BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y
*****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
MỨC ĐỘ MẪN CẢM KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN
STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHÂN LẬP
TỪ SỮA BÒ TƯƠI
 
 
 
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN QUỐC THẮNG
Lớp: DH07DY
Ngành: Dược Thú Y
Niên khóa: 2007 - 2012

Tháng 08/2012
 
 


BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y
****************

NGUYỄN QUỐC THẮNG

MỨC ĐỘ MẪN CẢM KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN
STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHÂN LẬP

Tôi xin chân thành biết ơn:
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Ban Chủ Nhiệm khoa Chăn Nuôi Thú Y cùng toàn thể thầy cô đã tận tình giảng
dạy tôi trong suốt thời gian học tại trường.
Chân thành cảm ơn TS. Võ Thị Trà An và BSTY. Lê Hữu Ngọc đã nhiệt tình
hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô Đặng Thị Xuân Thiệp đã tận tình giúp đỡ và
đồng hành với tôi trong quá trình làm đề tài.
Cảm ơn các bạn trong phòng thực tập “Kiểm nghiệm thú sản, môi trường và sức
khỏe vật nuôi” đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài. Cảm ơn tập thể lớp
DH07DY đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tại trường.
Con xin chân thành cám ơn cha mẹ và các thành viên trong gia đình đã hết lòng
quan tâm, chăm sóc nuôi dưỡng con trong suốt quảng đường học tập. Đó là niềm động
viên lớn lao để con có thể bước tiếp vươn lên trên đường đời.
Xin chân thành cám ơn

Nguyễn Quốc Thắng

iii 
 


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Mức độ mẫn cảm kháng sinh vi khuẩn Staphylococcus
aureus phân lập từ sữa bò tươi” được tiến hành lấy mẫu ở các trại bò ven thành phố Hồ
Chí Minh, Đồng Nai, Bình Dương và phân lập, thử kháng sinh đồ tại phòngthực hành
kiểm nghiệm thú sản và môi trường, phòng thực hành Dược lý, Khoa chăn nuôi thú y
trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát
132 mẫu sữa bò tươi, kết quả được ghi nhận như sau:
Trong 132 mẫu khảo sát có 118 mẫu nhiễm Staphylococci chiếm tỉ lệ là 89,4 %

2.2 Giới thiệu về Staphylococcus aureus..................................................................... 5
v 
 


2.2.1 Hình thái, đặc điểm sinh hóa ........................................................................... 5
2.2.2 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố .............................................................. 7
2.2.3 Tính kháng thuốc kháng sinh .......................................................................... 8
2.2.4 Phương pháp định tính S. aureus .................................................................... 8
2.2.5 Ngộ độc thực phẩm do S. aureus .................................................................... 9
2.3 Những kiến thức cơ bản về kháng sinh ............................................................... 12
2.3.1 Khái niệm ...................................................................................................... 12
2.3.2 Phân loại ........................................................................................................ 12
2.3.3 Đề kháng kháng sinh ..................................................................................... 13
2.3.4 Biện pháp hạn chế sự đề kháng ..................................................................... 16
2.3.5 Các biện pháp kiểm soát đề kháng kháng sinh : ........................................... 16
2.3.6 Các phương pháp khảo sát sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh ... 17
2.3.7 Lược duyệt công trình nghiên cứu trong và ngoài nước ............................... 18
Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 19
3.1 Thời gian và địa điểm .......................................................................................... 19
3.2 Vật liệu................................................................................................................. 19
3.2.1 Đối tượng khảo sát ........................................................................................ 19
3.2.2 Thiết bị, dụng cụ ............................................................................................ 19
3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu................................................................. 20
3.3.1 Phương pháp phân lập và dịnh danh vi khuẩn S. aureus .............................. 20
3.3.2 Phương pháp thử kháng sinh đồ .................................................................... 26
3.3.3. Xử lý số liệu ................................................................................................. 29
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 30
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn S. aureus .................................................................. 30
vi 


