ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------

TRẦN ĐĂNG TUẤN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH OXALAT TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ
DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------

TRẦN ĐĂNG TUẤN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH OXALAT TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ
DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN THỊ ÁNH HƯỜNG



DANH MỤC CÁC HÌNH

Tên viết tắt

Tên đầy đủ

Ace

Acetic

Arg

L- arginine

C4D

Detector đo độ dẫn kết nối kiểu tụ điện

CE

Phương pháp điện di mao quản

CHES

Axit 2-(cyclohexylamino) ethanesunlfomic

CTAB


LOQ

Giới hạn định lượng

MeOH

Methanol

MEKC

Điện di mao quản điện động học Mixen

MES

axit 2-(N-morphonlino)ethane sulfonic

PGTP

Phụ gia thực phẩm

%RSD

% độ lệch chuẩn tương đối

SD

Độ lệch chuẩn

UPLC


oxalate, tartrate, citrate trong thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản sử
dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C 4D) trên cơ sở hệ
thiết bị tự chế, bán tự động.
6


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về các chất phụ gia thực phẩm
1.1.1. Giới thiệu chung về phụ gia thực phẩm

Chất phụ gia thực phẩm là những chất không được coi là thực phẩm hoặc
một thành phần của thực phẩm; Ít hoặc không có giá trị dinh dưỡng; Bổ sung vì mục
đích công nghệ trong quá trình sản xuất, chế biến… [3].
Như vậy, PGTP không phải là thực phẩm mà nó được thêm vào nhằm đáp
ứng yêu cầu nhất định của sản phẩm. Việc sử dụng PGTP phải tuân theo quy định
hiện hành của các cơ quan chức năng, ở Việt Nam là Bộ Y tế.
1.1.2. Phân loại phụ gia thực phẩm

Tùy vào từng cơ sở mà có nhiều cách phân loại phụ gia thực phẩm khác nhau
như:
1.1.2.1. Phân loại theonguồn gốc
• Dạng tự nhiên: có nguồn gốc động vật và thực vật
• Dạng tổng hợp: Do con người tạo ra
1.1.2.2. Phân loại theo tác dụng

•

Tác dụng trực tiếp: Bao gồm các chất có tác dụng bảo quản (như chống lại
quá trình oxy hóa, chống tác hại của vi sinh vật, côn trùng, ký sinh gây hại…)
và tác dụng cảm quan (như tạo màu, tạo mùi, tăng thêm hương vị tăng thêm

thành viên, trong đó có Việt Nam. Mỗi quốc gia sẽ qui định cụ thể về các chất
PGTP được dùng cho nước mình. Tóm lại, ở Việt Nam, các chất PGTP phải nằm
trong danh mục cho phép sử dụng và đảm bảo các yêu cầu về kĩ thuật, hàm lượng và
vệ sinh an toàn thực phẩm theo quy định do Bộ Y tế ban hành.
1.2. Thông tin chung về oxalate, tartrate và citrate

Các chất oxalic, tartric và citric là một trong số các chất phụ gia thực phẩm
nằm trong danh mục được phép sử dụng ở Việt Nam với hàm lượng nhất định.
Bảng 1.1. Thông tin chung về 3 hợp chất oxalic, tartaric và citric
Tên chất
Danh pháp

Axit oxalic

Axit tartaric

Axit citric

Axit etanedioic

Axit 2,3-

Axit 2-

dihidroxibutandioic

hydroxypropan-

(IUPAC)


(ngậm nước)
pKa(1;2;…)
Độ tan trong nước

1,23; 4,19

3,04; 4,37

3,15; 4,77; 6,40

0,143

1,33

1,33

(g/ml ở20°C)
Nhiệt độ

(L hoặc D-tartaric)
157 (thăng hoa)

171-174 (L hoặc D-

153

tartaric, tinh khiết)

nóng chảy (oC)


