BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
----------

NGUYỄN THỊ TRANG

ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ
ĐƯỜNG RUỘT (STa, STb VÀ LT) CỦA VI KHUẨN
E. COLI PHÂN LẬP TỪ LỢN CON BỊ TIÊU CHẢY

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

NHA TRANG – 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
----------

NGUYỄN THỊ TRANG

ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ
ĐƯỜNG RUỘT (STa, STb VÀ LT) CỦA VI KHUẨN
E. COLI PHÂN LẬP TỪ LỢN CON BỊ TIÊU CHẢY

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


khích lệ em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này.
Nha Trang, ngày 11 tháng 7 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Trang

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................................ i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................................. v
DANH MỤC BẢNG............................................................................................................... vi
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ........................................................................................................ vii
ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN................................................................................................... 4
1.1. Tổng quan về vi khuẩn E. coli.................................................................................... 4
1.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn E. coli............................................................................. 4
1.1.2. Phân loại ................................................................................................................ 4
1.1.3. Đặc điểm hình thái E. coli và tính chất bắt màu .............................................. 6
1.2. Tổng quan về nhóm ETEC ......................................................................................... 8
1.2.1 Các yếu tố gây bệnh của nhóm ETEC................................................................ 8
1.2.1.1. Yếu tố bám dính (colonization-CF) ........................................................... 8
1.2.1.2. Các loại độc tố đường ruột........................................................................10
1.2.2. Cơ chế gây bệnh của ETEC ..............................................................................16
1.3. Một số nghiên cứu về vai trò của các độc tố đường ruột trong bệnh tiêu chảy ở
lợn ........................................................................................................................................17
1.3.1. Nghiên cứu trong nước......................................................................................17
1.3.2. Nghiên cứu trên thế giới....................................................................................18

LT) của vi khuẩn ETEC phân lập từ lợn con bị tiêu chảy ............................................44
Phụ lục 4: Trình tự nucleotide gen eltAB của 10 chủng ETEC khảo sát ....................50
Phụ lục 5: Trình tự nucleotide gen estA của 10 chủng ETEC khảo sát ......................54
Phụ lục 6: Trình tự nucleotide gen estB của 10 chủng ETEC khảo sát ......................55

iii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AIEC

: Adherent Invasive E. coli

CFA

: Colonization factor antigen (yếu tố bám dính)

Cs

: Cộng sự

DAEC : Diffusely adherent E. coli
DNA

: Deoxyribonucleid acid

E. coli : Escherichia coli
EAEC : Enteroaggregative E. coli
EHEC : Enterohaemorrhagic E. coli
EIEC

FAO

: Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp của Liên hợp quốc

F4, F5, F6, F18,…

: yếu tố bám dính

GM1

: Ganglioside (Thụ thể trên tế bào biểu mô niêm mạc ruột)

hlt

: Human heat labile toxin

LT

: Heat labile toxin

PCR

: Polymerase Chain Reaction

plt

: Porcine heat labile toxin

ST


Bảng 2.2 Các thành phần của phản ứng multiplex-PCR (25μl/ phản ứng).................... 22
Bảng 2.3 Chu trình nhiệt trong phản ứng multiplex-PCR................................................ 22
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát sự lưu hành của các gen mã hóa độc tố STa, STb, LT của
E. coli phân lập từ lợn con bị tiêu chảy .................................................................. 24
Bảng 3.2. Kết quả tổ hợp gen mã hóa độc tố STa, STb và LT của các chủng ETEC
phân lập từ lợn con bị tiêu chảy ............................................................................... 28
Bảng 3.3. Mức độ tương đồng nucleotide và acid amin của gen estA giữa các chủng vi
khuẩn ETEC phân lập từ lợn con bị tiêu chảy ....................................................... 30
Bảng 3.4. Mức độ tương đồng nucleotide và acid amin của gen estB giữa các chủng vi
khuẩn ETEC phân lập từ lợn con bị tiêu chảy ....................................................... 31
Bảng 3.5. Mức độ tương đồng nucleotide và acid amin của gen eltAB giữa các chủng
vi khuẩn ETEC phân lập từ lợn con bị tiêu chảy................................................... 33

vi


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1 Sự phân bố của các gen mã hóa độc tố STa, STb, LT của E. coli .........25
Biểu đồ 3.2 Tổ hợp gen mã hóa độc tố STa, STb và LT của các chủng ETEC phân lập
từ lợn con bị tiêu chảy...........................................................................................28

