MỤC LỤC
Lời cam đoan....................................................................................................... ii
Lời cảm ơn ......................................................................................................... iii
Mục lục .............................................................................................................. iv
Danh mụch chữ viết tắt ....................................................................................... vi
Danh mục bảng ................................................................................................. vii
Danh mục hình ................................................................................................. viii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3
1.1. Tình hình chăn nuôi bò sữa trên thế giới và tại Việt Nam ............................. 3
1.2. Một số hiểu biết về vi khuẩn Staphylococcus aureus..................................... 5
1.2.1. Hình thái............................................................................................. 5
1.2.2. Tính chất nuôi cấy .............................................................................. 5
1.2.3. Các yếu tố độc lực .............................................................................. 6
1.3. Hiểu biết về bệnh viêm vú ở bò sữa ........................................................... 15
1.4. Hiểu biết về màng sinh học của vi khuẩn .................................................... 16
1.4.1. Định nghĩa màng sinh học (biofilm) ................................................. 16
1.4.2. Sự hình thành màng sinh học ............................................................ 16
1.4.3. Vai trò của màng sinh học trong cơ chế gây bệnh của vi khuẩn ........ 18
1.4.4. Các phương pháp xác định sự hình thành màng sinh học .................. 19
1.4.5. Tác hại của màng sinh học ................................................................ 24
1.4.6. Một số biện pháp kiểm soát sự hình thành màng sinh học ................. 24
1.4.7. Ứng dụng có lợi của màng sinh học .................................................. 24
Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....... 26
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 26
2.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................... 26
2.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 26
2.4. Nguyên liệu, thiết bị ................................................................................... 26
2.4.1. Mẫu sữa ............................................................................................ 26
2.4.2. Môi trường dùng trong phân lập, thuần khiết, tăng sinh vi khuẩn ...... 26


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v


DANH MỤCH CHỮ VIẾT TẮT
ADN

: Acid Deoxyribo Nucleic

ELISA

: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

HA

: Hemagglutinin

HPAI

: Highly Pathogenic Avian Influenza

IP

: ImmunoPeroxidase

LL

: Lymphoid Leukosis


Số bảng

Tên bảng

Trang

1.1:

Lượng sữa sản xuất trên thế giới (triệu tấn) ............................................... 4

2.1.

Trình tự mồi dùng giám định loài Staphylococcus spp. và
Streptococcus spp. .................................................................................. 28

2.2.

Chu trình nhiệt PCR dùng giám định loài Staphylococcus spp và
Sterptococcus spp ................................................................................... 32

3.1.

Tình hình thu thập mẫu sữa bò tại Phù Đổng và Cầu Diễn ...................... 36

3.2.

Tỷ lệ phân lập được vi khuẩn từ mẫu sữa tại Phù Đổng và Cầu Diễn .......... 37

3.3.



Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii


DANH MỤC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

1.1.

Quá trình hình thành màng sinh học (biofilm) ......................................... 16

1.2.

Quá trình giải phóng vi khuẩn ra khỏi màng sinh học ............................. 17

1.3.

Vai trò của màng sinh học trong cơ chế sinh bệnh của vi khuẩn .............. 18

1.4.

Sự sản sinh màng sinh học của Staphylococcus epidemidis xác định
bằng phương pháp ống nghiệm ............................................................... 20



3.1.

Phân lập vi khuẩn Streptococcus spp và Staphylococcus spp từ
mẫu sữa .................................................................................................. 41

3.2.

Thuần

khiết

các

chủng

vi

khuẩn

Streptococcus

spp

và

Staphylococcus spp phân lập được từ mẫu sữa ........................................ 42
3.3.

