TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN LÊ KIỀU XUYÊN
NGHIÊN CỨU SỰ KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN
Vibrio parahaemolyticus PHÂN LẬP TỪ AO NUÔI TÔM

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2014
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN LÊ KIỀU XUYÊN NGHIÊN CỨU SỰ KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN
Vibrio parahaemolyticus PHÂN LẬP TỪ AO NUÔI TÔM


still susceptible to: norfloxacin, rifampicin, doxycycline, flumequine. In
particular, all 12 isolated in this study displayed multi-drug resistance on 13
antibiotics.
Title: Tudies of bacterial resistance Vibrio parahaemolyticus isolated from
shrimp ponds.
Keyword: Vibrio parahaemolyticus, shrimp, antimircobial susceptibility.
TÓM TẮT
Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) được coi là một căn bệnh nguy hiểm
trên tôm. Ở Việt Nam, bệnh đã xuất hiện trong năm 2011 và gây ra thiệt hại
đáng kể cho nghề nuôi tôm ở Đồng bằng sông Cửu Long. Tác nhân gây bệnh
là vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bị nhiễm bởi thể thực khuẩn. Trong
nghiên cứu này có 38 chủng vi khuẩn được phân lập từ mẫu nước, gan tụy và
ruột tôm có dấu hiệu bệnh AHPND ở các tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng, Bạc Liêu
và Trà Vinh. Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá sự nhạy cảm thuốc
kháng sinh của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Nghiên cứu kiểm tra kháng
sinh đồ với 13 loại kháng sinh trên 12 chủng vi khuẩn bằng phương pháp đĩa
khuếch tán. Kết quả kháng sinh đồ cho thấy đa số các chủng vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus kháng cao các kháng sinh như: amoxicillin, cephalexin và
kháng hoàn toàn với streptomycin. Tuy nhiên vẫn còn nhạy với: norfloxacin,
2

rifampicin, doxycycline, flumequine. Đặc biệt, tất cả 12 chủng vi khuẩn
nghiên cứu đều thể hiện sự đa kháng thuốc trên 13 loại kháng sinh.
1. GIỚI THIỆU
Nuôi trồng thủy sản (NTTS) là ngành có những đóng góp đáng kể trong nền
kinh tế của nhiều quốc gia trên thế giới. Trong đó, nuôi tôm biển là một trong
những nghề quan trọng nhất. Do có giá trị thương mại cao trên thị trường xuất
khẩu, nên nghề này không chỉ góp phần nâng cao thu nhập, cải thiện kinh tế
cho người dân mà nó còn góp phần giải quyết việc làm cho người lao động.
Tuy nhiên, từ đầu năm 2011, sự xuất hiện của hội chứng hoại tử gan tụy cấp

Bảng 1: Số mẫu tôm thu được ở các tỉnh
STT
Tỉnh
Số ao
Số mẫu tôm
1
Cà Mau
10
50
2
Sóc Trăng
1
5
3
Bạc Liêu
1
5
4
Trà Vinh
6
30

Tổng
18
90
2.2. Nguồn vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn được phân lập trên tôm sú, tôm thẻ và mẫu nước tại
những ao nuôi tôm có dấu hiệu bệnh AHPND ở các tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu,
Cà Mau. Thời gian từ tháng 8 đến tháng 12 năm 2014 (Bảng 2).
Bảng 2: Số chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phân lập ở các tỉnh


2.3. Phân lập và định danh vi khuẩn
Vi khuẩn V. parahaemolyticus được phân lập trên tôm (gan tụy, ruột) và nước
ở các tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng, Bạc Liêu và Trà Vinh cấy trên trên môi trường
CHROMagar™ Vibrio chọn ra các chủng vi khuẩn bắt màu tím tách ròng lại
Tryptic soy agar (TSA) có bổ sung 1,5% NaCl (Merck, Darmstadt, Germany)
ủ ở nhiệt độ 28
0
C trong 24 giờ. Vi khuẩn được phân lập dựa theo tài liệu
hướng dẫn của Frerichs và Millar (1993). Vi khuẩn được kiểm tra các đặc
điểm sinh lý, sinh hóa (tính di dộng, nhuộm Gram, oxidase, catalase, O-F test)
theo cẩm nang Cowan và Steel’s (Barrow and Feltham, 1993), trước khi định
danh bằng bộ kit API 20E (bioMerieux, France), (Buller, 2004).
2.4. Kiểm tra kháng sinh đồ
Bảng 3: Số chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus chọn làm kháng sinh đồ
4