Mueller Hinton agar

MSA

Mannitol salt agar

PCR

Polymerase Chain Reaction

viii 
 


DANH MỤC CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus dưới kinh hiển vi điện tử………………6
Hình 2.2 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường MSA…………………7 
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình phân lập và định danh S. aureus………………………...22
Hình 3.2 Kết quả nhuộm Gram của vi khuẩn tụ cầu Gram dương………………....23
Hình 3.3 Kết quả phản ứng catalase dương tính…………………………………...24
Hình 3.4 Kết quả phản ứng coagulase âm tính và dương tính……………………..26
Hình 4.1 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên bề mặt thạch MSA……………….34
Hình 4.2 Kết quả nhuộm gram vi khuẩn Staphylococcus aureus……………….….35
Hình 4.3 Kết quả thực hiện phản ứng catalase dương tính…………..………….….36
Hình 4.4 Kết quả thực hiện phản ứng coagulase dương tính và âm tính…..…….…36
Hình 4.5 Kết quả thực hiện kháng sinh đồ của vi khuẩn Staphylococcus aureus….37

ix 

kháng sinh tại các trại chăn nuôi bò càng được quan tâm, sử dụng kháng sinh không
đúng cách sẽ dẫn đến hiện tượng đề kháng kháng sinh ở một số loài vi khuẩn.
Hiện nay, hiện tượng đề kháng kháng sinh đang rất phổ biến gây khó khăn
trong điều trị bệnh trên người và gia súc.Vi khuẩn có thể đề kháng với một hoặc
nhiều loại kháng sinh và ngày càng có khuynh hướng phát triển đa đề kháng. Vi
khuẩn Staphylococcus aureus là một vi khuẩn gây bệnh khá phổ biến. Trong đó,
ngộ độc thực phẩm do S. arueus đang tiến triển nhanh chóng. Chính vì vậy, vấn đề
đặt ra là cần phải cập nhật tình hình đề kháng kháng sinh của S. aureus với mục
đích nâng cao hiệu quả điều trị bệnh do S. aureus trên bò cũng như các trường hợp
ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn này gây ra.
Xuất phát từ yêu cầu trên, được sự hướng dẫn của TS. Võ Thị Trà An và
BSTY. Lê Hữu Ngọc chúng tôi thực hiện đề tài “Mức độ mẫn cảm kháng sinh của
vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập từ sữa bò tươi”.

1 
 


1.2 Mục đích
Xác định độ mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn S. aureus phân
lập từ sữa bò tươi.
Góp phần nâng cao hiệu quả điều trị các trường hợp ngộ độc thực phẩm do S.
aureus gây ra cho con người.
1.3 Yêu cầu
Lấy mẫu, phân lập định danh và bảo quản các gốc vi khuẩn S. aureus phân
lập được từ sữa bò tươi.
Thực hiện kháng sinh đồ để xác định mức độ đề kháng của các gốc S. aureus
phân lập được.

2 



2.1.3 Tính chất
Staphylococcus là những vi khuẩn hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, có cả sự trao
đổi chất, hô hấp và lên men. Chúng cho phản ứng catalase dương tính và có thể sử
dụng nhiều loại carbonhydrate khác nhau tạo acid lactic nhưng không sinh hơi.
Khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc như tryptic soy agar thường từ màu kem
đến màu cam. Thành tế bào và acid teichoic giúp duy trì môi trường ion thích hợp
cho màng tế bào chất, đồng thời góp phần bảo vệ bề mặt tế bào tụ cầu.
Staphylococcus có thể mọc ở nhiều điều kiện, môi trường khác nhau, nhưng tốt nhất
ở nhiệt độ từ 30 - 370 C và pH gần như trung tính. Chúng kháng được với các chất
diệt trùng, độ khô nóng và có khả năng tăng trưởng trong môi trường có chứa đến
15% NaCl (Scott và John, 2000) (trích dẫn của Trương Thị Lệ Trâm, 2010).
2.1.4 Phân loại
Hiện nay người ta đã biết được 33 loài Staphylococcus (Gandra, 2005). Có
thể chia Staphylococcus thành 2 nhóm:
Nhóm cho phản ứng coagulase dương tính: là nhóm tụ cầu có men coagulase.
Các vi khuẩn quan trọng của nhóm này gồm: S. aureus, Staphylococcus intermedius
và Staphylococcus hyicus. Để phân biệt được 3 loài vi khuẩn trên sử dụng phản ứng
phenotipycal và kỹ thuật PCR. Dựa trên sự hiện diện hoạt động của men betagalactosidase và nhạy cảm acriflavine của S. intermedius, trong khi S. aureus không
sản xuất men beta-galactosidase và nhạy cảm acriflavine, còn S. hyicus không nhạy
cảm acriflavine và không sản xuất men beta-galactosidase (Gandra, 2005).
Nhóm cho phản ứng coagulase âm tính: là nhóm tụ cầu không có men
coagulase. Trong nhóm này dựa vào sự nhạy cảm với kháng sinh novobiocin mà
người ta phân loại vào hai nhóm được thể hiện ở Bảng 2.1 và trên cơ sở đó người ta
định danh chúng (Longauerova, 2006).
 

