Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN KIM ĐÔNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ STEVIOSID VÀ
REBAUDIOSID A TỪ CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA)
LÀM CHẤT TẠO NGỌT TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC PHẨM

NĂM 2016

i


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong đề tài là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì
công trình nào khác.

Sự phân lập và tinh sạch rebaudiosid A được tiến hành bằng cách sử dụng
etanol để kết tủa. Tỷ lệ xirô và etanol là 1:2 đến 1:7 w/v, tốt nhất là 1:5.
Rebaudiosid A với 90,7-90,9% độ tinh khiết thu được. Steviosid và
rebaudiosid A là hai chất tạo ngọt không sinh năng lượng, không đắng, áp
dụng trong thực phẩm và dược phẩm.
Từ khoá: cỏ ngọt, chiết xuất, steviosid, rebaudiosid A , tinh sạch, phân lập

iii


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

ABSTRACT
The purpose of the study is to produce highly purified stevioside and
rebaudioside A from the extract of Stevia rebaudiana Bertoni plant use in
food and drugs. Stevia rebaudiana Bertoni leaves were dried and powdered
leaves being subjected to water extraction and the resulted extract is purified
using treatment with a base such as calcium hydroxide and then iron
chloride,

desalting,

decolorizing,

and


Trường Đại học Tây Đô

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................... ii
TÓM TẮT....................................................................................................iii
ABSTRACT.................................................................................................iii
MỤC LỤC .................................................................................................... v
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................... vi
DANH SÁCH BẢNG.................................................................................viii
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT..................................................................... ix
CHƯƠNG I GIỚI THIỆU .......................................................................... 1
1.1Đặt vấn đề.............................................................................................. 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................. 2
1.3 Nội dung nghiên cứu............................................................................. 2
CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................... 3
2.1 Lịch sử về cây Cỏ Ngọt......................................................................... 3
2.2 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Cỏ Ngọt.................................. 3
2.3 Thành phần hóa học của cây cỏ ngọt ..................................................... 7
2.4 Hoạt tính sinh học. ................................................................................ 9
2.5 Các phương pháp chiết mẫu thực vật................................................... 11
CHƯƠNG III NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..15
3.1 Nguyên liệu nghiên cứu ...................................................................... 15
3.1.1 Nguyên liệu thí nghiệm ................................................................. 15
3.1.2 Hóa chất, chất chuẩn .................................................................... 15
v


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015


tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.2 Cây Cỏ Ngọt ....................................Error! Bookmark not defined.
Hình 2.3 Công thức hóa học của steviosid, thành phần chính được tìm thấy
trong lá của cây Cỏ Ngọtvà một số thành phần khác có liên quan. ................. 8
Hình 3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ lá nước thích hợp trong quá
trình chiết ..................................................................................................... 17
Hình 3.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ và thời gian thích hợp trong
quá trình chiết .............................................................................................. 19
Hình 3.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập, tinh sạch steviosid và
rebaudiosid A ............................................................................................... 22
Hình 4.1 Khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu................................ 25
Hình 4.2 Khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích ................... 26
Hình 4.3.1 Sắc ký đồ chuẩn steviosid ........................................................... 28
Hình 4.3.2 Sắc ký đồ mẫu steviosid.............................................................. 29
Hình 4.3.3 Sắc ký đồ chuẩn rebaudiosid A ................................................... 33
Hình 4.3.4 Sắc ký đồ mẫu rebaudiosid A...................................................... 31
Hình 1 Lá Cỏ Ngọt ....................................................................................... 50
Hình 2 Cột Amberlite................................................................................... 50
Hình 3 Dịch sau khi qua Amberlite .............................................................. 51
Hình 4 Bếp cách thủy ................................................................................... 51
Hình 5 Hỗn hợp glucosid.............................................................................. 52
Hình 6 Steviosid……………………………………………………………..52

vii



µm

micromet

mg/L

milligram trên lít

mL

millilit

nm

nanomet

% (v/v)