STT
Tỉnh
Số chủng vi khuẩn
Trên tôm
Trên nước
1
Cà Mau
1
2
2

3.1. Dấu hiệu bệnh lý
Tôm bệnh hoạt động chậm chạp, bỏ ăn, lờ đờ và tắp mé. Khi tách bỏ lớp giáp
đầu ngực, quan sát thấy gan tụy teo, dai, nhạt màu và ruột rỗng (Hình 1).

Hình 1: Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) có dấu hiệu nhiễm
bệnh hoại tử gan tụy (A, B). Gan tụy teo, dai, màu nhợt nhạt, ruột
không có thức ăn.
A
B
5

Các dấu hiệu ghi nhận được tương tự trong mô tả của Lightner et al. (2012) và
Flegel et al., (2012) về các dấu hiệu bệnh lý của tôm khi mắc phải hội chứng
hoại tử gan tụy cấp tính. Lightner (2012) cho biết tôm hoại tử gan tụy ở mức
độ ao nuôi thường có một số các dấu hiệu như tôm chết đáy, bỏ ăn, gan tụy
teo, dai, nhạt màu, ruột rỗng và có hiện tượng mềm vỏ. Tôm nuôi có thể chết
đột ngột với tỉ lệ cao trong thời gian ngắn sau khi xuất hiện các dấu hiệu bệnh
đặc biệt khoảng sau từ 2 -3 ngày (Lê Hồng Phước và ctv, 2012).
3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn
Trên môi trường Thiosunfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) khuẩn lạc có
màu xanh,những khuẩn lạc này khi được cấy truyền sang đĩa môi trường
Tryptic soy agar (TSA) (có bổ sung 1.5% NaCl) thì khuẩn lạc phát triển có
màu kem hoặc màu trắng đục với hình dạng và kích thước khuẩn lạc tương tự
như trên môi trường CHROMagar™ Vibrio (Hình 2). Đặc điểm chung của các
chủng phân lập được đều là vi khuẩn Gram âm, hình que có khả năng di động,
phản ứng dương tính với oxidase, catalase, có khả năng lên men đường trong
điều kiện kị khí và hiếu khí. Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và
kết quả kiểm tra bằng kít API 20E các chủng vi khuẩn này được định danh là
vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.


Que ngắn
Que ngắn
Phát triển trên TCBS
Xanh
Xanh
Xanh
Di động
+
+
+
Sinh catalase
+
+
+
Sinh oxidase
+
+
+
Phản ứng lên men yếm khí
+
+
+
Phản ứng lên men hiếu khí
+
+
+
Sinh beta – galactosidaza
-
-
-

+
+
Acetoin production
+
+
+
Sinh Gelatinaza
+
+
+
Sử dụng đường Glucose
+
+
+
Manitol
+
+
+
Inositol
-
-
-
Sorbotol
-
-
-
Rhamnose
-
-
-

7

3.3. Kết quả kháng sinh đồ
Bảng 5: Tỷ lệ % kháng và nhạy của các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus
Thuốc kháng sinh
Kháng (%)
Nhạy trung bình (%)
Nhạy (%)
β-lactamin
Amoxicillin (25µg)
91,7
0
8,3
Cephalexin (30µg)
83,3
8,3
8,3
Cephazolin (30µg)
50
41.7
8,3
Aminoglycosides
Gentamycin (10µg)
41,7