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................20

vii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Chăn nuôi lợn là ngành có vị trí hàng đầu trong ngành chăn nuôi ở nước ta và đang
có sự phát triển mạnh mẽ. Theo số liệu thống kê của FAO (2013), tổng đàn lợn trên thế


hội nhập sâu rộng hiện nay, ngành chăn nuôi trong nước sẽ tiếp tục phải đối mặt với
nhiều khó khăn và mức độ cạnh tranh với sản phẩm nhập khẩu ngày càng khốc liệt hơn,
nhất là sự cạnh tranh của các nước trong khu vực ASEAN, khi mà Cộng đồng Kinh tế
ASEAN được thành lập. Vì vậy sản phẩm chăn nuôi phải sạch là điều kiện bắt buộc nếu
muốn phát triển chăn nuôi. Do vậy việc phòng bệnh bằng vaccine là một biện pháp vừa
hiệu quả vừa an toàn đáp ứng được yêu cầu của người chăn nuôi.
Đối với bệnh tiêu chảy ở lợn do các chủng vi khuẩn ETEC thì độc tố đường ruột
đóng vai trò cực kỳ quan trọng, chúng phải được sử dụng như là những kháng nguyên
để phòng bệnh tiêu chảy. Tuy nhiên một vấn đề phức tạp đặt ra hiện nay đó là sự đa
dạng về kháng nguyên của các chủng vi khuẩn ETEC gây bệnh (Lasaro và cs, 2008).
Theo các nghiên cứu trước, gen mã hóa độc tố STa và STb được tìm thấy ở các chủng
ETEC là hoàn toàn giống nhau. Tuy nhiên, chỉ có một biến thể mới của gen mã hóa độc
tố STb trong nghiên cứu của Christine Taillon và cs (2008) được tìm thấy, đó là sự thay
đổi acid amin Histidine ở vị trí 12 thành acid amin Asparagine. Theo Lasaro và cs năm
2008, có 16 kiểu gen khác nhau mã hóa cho độc tố LT được tìm thấy trong số 51 chủng
vi khuẩn ETEC phân lập từ người. Trình tự gen mã hóa độc tố LT của 52 chủng vi
khuẩn ETEC phân lập từ lợn có một số điểm khác nhau, những điểm khác nhau này liên
quan đến khả năng bám của độc tố lên GM1 của tế bào và độc lực của chúng (Chengxian
Zhang và cs, 2009).
Tại Việt Nam mặc dù đã có một số công trình nghiên cứu về sự lưu hành của gen
mã hóa độc tố đường ruột ở các chủng vi khuẩn phân lập từ lợn bị tiêu chảy. Như nghiên
cứu của Lý Thị Liên Khai năm 2001 đã phân lập và xác định độc tố các chủng E. coli
gây bệnh tiêu chảy cho lợn con ở Cần Thơ và Hồ Chí Minh. Kết quả phát hiện 70/84
chủng có khả năng sản sinh độc tố STb - chiếm tỷ lệ lớn nhất, sau đó đến STa (57/84
chủng) và LT (40/84 chủng ); Bằng phương pháp phân tích PCR, Võ Thành Thìn (2012)
tìm ra 184 chủng E. coli phân lập từ lợn con bị tiêu chảy ở Tây Nguyên và Nam Trung
Bộ, phát hiện 40,76% chủng vi khuẩn mang gene mã hóa độc tố STb, tiếp theo là độc tố
STa (30,43%), độc tố LT (28,26% )…..Tuy nhiên, chưa có một công trình nào so sánh
trình tự gen mã hóa các loại độc tố đường ruột này. Do đó chúng tôi tiến hành thực hiện

cảnh khỏe mạnh số lượng vi khuẩn E. coli rất thấp. Ngoài ra vi khuẩn này cũng được
tìm thấy nhiều trong môi trường, bụi bẩn và rác thải. Mặc dù hầu hết các chủng vi khuẩn
E. coli được coi là vi khuẩn thường trực trong đường tiêu hóa và không gây bệnh hoặc
là vi khuẩn cơ hội. Bên cạnh đó một số chủng vi khuẩn mang những yếu tố độc lực
được xem là những tác nhân gây bệnh ở người và động vật (Gyles và Fairbrother, 2010;
Fairbrother và cs, 2005)
1.1.2. Phân loại
Vi khuẩn E. coli là một trực khuẩn Gram âm, không hình thành bào tử và được
phân loại như sau:
Giới: Bacteria,
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Giống: Escherichia
Loài: Escherichia coli
Gần đây giống Escherichia có 5 loài là E.albetii, E. coli, E.fergusonii, E.hermannii
và E.vulneris. Có 2 loài cũng thuộc giống này là E.edecarbocilata và E.blattae đã được
phân vào giống khác. Trong các loài kể trên phổ biến nhất là vi khuẩn E. coli.
4