phần trăm thể tích trên thể tích

RT

thời gian lưu

UV – Vis

đầu dò tử ngoại khả kiến

RPF

nhưng người ta rất e ngại khi sử dụng vì chúng có thể gây ảnh hưởng xấu đến
sức khoẻ con người về lâu về dài. Qua một số nghiên cứu cho thấy saccharin
gây ung thư bàng quang ở chuột. Vì vậy saccharin đã bị cấm sử dụng ở một
số quốc gia. Trước các nguy hại của đường hoá học, tâm lý chung của người
tiêu dùng là muốn tìm lại sản phẩm đường tự nhiên ly trích từ thực vật. Cây
Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni) là loại thảo dược có nguồn gốc từ Nam
Mỹ, lá cây Cỏ Ngọt có chứa các chất ngọt tự nhiên như steviosid (4-13% trên
trọng lượng khô), rebaudiosid A (2-4%), rebaudiosid C, rebaudiosid B (1–
2%), rebaudiosid D, rebaudiosid E và dulcosid A (0,4–0,7%) (Kinghorn et al.,
1991).Trong đó độ ngọt của rebaudiosid A gấp 250 – 450 lần so với đường
mía và steviosid khoảng 300 lần so với đường mía (Cramer et al.,1986). Chất
tạo ngọt chứa trong cây Cỏ Ngọt là loại chất tạo ngọt không sinh năng lượng.
Ngoài ra, chất tạo ngọt trong cây Cỏ Ngọt còn điều trị được bệnh tiểu đường,
hạ đường huyết (Lailerd et al.,2004), béo phì, sâu răng, tăng huyết áp
(Dyrskog et al., 2005), kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng viêm
(Ghosh et al., 2008). Đặc biệt trong cây Cỏ Ngọt có hai loại chất tạo ngọt
steviosid và rebaudiosid A với độ ngọt cao và chiếm hàm lượng lớn nhất.Từ

1


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

những lợi ích to lớn đó đã dẫn đến nhu cầu con người muốn sử dụng sản
phẩm chất tạo ngọt tự nhiên, đặc biệt là hai loại chất tạo ngọt steviosid và
rebaudiosid A. Do đó việc ly trích và tinh sạch để có hai loại chất tạo ngọt

được steviosid. Steviosid là hợp chất tinh thể màu trắng có độ ngọt rất cao.Từ
đó Cỏ Ngọt được sử dụng như một chất làm ngọt ở Anh trong thế chiến II.
Nhật Bản đã sử dụng Cỏ Ngọt để thay thế cho saccharin sau khi nó bị cấm sử
dụng vào những năm của thập niên 70 và chất ngọt từ Cỏ Ngọt được tiêu thụ
tại Nhật Bản với số lượng rất lớn so với bất kỳ quốc gia nào khác. Tại Bắc
Mỹ và Châu Âu, Cỏ Ngọt bắt đầu được sử dụng như là sản phẩm thảo dược
và có sẵn trên thị trường vào những năm 1970 và 1980. Cỏ Ngọt đã được
chiết xuất và cho phép sử dụng ở Mỹ vào năm 1994.
2.2 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Cỏ Ngọt
2.2.1 Thực vật học (Đỗ Huy Bích et al., 2004)
Tên khoa học: Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley.

Hình 2.2 Cây Cỏ Ngọt

3


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

Họ: Cúc (Asteraceae).
Cây thảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5 - 0,6 m và có khi cao tới 1m. Thân
cứng mọc thẳng, có rãnh dọc và nhiều lông mịn, ít phân nhánh.Lá mọc đối,
hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn dài 5 -7 cm, rộng 1 1 , 5 cm, có 3 gân, 4-6 đôi răng nhọn ở phần nửa về phía đầu lá, hai mặt có
lông trắng mịn, nhấm lá thấy có vị ngọt rất đậm, cuống lá rất ngắn. Hoa
lưỡng tính, tụ họp thành đầu màu trắng ở ngọn. Quả bế, không có mào lông,
hạt không có nội nhũ. Mùa hoa khoảng tháng 5-9