Flumequine (30µg)
8,3
0
91,7
Tetracyclin
Doxycycline (30µg),
8,3
8,3
83,3
Rifampicine (30µg)
0
0
100
Trimethoprim+sulfamethoxazole
(25µg)
25
0
75
Kết quả kháng sinh đồ cho thấy đa số các chủng vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus kháng với các kháng sinh thuộc nhóm β-lactamin kháng
hoàn toàn với streptomycin, kháng tương đối cao với amoxicillin (91,7%),
cephalexin (83,3%). Nhạy hoàn toàn với florfenicol, rifampicin, nhạy tương
đối cao với norfloxacin (91,7%), flumequine (91,7%), enrofloxacin (83,3%),
doxycycline (83,3%).
3.4. Hiện tượng đa kháng thuốc của vi khuẩn
aminoglycosides. Trong nghiên cứu này V. parahaemolyticus kháng hoàn toàn
với streptomycine, kháng tương đối với neomycine (58,3%) và gentamycine
(41,7%). Các kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosides không hấp thụ qua
đường ruột nên chỉ có thể sử dụng qua đường tiêm trong y học và thú y, vì vậy
chúng rất ít được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản (Bùi Kim Tùng, 2001).
Trong khi đó, các dòng vi khuẩn trong nghiên cứu này nhạy hoàn toàn với
florfenicol. Theo nghiên cứu của Quang Trong Phat, (2013) thì V.
parahaemolyticus nhạy cao với florfenicol (91,7%). Florfenicol là kháng sinh
được ứng dụng rộng rãi trong ngành thú y và trong NTTS ở châu Á từ những
thập niên 1980 (Keyes et al., 2000). Tuy nhiên, chỉ sử dụng kháng sinh này
điều trị cho động vật thủy sản khi thật sự cần thiết và tuân thủ các nguyên tắc
sử dụng kháng sinh.
Tuy các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu còn nhạy với nhóm quinolone
nhưng thế hệ I của nhóm kháng sinh này như: flumequine có hoạt tính với vi
khuẩn Gram âm. Tuy nhiên các kháng sinh thế hệ II như: enrofloxacin và
norfloxacin hoạt tính dựa vào sự trao đổi chất của ADN làm thay đổi cấu trúc
tế bào vi khuẩn có thể dẫn đến các thể đột biến kháng thuốc (Lê Đăng Hà,
2011). Mặt khác, enrofloxacin là kháng sinh nằm trong danh mục cấm sử dụng
9

trong nuôi trồng thủy sản của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn
(Thông tư 03/2012/TT BNNPTNT) do thuốc có khả năng tồn lưu một thời
gian dài trên động vật thủy sản. Vì vậy, trong trường hợp khẩn cấp có thể sử
dụng kháng sinh flumequine để điều trị không nên sử dụng enrofloxacin và
norfloxacin để tránh sự kháng thuốc xảy ra.
Doxycycline là kháng sinh thuộc thế hệ mới nhất của nhóm tetracycline.
Nhóm tetracycline được sử dụng trong nuôi thủy sản bằng cách trộn vào thức
ăn hoặc tắm (Từ Thanh Dung, 2008). Trong nghiên cứu này các chủng
V.parahaemolyticus nhạy rất cao với doxycycline (91,7%) tương tự với nghiên
cứu của Diep The Tai et al. (2010), vi khuẩn thể hiện tính nhạy với