• Tác hại
 Khi sử dụng quá mức có thể gây ra nhiều tác dụng phụ khó chịu như: nôn
mửa, tiểu chảy và gia tăng khả năng viêm đường tiêu hóa.
1.3.3. Citrate
• Ứng dụng
 Phụ gia thực phẩm (ký hiệu: E330): Điều vị, chống oxi hóa
 Giảm tác hại của nước cứng
 Sử dụng trong công nghệ sinh học, hoạt hóa một số dung dịch tẩy rửa, …
• Tác hại
Axit citric được hầu hết các quốc gia và tổ chức quốc tế công nhận là
an toàn để sử dụng trong thực phẩm. Nó hiện diện tự nhiên trong gần như
mọi dạng sự sống, các lượng axit citric dư thừa dễ dàng trao đổi và bài tiết ra
khỏi cơ thể. Tuy nhiên, việc tiếp xúc với axit citric khô hay đậm đặc có thể
gây ra kích ứng da và mắt, vì thế phải sử dụng các trang bị bảo hộ lao động
khi tiếp xúc với axit citric. Việc sử dụng quá nhiều axit citric cũng dễ làm tổn
hại men răng. Tiếp xúc gần với mắt có thể gây bỏng và làm mất thị giác.
Đôi khi hàm lượng quá cao axit citric có thể gây tổn hại cho tóc, do nó
mở lớp cutin của tóc. Nó có thể làm mất các chất cần thiết cho tóc và làm tóc
bị bạc màu.
1.4. Vấn đề sử dụng oxalate, tartrate và citrate trên thế giới và ở Việt Nam
1.4.1. Vấn đề sử dụng oxalate, tartrate và citrate trên thế giới
• Vấn đề sử dụng oxalate trên thế giới

Hiện tại, Ủy ban chuyên gia của FAO/WHO về phụ gia thực phẩm
(JECFA) chưa có nghiên cứu toàn diện về ảnh hưởng của axit oxalic cũng
như muối oxalate trong thực phẩm đối với sức khỏe con người và vẫn đưa
10


axit oxalic vào danh mục các chất hỗ trợ chế biến trong thực phẩm. Trên cơ

tươi cũng chứa axit oxalic với hàm lượng dao động từ 10,7 - 1809 mg/kg tùy theo
chủng loại.
Từ các thông tin trên, có thể thấy rằng axit oxalic (muối oxalate) tồn tại sẵn
có trong một số loại thực phẩm, khó khăn để phân biệt giữa axit oxalic tồn tại tự
11


nhiên với axit oxalic chủ động cho vào thực phẩm. Do vậy, để bảo đảm an toàn thực
phẩm cho người sử dụng, cần có các biện pháp để kiểm soát.
• Vấn đề sử dụng tartrate và citrate ở Việt Nam
Cũng như hầu hết các quốc gia và tổ chức quốc tế, Việt Nam cho phép sử
dụng tartrate và citrate với vai trò là chất phụ gia thực phẩm. Các chất này thường
được sử dụng để điều vị và chống oxi hóa thực phẩm.
1.5. Các phương pháp xác định oxalate, tartrate và citrate
1.5.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động
là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu
phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được
biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa
trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử).
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ
phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển
và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích.
Hiện nay nó áp dụng trong nhiều lĩnh vực, xác định nhiều loại chất khác nhau trong
đó nhiều tác giả đã dùng phương pháp này để xác định oxalate, tartrate và citrate.
Trong công trình nghiên cứu của Muhammad Iqbal Bhanger và các cộng sự
[13] đã sử dụng phương pháp HPLC để xác định đồng thời axit oxalic và axit citric
trong nước tiểu để giám sát nồng độ của axit oxalic và axit citric trong quá trình
hình thành sỏi thận. Pha động trong phương pháp gồm KH 2PO4 (25%) và