2.2.4.4 Tác dụng kháng khuẩn
Cao lá Cỏ Ngọt có tác dụng đối với Pseudomonas aeruginosa và Proteus
vulgaris. Chưa thấy tài liệu công bố về tác dụng trên các vi khuẩn
Streptococcus inutans, Lactobacillus plantarum và Lactobacillus casei là
những vi khuẩn có liên quan đến quá trình sún răng ở trẻ em, vì hiện nay có
dùng steviosid thay thế đường trong chế biến bánh kẹo.
2.2.4.5 Liều dùng an toàn ở người
Nồng độ steviosid trong một số nước giải khát ở Nhật Bản là 0,005 - 0,007%.
Nếu một ngày uống 1 lít thì lượng steviosid đưa vào cơ thể là 0,05 - 0,07g
tương ứng với khoảng lg lá Cỏ Ngọt. Điều đó có thể được chấp nhận vì là liều
an toàn, đã được Nhà nước Nhật cho phép.
2.2.4.6 Độc tính cấp: Cho chuột uống steviosid với liều 2g/kg không thấy có
chuột chết và cũng không thấy có biểu hiện độc sau 2 tuần theo dõi.
2.2.4.7 Độc tính bán cấp: Cho chuột cống trắng ăn với liều dùng hàng ngày
0,5g/kg trong 56 ngày, các thông số theo dõi gồm cân nặng, các chỉ tiêu huyết
học, các chỉ tiêu hoá sinh và xét nghiệm tổ chức học gan đều bình thường.
2.2.4.8 Độc tính trên thận:
Thí nghiệm trên chuột cống trắng, liều cao steviosid có thể gây độc với thận,
làm tăng urê và creatinin huyết thanh.Tiêm tĩnh mạch cho chuột cống trắng,
liều 0,4; 0,8; 1,2; l,6g/kg rồi theo dõi độ thanh thải của một số chất có so sánh
với lô đối chứng, thấy từ liều 0,8g/kg trở lên độ thanh thải inulin không thay
đổi, chứng tỏ chức năng lọc cầu thận không bị ảnh hưởng. Độ thanh thải của
glucose tăng, chứng tỏ chức năng tái hấp thu của ống lượn gần bị suy giảm,
5


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015



Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

Ngọt), ngày 4 lần, uống nhiều ngày. Ngoài ra Cỏ Ngọt và steviosid còn chữa
béo phì do có vị ngọt sẽ làm giảm nhu cầu chất đường và chất bột của cơ thể,
nên cũng có tác dụng chữa béo phì. Liều dùng 0,5 - lg steviosid chia ra 3 - 4
lần trong ngày, uống nhiều ngày. Lá Cỏ Ngọt hoặc steviosid thường dùng làm
chất điều vị cho các loại trà thuốc, trà túi lọc tỷ lệ lá Cỏ Ngọt hoặc steviosid
trong đó thường thấp. Tại Việt Nam, cũng đã có một số chế phẩm trà thuốc có
Cỏ Ngọt như trà actisô - stevia. Trà sâm quy - stevia có sâm khu 5, tam thất,
đương quy, thục địa, táo, long nhãn, ngũ gia bì và Cỏ Ngọt.Trà nhân trần,
thảo quyết minh, Cỏ Ngọt.Trà túi lọc Sotevin có dừa cạn, hoa cúc, hoa hoè và
Cỏ Ngọt. Chữa cao huyết áp hàng ngày uống trà sotevin. Dùng thay thế
đường sacharose trong công nghiệp thực phẩm để làm chất điều vị cho bánh
mứt kẹo, nước giải khát.
2.3 Thành phần hóa học của cây cỏ ngọt
Trong các loại đường thay thế, chất ngọt tự nhiên đã được xem xét rất nhiều
bởi các nhà nghiên cứu và đường trong cây Cỏ Ngọt được giả định là nguồn
chất tạo ngọt tự nhiên chính. Một loạt các loài cây Cỏ Ngọt đã được nghiên
cứu bởi các nhà hóa sinh và công nghệ sinh học về các thành phần hóa học
của cây Cỏ Ngọt và chỉ ra có khoảng 110 loài, trong đó có 18 loài có tính
năng tốt (Soejarto et al.,1982). Steviosid là một thành phần chính trong cây
Cỏ Ngọt và steviosid chứa nhiều nhất trong lá của cây Cỏ Ngọt (Geuns,
2003). Cùng với steviosid, một số hợp chất ngọt khác như steviobiosid,
rebaudiosid A, B, C, D, E và dulcosid A cũng đã được tìm thấy trong lá của
Cỏ Ngọt (Savita et al.,2004). Việc xây dựng cấu trúc của các dẫn xuất

Ngọt và độ ngọt so với đường sucrose (Cramer et al., 1986 ), (Geuns, 2003)
Hợp chất

Chuỗi R1

Độ ngọt so với
sucrose

Chuỗi R2

Stevioside

β - Glc

β-Glc-β-Glc (2

Steviolbioside

H

β - Glc - β - Glc (2

1)

β - Glc - β - Glc (2

1)

Rebaudioside A



β - Glc - β - Glc (2

β - Glc - β - Glc (2

Dulcoside A

β - Glc

1)

1)

250-450
β - Glc – (3

Rebaudioside E

100-125

250-50

1)