Trước đây, E. coli gây bệnh đường ruột được chia thành 6 phân nhóm dựa trên khả
năng gây bệnh của chúng (yếu tố độc lực, dấu hiệu lâm sàng và cơ chế gây bệnh): EPEC,
EHEC, ETEC, EAEC, EIEC và DAEC (Kaper và cs, 2004). Gần đây đã xuất hiện thêm
hai nhóm mới, đó là AIEC được cho là có liên quan với bệnh Crohn, nhưng không sinh
ra tiêu chảy và STEC (Clements và cs, 2012).
EPEC: Mang kháng nguyên bám dính, có khả năng tấn công lên niêm mạc ruột
non, phá hủy lớp tế bào biểu mô ruột nhưng không sản sinh độc tố, gây viêm ruột kèm
sốt và tiêu chảy. Vi khuẩn thuộc nhóm này thường gây bệnh tiêu chảy ở người, thỏ, chó,

Vi khuẩn E. coli bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu. Nếu
lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhầy để nhuộm có thể thấy giáp mô, còn khi soi tươi sẽ không
thấy được. Dưới kính hiển vi người ta có thể phát hiện được cấu trúc pili- một yếu tố
bám dính của vi khuẩn E. coli lên tế bào niêm mạc ruột (Pizarro-Cerda và Cossart, 2006)
 Đặc tính nuôi cấy
E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, nhiệt độ nuôi cấy tối ưu là 37 0C
(98,6 0F), tuy nhiên cũng có trường hợp E. coli sinh trưởng ở nhiệt độ cao tới 49 0C
(120,2 0F), pH thích hợp 6,4-7,5 (tối ưu là 7,2-7,4 ) (Lê Thanh Bình, 2012).
Trên môi trường EMB (Eosin Methylen Blue), khuẩn lạc của E. coli có màu đỏ
tím, có ánh kim.

6


Trên môi trường nước thịt vi khuẩn phát triển tốt, môi trường rất đục, có cặn màu
tro lắng xuống đáy, đôi khi có màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi
phân thối (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997)
Trên môi trường NA (Nutrient Agar), TSA (Tripticase Soy Agar) qua 18-24h ủ ở
37 0C hình thành những khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, đường
kính 2 - 3mm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1974)
Trên môi trường thạch máu, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không
gọn, màu sáng, một số chủng có vòng dung huyết xung quanh, sau 24h nuôi cấy ở 37 0C
Trên môi trường thạch thường, sau 12-18h ở nhiệt độ 35-370 C, vi khuẩn hình thành
khuẩn lạc tròn, lồi, không trong suốt, bóng láng
Trên môi trường MacConkey: Sau 24h nuôi cấy ở 37 0C, vi khuẩn hình thành khuẩn
lạc màu đỏ hồng, tròn, bóng, không nhầy, rìa gọn được bao quanh vòng đục. Một số
chủng vi khuẩn không lên men đường lactose thì khuẩn lạc sẽ có màu nhạt (Nguyễn
Như Thanh và cs, 1997).
 Đặc tính sinh hóa
Vi Khuẩn E. coli có khả năng lên men sinh hơi các loại đường Lactose, Fructose,

1.2. Tổng quan về nhóm ETEC
Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy phổ
biến ở lợn con trước cai sữa và sau cai sữa, gây thiệt hại đáng kể cho nền kinh tế các
nước trên thế giới (Nagy và Fekete, 1999). Để gây bệnh, vi khuẩn ETEC bám chặt vào
các thụ thể trên bề mặt tế bào biểu mô ruột nhờ vào các yếu tố bám dính như F4 (K88 ),
F5 (K99 ), F6, F18, F41; sau đó sản sinh một hay nhiều độc tố ruột, bao gồm độc tố chịu
nhiệt (STa, STb) và độc tố không chịu nhiệt (LT) (Gyles Faibrother, 2010).
1.2.1 Các yếu tố gây bệnh của nhóm ETEC
Các chủng ETEC gây tiêu chảy cho động vật nhờ 2 yếu tố độc lực cơ bản là: kháng
nguyên bám dính có trên bề mặt vi khuẩn như F4, F5, F6, F17, F18, F41 và độc tố đường
ruột (STa, STb và LT)
1.2.1.1. Yếu tố bám dính (colonization-CF)
Yếu tố bám dính là các yếu tố gây độc quan trọng của các chủng E. coli gây bệnh
đường ruột. Nhờ các yếu tố bám dính có trên bề mặt, vi khuẩn E. coli mới có khả năng
bám và xâm nhiễm vào ruột non của vật chủ để gây bệnh (Mulvey, 2002). Hầu hết các
yếu tố bám dính đều được tìm thấy trên các vi khuẩn đường ruột và được gọi là fimbriae.
Fimbriae là những cấu trúc liên kết có tính đa phân tử, khả năng miễn dịch cao và có
khả năng liên kết với các thụ thể đặc hiệu (Sellwood và cs, 1975). Fimbriae cũng có thể