4 
 


Staphylococcus warneri

Staphylococcus cohnii subsp urealyticus

Staphylococcus lugnensis

Staphylococcus xylosus

Staphylococcus simulans

Staphylococcus lentus

Staphylococcus auricularis

Staphylococcus vitulinus

Staphylococcus pasteuri
Staphylococcus caprae
(Nguồn: Longauerova, 2006)
2.2 Giới thiệu về Staphylococcus aureus
2.2.1 Hình thái, đặc điểm sinh hóa
Staphylococcus aureus thuộc giống Staphylococcus, do đó nó mang tính chất
chung của Staphylococcus. S. aureus là những vi khuẩn hình cầu, không di động,
gram dương, đường kính 1 - 1,3 µm, tế bào xếp thành hình chùm nho, không di
động. Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy với lysotaphin, một chất có thể phá
hủy cầu nối pentaglycin của tụ cầu (Harvey và Gilmour, 2000).

Hình 2.1 Vi khuẩn S. aureus dưới kính hiển vi điện tử
(Nguồn: Klaske, 2008)

sang vàng sau 48 giờ nuôi cấy ở 370 C (Hanson và Pietraszewski, 2010).

6 
 


Hình 2.2 Khuẩn lạc S. aureus trên môi trường MSA
(Nguồn: Hanson và Pietraszewski, 2010)
2.2.2 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố
Nhu cầu dinh dưỡng và sự phát triển của S. aureus thay đổi tùy thuộc vào
từng dòng (Bremer và ctv, 2004). S. aureus có khả năng phát triển trong khoảng
nhiệt độ rất rộng, từ 7 - 480 C với nhiệt độ phù hợp là 30 - 450 C, khoảng pH 4,2 9,3, với độ pH phù hợp là 7 - 7,5 và trong môi trường chứa 15 % NaCl (Harvey và
Gilmour, 2000). Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế
bào và máy móc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc
thấm. Chính nhờ những đặc tính trên giúp cho S. aureus có sự phân bố rộng, chủ
yếu được phân lập từ da, màng nhầy, tóc và mũi của người và động vật máu nóng.
S. aureus được cho là vi khuẩn sống khá mạnh, có thể sống tốt bên ngoài kí chủ. Vi
khuẩn này còn có mặt trong không khí bụi và nước dù thiếu tính di động và nhạy
cảm với thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn (Harver và Gilmour, 2000). Tuy nhiên,
S. aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở 600 C từ 2 - 50 phút tùy từng loại
thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các vi sinh vật khác ức chế
(Bermer và ctv, 2004).
Khả năng nhiễm vào thực phẩm và gây bệnh của S. aureus là rất lớn do
chúng phân bố khắp nơi và có khả năng sinh độc tố. Tụ cầu nhiễm vào thực phẩm
7 
 


chủ yếu qua chế biến. Chỉ một lượng nhỏ S. aureus tạo độc tố cũng có thể gây ngộ
độc. Theo Phạm Trần Xuân Hiền (2006), trong 36 chủng S. aureus khảo sát, có đến