làm xuất hiện vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh. Sự xuất hiện vi khuẩn kháng
thuốc nhanh hơn là tìm ra những thuốc mới có hiệu lực với các vi khuẩn đó.
Hậu quả của vi khuẩn kháng thuốc sẽ làm cho điều trị các bệnh không hiệu
quả, nguy cơ tử vong nhiều hơn, tốn phí trong điều trị, đồng thời có thể xuất
hiện những ổ dịch do vi khuẩn kháng thuốc.
Trong nuôi trồng thủy sản sự hiểu biết của người nuôi về thuốc kháng sinh còn
hạn chế về nhiều mặt. Vì vậy, việc sử dụng kháng sinh không đúng cách dẫn
đến điều trị không có hiệu quả là điều không thể tránh khỏi. Thuốc kháng sinh
sử dụng hiệu quả trong trường hợp trị bệnh nhiễm khuẩn giúp động vật thủy
sản hồi phục lại chức năng sinh lý bình thường và nâng cao tỷ lệ sống nếu sử
dụng đúng liều và đúng lúc. Sử dụng bừa bãi sẽ gây khó khăn cho việc điều trị
về sau, dễ bị bội nhiễm, đôi khi dẫn đến tử vong. Trị liệu bằng kháng sinh
được coi như sự trợ giúp nhất thời khi khả năng chống bệnh suy giảm, vì thế ta
nên tăng cường các biện pháp phòng bệnh hơn là phải trị bệnh ( Bùi Kim Tùng
và ctv., 2001).
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
Kết luận
Kết quả phân lập được 38 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong ao
nuôi tôm sú và tôm thẻ.
Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ trên 12 chủng vi khuẩn kháng hoàn toàn với
streptomycine, kháng cao với amoxicillin, cephalexin, kháng tương đối cao
với cephazolin, gentamycin, neomycin. Nhạy hoàn toàn với florfenicol và
rifampicin. Nhạy cao với các kháng sinh như norfloxacin, flumequine và nhạy
tương đối cao với trimethoprim+sulfamethoxazole, enrofloxacin ,
doxycycline. Trong trường hợp cấp thiết có thể sử dụng flumequine,
doxycycline, florfenicol để trị bệnh do V. parahaemolyticus gây ra.
Chỉ số đa kháng (MAR) trên 4 tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Trà Vinh
đều lớn hơn 0,2.
Trong 12 chủng vi khuẩn khảo sát đều thể hiện tính đa kháng ít nhất là 3 loại
kháng sinh, nhiều nhất là 8 loại kháng sinh. Đa kháng với 3, 4 và 6 loại kháng

nghệ và môi trường tỉnh Bà Rịa- Vũng Tàu, 287 trang.
Bùi Kim Tùng, Bùi Kim Hoàng và Bùi Kim Tân, 2001. Thuốc kháng sinh. Sở Khoa học
Công nghệ và Môi trường tinhr Bà Rịa-Vũng Tàu. 255 trang.
Buller, B.N, 2004. Bacteria from fish and Other Aquatic Animals- A Practical Identification
Manual. CABI Publishing. 390pp.
Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI), 2011. Methods for broth dilution
susceptibility testing of bacteria isolated from aquatic animals; informational
supplement, M49- A, Clinical and Laboratory Standards Istitute, Wayne, NJ.
Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, Temdoung Somsiri, Supranee Chinabut,
Fatinah Yussoff, Mohamed Shariff, Kerry Bartie, Geert Huys, Mauro Giacomini,
Stefania Berton, Jean Swings and Alan Teale, 2005. Xác định tính kháng thuốc kháng
sinh của vi khuẩn phân lập từ các hộ nuôi thủy sản ở Đồng bằng Sông Cửu Long, Việt
Nam. Tạp chí Nghiên Cứu Khoa Học - Đại học cần Thơ. 4: 2005, 136-144.
Diep The Tai, Au Vinh Thuy, Nguyen Thi Ngoc Nhi, Nguyen Thi Kim Ngoc and Nguyen
Thi Phuong Lan, 2010. Virulence and antimicrobial resistance characteristics of Vibrio
parahaemolyticus isolated from environment, food and clinical samples in the south of
Vietnam. Institut Pasteur International Network Annual Scientific Meeting .Volume 5
Supplement 1.
12

Flegel, W. T., 2012. Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in
Asia. Journal of Invertebrate Pathology 110: 166-173.
Frerichs, G Nicolas and Millar, Stuart D. (1993). Manual for the isolation and
identification of fish bacterial pathogens.
Keyes, K., C. Hudson and J.J. Maurer, 2000. Detection of florfenicol resistance genes in
Escherichia coli isolated from sick chickens. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 44: 421-424.
Lê Đăng Hà, 2011. Bệnh truyền mhiễm và nhiệt đới. Nhà xuất bản Khoa học Kỹ Thuật.
trang 6- 102.
Lê Hồng Phước, Lê Hữu Tài và Nguyễn Văn Hảo, 2012. Diễn biến của hội chứng hoại tử

trang.
Từ Thanh Dung, 2008. Bài giảng bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản. Khoa Thủy Sản.
Trường Đại học Cần Thơ. 127 trang.