8


chứa nhiều bản sao của tiểu đơn vị nhỏ, một trong số đó có thể là yếu tố mang đặc trưng
bám dính.
Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu
kỹ. Để gây tiêu chảy, đầu tiên ETEC phải bám dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông
trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố bám dính (CF hay CFA)
Danh pháp của fimbriae chưa được tiêu chuẩn hóa và được đặt tên dựa trên các
tiêu chí như: nguồn gốc chủng (F44, 987P, F107), cấu trúc (K88, K99) và chức năng
bám dính (CFA). Các yếu tố bám dính phổ biến có trên bề mặt vi khuẩn E. coli đã được

bệnh phù (ED). Còn F18ac thì biểu hiện hiệu quả hơn ở invitro, invivo. Lợn sơ sinh
không có thụ thể đối với F18, do đó chúng không có khả năng kháng với F18. Tuy
nhiên, lợn cai sữa dễ bị hơn do sự gia tăng của các thụ F18 (Gyles và Fairbrother, 2004).
Vì vậy F18 của E. coli phổ biến nhất ở lợn cai sữa (Chen và cs, 2004).
F41 Fimbriae: Được mã hóa bởi gen hiện diện trên nhiễm sắc thể và được tìm thấy
ở cả trâu, bò và các chủng ETEC gây bệnh ở lợn. Nó chủ yếu được thể hiện cùng với
K99 fimbriae trên ETEC của kháng nguyên O nhóm 9 và 101, mặc dù một số chủng,
chủ yếu là từ lợn, có thể sản xuất F41 một mình. F41 bám dính ở phía sau ruột non ở
lợn sơ sinh và bê có thể dẫn đến tiêu chảy, cho dù K99 fimbriae có mặt hay không
(Gyles và Fairbrother, 2004).
F17 fimbriae: F17 là fimbriae chủ yếu trên chủng ETEC ở bò. Bốn biến thể gen a,
b, c, d đã được mô tả dựa trên sự khác biệt trong tiểu đơn vị chính F17. F17 cũng đã
được tìm thấy trên các chủng ETEC bò, mặc dù vai trò của nó trong tiêu chảy do các
chủng ETEC chưa được làm sáng tỏ (Mainil và cs, 2000).
1.2.1.2. Các loại độc tố đường ruột
 Độc tố kém chịu nhiệt (Heat-labile enterotoxin LT)
-

Cấu trúc
Độc tố LT được sản xuất bởi các chủng vi khuẩn ETEC có cấu trúc và chức năng

tương đối giống với độc tố CT (cholera enterotoxin) được sản xuất bởi các chủng vi
khuẩn Vibrio cholerae. Độc tố LT có trọng lượng phân tử khoảng 84 kDa, có dạng độc
tố AB5 với 1 tiểu phân tử A (có trọng lượng 28kDa) kết hợp không cộng hóa trị (noncovenlent) với 5 tiểu phân tử B (trọng lượng 11,5kDa). Trong đó tiểu phân tử A chịu
trách nhiệm cho phần hoạt động enzym của độc tố và nó bị phân cắt bởi enzym protease
để tạo thành 2 chuỗi peptide là A1 (21kDa) và A2 (9kDa). Hai chuỗi peptide A1 và A2
liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide giữa A1-Cys187 và A2-Cys199. Chuỗi A2 tạo
thành cái móc liên kết không đồng hóa trị giữa tiểu đơn vị A và lỗ hổng giữa của vòng
5 tiểu phân tử B (Fairbrother và cs, 2005; Liu, 2014). Chuỗi A1 của tiểu phân tử A là
10