tắc của phản ứng tụ, thực hiện được dễ dàng trên lame soi kính hiển vi và kết quả
đọc bằng mắt thường (Vương Thị Việt Hoa, 2002).
2.2.5 Ngộ độc thực phẩm do S. aureus
2.2.5.1 Độc tố và enzyme của S. aureus
Theo Carter (1991), S. aureus có các độc tố và enzyme sau
Độc tố ruột A - E: đây là những protein có cấu tạo từ những chuỗi
polypeptide đơn giản. Có 5 nhóm huyết thanh học được đặt tên là SEA
(Staphylococcus Enterotoxin A), SEB, SED, SEE. Nhóm thứ sáu SEF không được
xem là độc tố đường ruột và đặt tên lại là độc tố gây hội chứng sock toxin-1. Dựa
vào kiểu kháng nguyên khác nhau, SEC lại được chia thành 3 loại SEC1, SEC2,
SEC3. Những độc tố này đề kháng cao với nhiệt độ.
Độc tố gây dung huyết tế bào α, β, γ, δ: tất cả đều có kiểu kháng nguyên
riêng biệt. Những tế bào hồng cầu của nhiều loại thú khác nhau sẽ có tính mẫn cảm
khác nhau đối với các độc tố này. Độc tố α, β gây dung huyết mạnh, trong đó độc tố
α có ái lực mạnh với hồng cầu thỏ, độc tố này gây co thắt cơ trơn, hoại tử da và gây
chết. Độc tố γ bị ức chế bởi cholesterol, độc tố δ bị ức chế bởi những phospholipids.
Độc tố gây ra hội chứng shock: do những dòng vi khuẩn gây ra hội chứng
shock độc tính cho người.
Coagulase: làm đông huyết tương biến đổi prothrombin thành thrombin,
fibrinogen thành fibrin.
Lipase: gây rối loạn sự bảo vệ các acid béo trên da, những dòng có lipase
dương tính thì có khuynh hướng gây ra những abscess trên da và dưới da.
Hyaluronidase: là một enzyme được biết đến như một yếu tố dẫn truyền nó
làm phân hóa acid hyaluronic, tạo điều kiện cho vi khuẩn lan tràn trong mô bào.
Penicillinase: phá hủy vòng β-lactam của kháng sinh penicillin.
Leukocidin: phá hủy bạch cầu hạt và macrophage, nó được tạo thành từ hai
protein có tác động tương hỗ và rất nhạy cảm với nhiệt độ.
Staphylokinase: làm tan fibrin do biến đổi plasminogen thành plasmin bởi
enzyme fibrinolytic.

trong thực phẩm phụ thuộc nhiều yếu tố như nhiệt độ, thời gian, tính chất và thành
phần dinh dưỡng của thức ăn (Dương Thanh Liêm, 2006) (trích dẫn của Trương Thị
Lệ Trâm, 2010).
10 
 


Hầu hết các vụ ngộ độc do tụ cầu khuẩn là do quá trình chế biến và bảo quản
thực phẩm không tốt. Tụ cầu thường nhiễm trực tiếp vào thực phẩm do tay người
chế biến, bị trầy xước hay ho, hắt hơi. Việc bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ không
phù hợp cũng rất quan trọng, một khi thực phẩm bị nhiễm tụ cầu khuẩn, chúng sẽ
gia tăng số lượng rất nhanh chóng. Điều đáng lo ngại độc tố được tạo ra trong suốt
quá trình phát triển của tụ cầu nhưng lại không ảnh hưởng đến cảm quan thực phẩm,
do dó ít được chú ý (Mary và John, 2002) (trích dẫn của Trương Thị Lệ Trâm,
2010).
Bảng 2.2 Tốc độ phát triển của tụ cầu trên một số thực phẩm
Loại thực phẩm

Số lượng vi khuẩn trên 1 g thực phẩm
Ở 370 C sau 6 giờ Ở 370 C sau 24 giờ

Các loại sữa

195

190000

Thịt

112

trong chuyến đi thực tế và đã ăn trưa tại Nha Trang (Khánh Hòa). Ba giờ chiều cùng
ngày, nhiều cán bộ, sinh viên đau đầu, tiêu chảy, ói mửa, tất cả 105 người phải vào
viện cấp cứu. Nguyên nhân được xác định do thức ăn để lâu ngày bị nhiễm tụ cầu
vàng và đã sinh độc tố enterotoxin. Enterotoxin do tụ cầu tạo ra là loại độc tố cực
11 
 