Kết quả PCR giám định Staphylococcus aureus ...................................... 46


MỞ ĐẦU
Theo chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020, đàn bò sữa nước ta
tăng bình quân 11% năm, đạt khoảng 500 ngàn con (Quyết định 10/2008/QĐTTg), tỷ lệ sữa tươi sản xuất trong nước đáp ứng nhu cầu tiêu dùng tăng lên 35%
năm 2015 và 40% năm 2020 (Đỗ Kim Tuyên, 2007). Bên cạnh những thuận lợi
cho sự phát triển, ngành chăn nuôi bò sữa của nước ta đã và đang đối mặt với
nhiều thách thức, trong đó có vấn đề dịch bệnh. Một trong những bệnh thường
gặp, gây nhiều thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi bò sữa là bệnh viêm vú.
Ngay ở những nước có trình độ chăn nuôi phát triển như Canada, Mỹ, Hà Lan,
v.v... bệnh viêm vú ở bò sữa vẫn là một thách thức lớn, gây thiệt hại về kinh tế
hàng năm khoảng 300 triệu USD (Boldyreva E.M., 2014).
Về nguyên nhân vi khuẩn gây bệnh viêm vú, Staphylococcus aureus,
Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae,
Escherichia coli và Klebsiella được xác định là những loại mầm bệnh thường gặp
nhất (Bradley A.J., 2002, Olde Riekerink và cs., 2008). Đáng chú ý, những vi
khuẩn kể trên đều có khả năng hình thành màng sinh học (biofilm) (Hassan A. et
al, 2011) nên giúp vi khuẩn bám dính, tồn tại lâu dài trên bề mặt biểu mô, đề
kháng tốt với hiện tượng thực bào và sự tác động của kháng sinh (Costerton, J.W.
và cs., 1999). Ở Việt Nam, các nghiên cứu về bệnh viêm vú ở bò sữa đã xác định
được 3 loại vi khuẩn gây bệnh chính là Streptococcus spp., Staphylococcus spp.
và Escherichia coli (Phạm Bảo Ngọc, 2003, Trương Quang và cs., 2008). Tuy
nhiên, chưa có công bố nào đặt vấn đề nghiên cứu khả năng hình thành biofilm
của chúng. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn vi khuẩn Staphylococcus
aureus là một vi khuẩn thường gặp nhất trong sữa bò làm đối tượng để thực hiện
đề tài "Nghiên cứu khả năng hình thành màng sinh học (biofilm) của vi
khuẩn Staphylococcus aureus phân lập được từ bò sữa" nhằm làm sáng tỏ khả
năng sản sinh biofilm của các chủng vi khuẩn phân lập được.
Ý nghĩa khoa học của đề tài:
(1) Ở Việt Nam, đây là đề tài đầu tiên đặt vấn đề nghiên cứu khả năng sản
sinh biofilm của vi khuẩn phân lập từ sữa bò,

từng nước. Các nước châu Âu và Bắc Mỹ có ngành chăn nuôi bò sữa theo hướng
chuyên dụng. Phần lớn ngành chăn nuôi bò sữa ở các nước đang phát triển thuộc
về các hộ chăn nuôi quy mô nhỏ. Số trang trại nuôi bò sữa ở các nước phát triển
có xu hướng giảm xuống, trong khi đó số hộ chăn nuôi bò sữa ở các nước đang
phát triển có xu hướng ổn định.
Hệ thống chủ yếu là bãi chăn-chuồng nuôi với việc sử dụng rộng rãi đồng
cỏ lâu năm, mùa hè chủ yếu dựa vào chăn thả trên đồng cỏ, còn mùa đông dùng
nhiều thức ăn bổ sung tại chuồng (cỏ ủ xanh, cỏ khô, thức ăn tinh). Tổng sản
lượng sữa tiêu thụ trên toàn thế giới không ngừng tăng lên trong những thập kỷ
gần đây.
Các nước phát triển ở châu Âu, Bắc Mỹ và châu Đại Dương sản xuất
tới 68% sản lượng sữa của thế giới với năng suất sữa bình quân cao hơn nhiều
so với các nước đang phát triển. Các nước phát triển có tống lượng sữa tiêu
thụ cũng như lượng sữa tiêu thụ bình quân ổn định. Trong khi đó tổng lượng
sữa tiêu thụ cũng như mức tiêu thụ sữa/người của các nước đang phát triển
không ngừng tăng lên.
Sản lượng sữa sản xuất trên toàn thế giới tăng bình quân hàng năm là
1,4%, riêng các nước đang phát triển ở châu Á là 6,6%. Một số nước như Trung
quốc, Thái Lan, Hàn Quốc có tốc độ tăng sản lượng sữa hàng năm tới 10% trong
những năm gần đây. Tuy nhiên các nước châu Á vẫn chưa sản xuất đủ sữa cho
nhu cầu tiêu thụ trong mỗi nước.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