như GM2 và một số glycoprotein có ở ruột (Fukuta và cs, 1988; Teneberg và cs, 1994;
Backstrom và cs, 1997).
LTII: Có trọng lượng phân tử tương tự LTI nhưng nó có đặc tính kháng nguyên
khác với LTI và CT. Về mặt cấu trúc, tiểu phân tử A của độc tố LTII tương đồng 57%
với độc tố LTI , tuy nhiên tiểu phân tử B của 2 biến thể này hoàn toàn khác nhau. Những
nghiên cứu trước đây người ta cho rằng nhóm độc tố LTII có 2 biến thể là LT-IIa
(Pickett và cs, 1987) và biến thể LT-IIb. Hai biến thể này tương đồng với nhau 71% ở
tiểu phần A và 66% ở tiểu phân tử B. Gần đây một số tác giả còn cho thấy một biến thể
mới LT-IIc được mô tả từ chủng ETEC phân lập từ đà điểu bị bệnh và biến thể này ít
độc hơn so với LT-IIa và LT-IIb (Nardi và cs, 2005, Nawar và cs, 2010). Bởi vậy cho
đến hiện tại có 3 biến thể của LT-II đã được phát hiện. Tuy nhiên vai trò gây bệnh của
LT-II thì vẫn còn hạn chế được nghiên cứu (Fukuta và cs, 1988).
Các gen mã hóa độc tố LT hầu như giống hệt nhau về trình tự giữa các chủng ETEC
ở lợn. Chỉ có nucleotide mã hóa hai loại acid amin thứ 44 (S44N) và thứ 60 (S60T) của
gen mã hóa eltB ở tiểu phân tử B, khác nhau giữa 4 chủng (trong tổng số 52 chủng
nghiên cứu) (Chengxian Zhang và cs, 2009).
-

Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố LT

Hình 1.3. Cơ chế gây bệnh tiêu chảy của độc tố LT (Gyles và cs, 2010)

12


Sau khi vi khuẩn bám lên lớp tế bào biểu mô ruột thì độc tố LT được giải phóng ra,
và sẽ bám lên các receptor trên lớp tế bào biểu mô niêm mạc ruột. Sau khi bám vào
niêm mạc ruột, độc tố LT xuyên qua màng ngoài tế bào và đi vào thể Golgi và mạng
lưới nội chất (ER- endoplasmic reticulum). Sau khi phân tách thành 2 phần tại mạng
lưới nội chất, tiểu phân tử A1 sẽ di chuyển tới tế bào chất và chuyển phần ADP-ribosyl

Hình 1.4. Cấu trúc độc tố ST
Cầu nối disulfide (màu đỏ) trên 2 biến thể của độc tố STa, vùng lõi của độc tố (gạch
bên dưới) (Fleckenstein và cs, 2010).
Heat – stable enterotoxin STb (STII): Độc tố STb là một chuỗi peptide chứa 48
amino acid với trọng lượng phân tử khoảng 5,1 kDa, trong đó có 4 acid amin Cystein
tạo thành 2 cầu nối disulfide giữa Cys10-Cys48 và Cys21-Cys36. Chính các cầu nối
này có vai trò giúp cho STb bền vững trong tế bào chất. Độc tố STb và độc tố STa có
cấu trúc độc tố và tính kháng nguyên không giống nhau, nên cả 2 đều không thể trung
hòa độc tố còn lại (Dubreuil, 2008).
Theo Chengxian Zhang và cs, 2009: các gen estA mã hóa độc tố ST hoàn toàn
giống hệt nhau về trình tự giữa các chủng ETEC ở lợn. Độc tố STa ban đầu tiết ra là
một chuỗi 72 acid amin, sau khi xuyên vào tế bào chất chúng bị phân cắt thành độc tố
chứa 18 đến 19 acid amin.

Hình 1.5. Cầu nối disulfide (-S-S-) và các số chỉ vị trí acid amin trong cấu trúc độc
tố STb (Sukumar và cs, 1995).
14


-

Cơ chế gây tiêu chảy

Hình 1.6. Cơ chế gây bệnh tiêu chảy của độc tố STa (Gyles và cs, 2010)
STa: STa kết hợp với enzyme xuyên màng Guanylate cyclase C (GC-C), kích thích
hoạt tính GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào. Hoạt động này cuối cùng dẫn
đến sự gia tăng tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thu NaCl, dẫn đến tăng lượng tiết chất lỏng
trong ruột, gây tiêu chảy. Quá trình xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột và gây tiêu chảy
của STa xảy ra nhanh, độc tố STa kích thích giải phóng cGMP đạt nồng độ tối đa sau 5
phút, tuy nhiên quá trình này duy trì trong thời gian ngắn (He và Yun, 2010).

16