β - Glc - β - Glc (2

Rebaudioside C

300



Trường Đại học Tây Đô

(Hagiwara et al.,1984), nghiên cứu tác dụng gây ung thư của steviosid trên
bàng quang thấy rằng không có tiền ung thư hoặc ung thư.
Dịch chiết cũng như các chất tách được từ Cỏ Ngọt có tác dụng mạnh
trong việc điều khiển quá trình chuyển hoá glucose và insulin trong cơ thế.
Theo Chen et al., 2005, khi sử dụng steviosid với liều 0,5 mg/kg sẽ làm giảm
lượng đường glucose trong máu đồng thời hạn chế sự kháng insulin ở chuột
bị tiểu đường. Tác giả Ferreira cũng chỉ ra rằng dịch chiết nước Cỏ Ngọt (20
mg/kg/ngày) cũng có tác dụng làm ức chế quá trình chuyến hoá glucose trong
gan trên chuột thí nghiệm (Arayjo et al.,2006). Trước đó vào năm 1986, Curi
đã thử nghiệm tác dụng của dịch chiết nước Cỏ Ngọt trên một nhóm người
tình nguyện. Kết quả cho thấy với dịch chiết 5 g lá dùng liên tục trong 3 ngày,
hàm lượng đường glucose trong huyết tương giảm rõ rệt (Curi et al.,1986).
Các nghiên cứu này mở ra khả năng ứng dụng Cỏ Ngọt trong việc chữa trị
bệnh tiểu đường và các bệnh liên quan đến sự chuyển hoá glucose. Ngoài ra,
cùng với tác dụng giảm đường huyết, steviosid còn có tác dụng hạ huyết áp
trên lô chuột bị tiểu đường (Xiao et al., 2003).
Tác dụng chống ung thư và chống viêm của Cỏ Ngọt cũng được nghiên
cứu chi tiết trên mô hình chuột thí nghiệm gây u bằng 12-0tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA). Các hợp chất tách được từ cây này
gồm steviosid, rebaudiosid A và C, và dulcosid A ức chế mạnh quá trình gây
viêm đồng thời hỗn hợp các hợp chất này ngăn ngừa tốt sự hình thành ung
thư da trên chuột với liều 1,0 và 0,1 mg/con (Yasukawa et al.,2002).
Hợp chất steviosid còn được sử dụng trong trị liệu chữa tiêu chảy hiệu
quả. Khởi nguồn từ kết quả nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn và kháng virút
của dịch chiết nóng cây Cỏ Ngọt cho thấy tác dụng diệt mạnh chủng E. coli là
nguyên nhân gây ra bệnh ỉa chảy (Tomita et al.,2002). Các nghiên cứu tiếp
sau đó khẳng định tác dụng và khả năng ứng dụng rất cao của Cỏ Ngọt cũng
10

nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy.
Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước
khi sử dụng. Nếu chúng có lẫn các chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệu
quả và chất lượng của quá trình chiết. Thường có một số chất dẻo lẫn trong

11


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat.
Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong
khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.
Metanol và chloroform thường chứa dioctylphtalat [di-(2- etylhexyl)
phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân
lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử
nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chloroform, metylen
clorit và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình
chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa...
Những tạp chất của chloroform như CH2C12, CH2ClBr có thể phản ứng
với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm
khác. Tương tự như vậy sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng có
thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất
khác. Vì chloroform có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được
thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc.
Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chloroform.

Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình
phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể
tạo thành những sản phẩm mong muốn. Sự hiểu biết về những đặc tính của
những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ
đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết tránh được sự phân huỷ
chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn. Sau khi chiết dung
môi được cất ra bằng máy cô quay ở nhiệt độ không quá 30-40ỏC, với một
hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
2.5.2 Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết soxhlet.
- Chiết sắc với dung môi nước.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất
trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời
13


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để
điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi, dung môi
có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây,
máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng

- Acetonitrile (99,9 %), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)
- Etanol (99,9%), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)
- Steviosid hydrate (98%), (Sigma – Aldrich)
- Rebaudiosid A (96%),(Sigma – Aldrich)
- Amberlite FPC23 H (Sigma – Aldrich)
- Amberlite FPA51 (Sigma – Aldrich)
- Amberlite FPA98Cl (Sigma – Aldrich)
- Ca(OH)2(96%), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)
- FeCl3 (98%)(Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)
- Nước khử ion
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ
- Sắc ký lỏng cao áp (HPLC, 20A, Shimadzu, Nhật)
- Thiết bị lọc nước khử ion (TKA, Thermo Fisher scientific, Mỹ)
- Thiết bị đun cách thuỷ (Thermo Haake V15, Mỹ)
- Cân phân tích (Sartorius, MC 210S, Đức)

15


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

- Tủ sấy (Memmert, Đức)
-

Lọc polysulfone (Liumar Technologies, Ottawa, Canađa)