mạnh gây độc cấp tính. Mấy năm gần đây, những vụ ngộ độc thức ăn do tụ cầu
được phát hiện và nói đến nhiều hơn (Đỗ Mạnh Hòa, 2006).
Ngày 30/6/2000, 1152 bệnh nhân ở Nhật Bản có các triệu chứng buồn nôn,
nôn mửa và tiêu chảy do uống sữa. Đến ngày 11 tháng 7, tổng cộng có 14.555 người
được báo cáo bệnh và 159 người phải nhập viện điều trị. Nghiên cứu dịch tễ học
cho thấy sữa của thương hiệu thực phẩm Snow, một công ty sữa lớn nhất của Nhật
Bản, là nguồn gốc của nhiễm độc. Phòng thí nghiệm phân tích cho thấy S. aureus có
độc tố enterotoxin hiện diện trong một số gói sữa (Klaske, 2008).
2.3 Những kiến thức cơ bản về kháng sinh
2.3.1 Khái niệm
Kháng sinh là tất cả những chất hóa học, không kể nguồn gốc (chiết xuất từ
môi trường nuôi cấy vi sinh vật, bán tổng hợp hay tổng hợp) có khả năng kiềm hãm
sự phát triển của vi khuẩn (bacteriostatic) hoặc tiêu diệt vi khuẩn (bactericidal) bằng
cách tác động chuyên biệt trên một giai đoạn chuyển hóa cần thiết của vi sinh vật.
Với định nghĩa này, nhiều thuốc xếp vào nhóm kháng khuẩn tổng hợp (như
sulfonamide, quinolone) bây giờ cũng được xếp loại kháng sinh (Võ Thị Trà An,
2007).
2.3.2 Phân loại
Theo Võ Thị Trà An (2007), có nhiều nhóm kháng sinh:
2.3.2.1 Phân loại nhóm dựa vào cấu trúc hóa học
Beta-lactam: penicillin, ampicillin, amoxicillin, cephalosporin....
Aminoglycoside: streptomycin, gentamicin, kanamycin, neomycin....

thú đem lại nhiều thành công và hiệu quả kinh tế, nhưng đồng thời đã tạo một áp lực
chọn lọc đối với vi khuẩn. Việc dùng kháng sinh sẽ luôn tạo ra một sự để kháng với
chính nó ở một mức độ nhất định trong quần thể vi khuẩn. Bằng chứng rõ nhất là
khi kiểm tra các chủng vi khuẩn thời tiền kháng sinh, các nhà khoa học không phát
hiện ra sự đề kháng với kháng sinh cũng như bất kỳ gen liên quan đến tính trạng đề
kháng thường gặp ở các chủng vi khuẩn đương thời. Áp lực chọn lọc đối với sự đề
kháng kháng sinh xuất phát từ nhiều nguồn như việc sự dụng kháng sinh trong
phòng và trị bệnh cho động vật, kháng sinh dùng với mục đích kích thích tăng trọng
cho gia súc.

13 
 


Hiện tượng đề kháng kháng sinh ngày càng gia tăng trong nhiều loài vi
khuẩn gây bệnh cho người và gia súc đang là mối quan tâm và lo lắng cho toàn xã
hội. Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm hạn chế khả năng điều trị bệnh nhiễm trùng,
một số trường hợp dẫn tới tử vong do vi khuẩn đề kháng với hầu hết các kháng sinh
dùng trong lâm sàng. Hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh đề kháng
kháng sinh hay đa đề kháng còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền lại cho
những vi khuẩn gây bệnh khác.
Đề kháng kháng sinh được phân loại gồm đề kháng tự nhiên (insitrisic
resitance) và đề kháng thu nhận (acquired resitance). Vi khuẩn đề kháng tự nhiên
với kháng sinh do chúng không có cơ chế tế bào cần thiết cho kháng sinh tác động.
Ví dụ: enterobacteriaceae kháng với kháng sinh vancomycin, vi khuẩn G + kháng
với kháng sinh polymyxin B.
Đề kháng thu nhận có thể xảy ra do đột biến nhiễm sắc thể của tế bào vi
khuẩn hoặc do vi khuẩn nhận các vật liệu di truyền (gene) liên quan đến kháng
thuốc từ vi khuẩn khác. Do vi khuẩn có chu kỳ phát triển từ vài giây đến vài phút
nên chúng rất linh hoạt trong biến đổi để phù hợp với những thay đổi của môi