thành các mảnh ion mang điện tích. Sau đó, các ion này được đưa sang bộ phận
phân tích khối lượng để định tính và được định lượng.
B.G. Wolthers và các cộng sự [7] đã xác định oxalate bằng một số phương
pháp khác nhau như ID-MS, HPLC, GC cho thấy có thể sử dụng phương pháp GCMS với độ chính xác và lặp lại cao như là một phương pháp tiêu chuẩn để đánh giá
các phương pháp hiện có và mới phát triển.
Phương pháp sắc ký khối phổ đã được J. G. March và các cộng sự sử dụng để
xác định hàm lượng oxalate trong sỏi thận. Các bước tiến hành là: hòa tan của
13


oxalate trong sỏi thận bằng HCl, loại bỏ các cation bằng cách sử dụng nhựa trao đổi
cation, bốc hơi nước, pha loãng với ethyl acetate, tạo các este của axit oxalic
trimetylsilyl với chlorotrimethylsilane. Với việc xử lý mẫu hích hợp, phương pháp
này cũng đã được áp dụng cho mẫu nước tiểu và mẫu thực phẩm. Các kết quả thu
được: khoảng tuyến tính là 0,2-5,0 mg oxalate/l, giới hạn phát hiện 0,06 mg
oxalate /l, hệ số biến thiên của phương pháp 1,3%. Hai mươi bảy mẫu sỏi thận đã
được phân tích bằng phương pháp này. Kết quả hàm lượng trung bình của axit
oxalic trong sỏi axit uric là 0,11 mg/g (SD = 0,08, n = 13). Oxalate được tìm thấy
trong sỏi struvite với hàm lượng trung bình là 0,2 mg axit oxalic/g (SD = 0,13, n =
8). Trong sỏi đá hydroxyapatite, hàm lượng oxalate cao nhất, có thể lên đến 0,801
mg axit oxalic/g [24].
1.5.3. Phương pháp sắc ký ion
Sắc ký ion là kỹ thuật tách các cấu tử anion hay cation từ hỗn hợp qua cột sắc
ký dựa trên ái lực khác nhau của mỗi ion đối với pha tĩnh và pha động.
Để cung cấp thông tin cho quá trình chuẩn đoán và điều trị bệnh liên quan
đến chuyển hóa oxalate. Bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký ion, Hoppe B và
các cộng sự [10] đã xác định đồng thời oxalate, citrate và sulfate trong huyết tương
của các mẫu được lấy từ 50 trẻ sơ sinh và trẻ em (23 nam, 27 nữ độ tuổi từ 0,2 đến
17 tuổi) với chức năng thận bình thường. Máu được lấy vào ống Li-Heparin, đặt
trong nước đá. Sau khi lấy, mẫu máu ngay lập tức bảo quản bằng HCl với tỷ lệ

điện di mao quản vùng kết hợp với detector UV với độ lệch chuẩn tương đối (RSD)
nhỏ hơn 1%. Giới hạn phát hiện của các ion trong khoảng 0,006-1,072 mg/l. Phương
pháp có thể dễ dàng áp dụng xác định đồng thời 11 anion trong đó có oxalate,
tartrate và citrate trong các mẫu nước giải khát và mẫu thực phẩm với thời gian phân
tích ngắn và độ nhạy tốt.
Trong nghiên cứu của Michael Trevaskis V. Craige Trenerry [12], việc phân
tích được thực hiện bằng cách sử dụng một máy điện di mao quản loại Isco Mode1 3
140 Electropherograph (Isco Inc., Lincoln, NE, USA) hoạt động ở -20 kV và ở 28
°C với mao quản 75 cmx75 id (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, USA) có
chiều dài hiệu dụng là 50cm. Chất phân tích được phát hiện bằng cách sử dụng kỹ
thuật hấp thụ gián tiếp. Giữa mỗi lần phân tích mao quản được rửa trong 2 phút
bằng dung dịch đệm chứa 10% methanol, 10 mM natri cromat tetrahydrate và 4 mM
15


