong
bảng 1.2.
Bảng 1,2 - Một sô' kiểu điện di và cơ chê tách
Kiểu điện di
Cơ chế tách
1. Điện di mao quản vùng CZE
(capillary zone electrophoresis)
Linh độ khác nhau của
các ion trong dung dịch
tự do.
2. Sắc ký điện động mixen MEKC
(micellarelectrokinetic chromatography)
Tương tác sơ nước/ion
với hạt mixen trong dung
dịch
3. Điện di mao quản gel CGE
(capillary gel electrophoresis)
Kích thước và điện tích
(molecular sieve)
4. Điện sắc ký mao quản CEC
(capillary electrochromatography)
Sự phân bố và linh độ
khác nhau của các chất.
1.3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng:
*1* Điện thế:
Thời gian phân tích sẽ tỷ lệ nghịch với điện thế đặt vào hai đầu mao

Vial !
caro
(thermostatted)
2
2. Dung dịch mẫu,
3. Dung dịch đệm,
Buffer replenishment
t
4. Dung dịch đệm dự trữ,
5. Detector (DAD).
4
Hình 1.5 - Sơ đồ hệ thống điện di
- 18-
Sơ đồ một hệ thống điện di mao quản như trong hình 1.5, thường
gồm cáp bộ phận sau: I
- Bộ phận buồng điện cực, các điện cực và bình điện cực
- Nguồn cấp thế cao một chiều (10-30 kV) biến thiên được.
- Cột tách- mao quản.
- Bộ phận nạp mẫu vào mao quản.
- Bộ phận phát hiện chất (detector).
- Bộ phận ghi sắc đổ (computer).
- Bộ phận điều nhiệt cho mao quản.
1.3.2. Điện di mao quản vùng :
1.1.2.1. Cơ sở điện di mao quản vùng :
Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis - CZE) là
phương pháp phân tích cơ bản nhất của kỹ thuật CE, do tính đơn giản của
cơ chế tách và tính linh hoạt của nó. Phương pháp này có phạm vi ứng dụng
rộng trong việc tách và phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, bao gồm
các amino acid, các peptid, các hợp chất cấu tạo ion, các hợp chất đổng
phân không gian và nhiều loại hợp chất có khả năng ionic hoá [10].

t
* J \
Hình 1.6 - Quá trình tách các chất trong CZE
CZE là mô hình phân tích đơn giản nhất của CE. Hệ thống phân tích
CZE cũng chính là cơ sở xuất phát cho các kỹ thuật CE khác. Từ xuất phát
điểm là một mao quản với một dung dịch đệm nhất định (hay còn gọi là
dung dịch điện ly nền - Background Electrolyte Solution), người sử dụng
chỉ cần thêm vào một hay nhiều chất phụ gia (modifier) thích hợp là có thể
chuyển sang các kỹ thuật điện di khác. Tùy thuộc vào chất phụ thêm vào có
nhiều kỹ thuật CE khác nhau.
1.3.2.2. ứng dụng của CZE :
Hiện nay CZE đã được ứng dụng tương đối nhiều trong lĩnh vực sinh-
y học, đặc biệt là lĩnh vực tách và phân tích các chất peptid, protein, các
amino acid và glycoprotein.
1.3.3. Một số ưu điểm của điện di mao quản:
Điện di mao quản có một số ưu điểm sau:
- Có hiệu lực tách các chất rất cao trong mao quản silica nung chảy
hay ống Teflon (có đường kính trong 25-lOOịim).
- Số đĩa lý thuyết N của cột tách là rất lớn, thông thường N từ 105 đến
106 nên cho kết quả tách tốt những hợp chất phức tạp.
- Thời gian tách ngắn hơn so với các loại sắc ký HPLC trên cùng loại
đối tượng mẫu.
- Lượng (thể tích) mẫu cần là rất nhỏ, thường là từ 5-50 nL cho một
lần bơm mẫu vào cột tách. <
- Có nhiều kiểu tách theo CE, nên khả năng ứng dụng thực tế là rất
rộng rãi và đa dạng.
- Sự tách được thực hiện chủ yếu trong môi trường nước với sự có
mặt của chất điện ly nên không tốn nhiều dung môi hữu cơ và rất kinh tế.
- Quá trình phân tích không phức tạp (tương tự như trong HPLC).
- Có khả năng tự động hóa trong tách và phân tích hàng loạt.

ỉ viên
Giá trị trung bình: X
/=1
n
- 2 2 -
Độ lệch chuẩn: s =
t k - x Ỵ
7=1 ________
Phương sai: s2 =
(n-1)
±(X,-XÌ
/ = 1
Sai số chuẩn: Si-\ =
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = = X100
X
Sai số tương đối: £•(%) = a—^ X100
X
2.1.4. Hoá chất, dụng cụ:
2.1.4.1. Thuốc thử - Hoá ch ất:
- Methanol: loại HPLC- Merck (Germany)
- Natri tetraborat (Budapets-Hunggary)
- Nước cất chạy điện di
- Dexclorpheniramin maleat: chuẩn làm việc của Viện kiểm nghiệm hàm
lượng 100%.
- Betamethason: chuẩn làm việc của Viện kiểm nghiệm hàm lượng 100,4%
2.1.4.2 Thiết bị - dụng cụ:
- Máy điện di mao quản Hewlett Packard 3D CE của Bộ môn Hoá Phân tích,
Trường Đại học Dược Hà Nội.
- Máy quang phổ Beckman DƯ-640 spectrophotometer (Mỹ).
- Máy lọc nước siêu sạch Elga (Anh).