OFM Anion-BT. Giới hạn định lượng đạt được là 0,01g/100 g. Nghiên cứu này
được áp dụng để xác định axit oxalic trong rau và một số loại đồ uống.
Một nghiên cứu đáng tin cậy khác của Corinne Rivasseau [8] sử dụng
phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) với detector UV đã định lượng được
axit citric, malic, succinic, oxalic, formic, fumaric, acetic, và phosphoric chứa trong
thực vật với thời gian tích ngắn trong khi vẫn giữ độ phân giải tốt bằng cách tối ưu
chiều dài mao quản, điện áp tách, thành phần và pH của dung dịch đệm. Quá trình
phân tích được thực hiện trong một mao quản không tráng silica, chiều dài hiệu
dụng 30cm, đảo ngược dòng điện di thẩm thấu và thế điện di là -30 kV. Dung dịch
đệm chứa 3.10-4 mol/L tetradecyltrimethylammonium và 10- 2 mol/L trimellitate pH
= 9,0. Quá trình tách đạt được trong 100s. Khoảng tuyến tính đối với oxalate từ
6.10- 5 đến 10- 3 mol/L.
1.6. Phương pháp điện di mao quản
Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác
nhau của các phân tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất

Như vậy độ linh động điện di tỉ lệ thuận với điện tích của ion chất phân tích
và tỷ lệ nghịch với độ nhớt η của dung dịch pha động điện di và độ lớn (bán kính
hydrat r) của ion chất phân tích.
1.6.1. Mao quản

Mao quản là một bộ phận quan trọng trong phương pháp điện di mao quản.
Đây chính là một trong các yếu tố quyết định sự điện di hỗn hợp của các chất mẫu.
Mao quản được chế tạo chủ yếu là silica được gọi là mao quản silica. Trong một số
trường hợp cũng có thể dùng mao quản teflon, khi mao quản silica không phù hợp,
ví dụ mẫu có ion F- và tách ở pH thấp [1].

Hình 1.2 Mặt cắt ngang của mao quản
•

Lớp điện kép trên thành mao quản và dòng điện di thẩm thấu

17


Trong quá trình điện di, lớp điện kép và thế của chúng (thế Zêta) xuất hiện ở
sát thành mao quản, nó phụ thuộc vào lực ion của dung dịch pha động điện di.

Hình 1.3 Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản
Dòng EOF di chuyển từ cực dương sang cực âm, dưới tác dụng của điện
trường, các cation di chuyển cùng chiều với dòng EOF do đó di chuyển nhanh hơn,
ngược lại các anion di chuyển ngược chiều với dòng EOF do đó di chuyển chậm
hơn còn các phần tử trung hòa không chịu tác động của điện trường nên di chuyển
cùng tốc độ với dòng EOF.

Hình 1.4 Ảnh hưởng của dòng EOF đến tốc độ của các ion trong quá trình điện di


Acetate

4,76

Bicin

8,25

Citrate

3,12; 4,76; 6,40

Tris

8,30

MES

6,13

TAPS

8,40

ACES

6,75

Borat


Histidine

1,78; 5,97; 8,97

HEPFS

7,51

Lysine

2,20; 8,90; 10,28

HEPPSO

7,9

Arginine

2,18; 9,09; 13,20

1.6.3. Nguồn điện thế cao

Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn thế V một chiều
nhất định đặt vào hai đầu mao quản. Thế V này tạo ra lực điện trường E và dòng
điện I trong mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất.
Trong điện di mao quản, điện thế V một chiều thường được dùng để đặt vào
hai đầu mao quản là từ 15 - 40 kV/1m, hay là từ 150 – 550 V/1cm mao quản. Tuy
nhiên, thế V được dùng phải làm sao không cho dòng điện I quá lớn trong mao
quản, dòng điện I này chỉ nên nằm trong vùng từ 10 – 75 µA. Việc chọn điện thế V

* Kĩ thuật bơm mẫu kiểu điện động học
Kĩ thuật này sử dụng lực điện khi áp thế cao (5 - 10 kV trong vài giây) để bơm
mẫu vào mao quản (Hình 1.5 C). Phương pháp bơm mẫu này cho kết quả các pic
phân tách có độ sắc nét cao. Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm rất lớn là

20


diện tích pic (dùng để định lượng) có độ lặp lại thấp với các nền mẫu khác nhau, do
đó thường chỉ dùng để định tính [1, 2].

1.7. Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc
(CE - C4D)
Trong phương pháp điện di mao quản, detector đo độ dẫn là một trong những
loại detector rất được chú ý, tuy có độ nhạy thấp hơn so với hai kĩ thuật điện hóa
khác nhưng lại có ưu điểm là detector đa năng có thể dùng cho rất nhiều loại chất
phân tích khác nhau. Detector này có thể thu nhỏ, thuận lợi khi kết hợp với các mao
quản có đường kính hẹp, thậm chí với các microchip mà không ảnh hưởng đến độ
nhạy và các tính chất khác của detector.
•

Giới thiệu chung
Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc (C 4D) với thiết kế hai điện cực đồng trục
xuất hiện lần đầu trên thế giới vào năm 1998. Dựa trên thiết kế này, năm 2002 nhóm
nghiên cứu của GS. Peter Hauser (khoa Hóa, trường đại học Basel, Thụy Sỹ) đã
phát triển thành công dòng sản phẩm C 4D với nguồn điện thế kích thích xoay chiều
cao (HV-C4D, 200V). Hãng điện tử eDAQ của Úc sau đó đã phối hợp cùng nhóm
nghiên cứu của GS.Peter Hauser để phát triển dòng sản phẩm C 4D thương phẩm dựa

•

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của luận văn là nghiên cứu xác định oxalate đồng thời với tartrate
và citrate trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng
detector đo độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE – C4D).
2.1.2. Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm:
• Khảo sát các điều kiện tối ưu cho việc xác định đồng thời oxalate, tartrate và citrate.
 Khảo sát thành phần dung dịch đệm điện di: thành phần, pH ứng với các nồng độ

đệm khác nhau, các chất hoạt hóa bề mặt mao quản (nếu cần),…
 Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị điện di: thế tách, thời gian bơm mẫu, chiều
cao bơm mẫu,…
 Khảo sát một số chất có thể gây ảnh hưởng đến việc xác định các chất phân tích
•



•

trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp CE-C4D
Đánh giá phương pháp nghiên cứu:
Xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn.
Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
Đánh giá độ chụm, độ đúng của phương pháp phân tích.
Áp dụng phân tích một sỗ mẫu thực tế như: bia lon, bia hơi, mì tôm gói, mẫu bia,
mẫu trà túi lọc và mẫu trà vỉa hè.


2.3.1.2.

Hóa chất dung môi
Cetyl trimetylamoni bromine (Fluka, 99%)
L- Arginine (C6H14N4O2) (Fluka, hàm lượng > 99,5%)
L- Histidine ( C6H9N3O2) ( Fluka, hàm lượng 99,5%)
Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Fluka, 99%)-Tris
Axit 2-(cyclohexylamino) ethanesunlfomic (Fluka, 99%)
24


2-(N-morphonlino)ethane sulfonic axit (Fluka, 99%)
Natri hydroxyd (NaOH), (PA, Merck, Đức)
Methanol (CH3OH), (PA, Merck, Đức)
Axit axetic (CH3COOH), (PA, Merck, Đức)
Nước siêu tinh khiết: là nước cất hai lần được lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết
có cột trao đổi cation, anion và màng lọc 0,2 µm.
2.3.1.3. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất
• Pha dung dịch chuẩn

Các dung dịch chuẩn oxalate, tartrate và citrate được pha nước siêu tinh
khiết có nồng độ ban đầu là 10-2M. Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC.
• Pha dung dịch đệm
Các dung dịch đệm điện di được cân và pha trực tiếp vào bình định mức
bằng nước siêu tinh khiết. Tất cả các dung dịch đều được rung siêu âm và chuẩn lại
giá trị pH trước khi sử dụng. Dung dịch đệm được pha mới hàng ngày.
2.3.2. Thiết bị dụng cụ
• Thiết bị
 Thiết bị phân tích sử dụng trong nghiên cứu là hệ CE-C 4D tự chế, bán tự động (hình