Bảng 1.1: Lượng sữa sản xuất trên thế giới (triệu tấn)
Năm


58,1

89,1

128,5

159,2

172,4

Châu Âu

136,5

156,7

181,7

159,9

161,9

160,7

Bắc Mỹ và

69,2

69,4


17,8

23,5

25,1

Toàn Thế giới

364,6

424,6

512,7

536,9

579,1

600,9

Trung Mỹ

Nguồn: FAO Statistics (2004)
Tại Việt Nam
Việt Nam vốn không có ngành chăn nuôi trâu bò sữa truyền thống nên
không có các giống trâu bò sữa chuyên dụng đặc thù nào. Chăn nuôi bò
sữa xuất hiện ở Việt Nam từ những năm đầu của thế kỷ XX, dưới thời kỳ Pháp
thuộc. Trong những năm 1920-1923 người Pháp đã đưa các giống bò chịu
nóng như bò Red Sindhi (thường gọi là bò Sin) và bò Ongole (thường gọi là
bò Bô) vào Tân Sơn Nhất, Sài Gòn và Hà Nội để nuôi thử và lấy sữa phục vụ

hành phân lập và nghiên cứu về Staphylococcus aureus
1.2.1. Hình thái
Staphylococcus aureus (còn được gọi là tụ cầu vàng) có dạng hình cầu,
gram (+), đường kính 0,8 – 1µm và đứng thành hình chùm nho, hình thức tập hợp
này do vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian
Trong bệnh phẩm thì vi khuẩn thường thường họp lại từng đôi một hay tạo
thành những đám nhỏ. Vi khuẩn này không di động, không có lông, không sinh
nha bào.
1.2.2. Tính chất nuôi cấy
Staphylococcus aureus phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, là
vi khuẩn kỵ khí tùy nghi. Phát triển được ở nhiệt độ 10 - 450C, mọc tốt ở 370C
nhưng tạo sắc tố tốt ở 200C.
Ở môi trường canh thang thì sau 5 - 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ
thì làm đục rõ, để lâu có thể lắng cặn.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


Ở môi trường thạch, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh, đường kính
khoảng 1 - 2 mm, có thể có màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng, tương
đối lớn sau 24 giờ.
Ở môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu hoàn
toàn. Tụ cầu vàng tiết ra năm loại dung huyết tố (hemolysin): α, β,γ, δ, ε.
1.2.3. Các yếu tố độc lực
1.2.3.1. Các protein bề mặt và các protein tiết ra môi trường
Protein A (SPA): tất cả các chủng tế bào Staphylococcus aureus đều có
lớp protein A bao xung quanh. Lớp protein này có tác dụng gắn phần Fc của IgG
và do đó vô hiệu hóa tác dụng của kháng thể này. IgG là loại kháng thể có tỷ lệ

máu ngưng lưu thông trong cơ thể.
Protein gắn ngoại tế bào (Extracellular matrix – binding Proteins, Ehb):
protein cộng hợp rất lớn ở vách tụ cầu vàng, thúc đẩy sự kết dính các protein với
vật chủ như laminin và fibronectin ở người, tạo thành các chất gian bào trên bề
mặt của biểu mô và trên bề mặt nội mô.
Các protein bề mặt hoặc protein tiết của tụ cầu vàng tham gia vào các tác
dụng sinh học khác nhau của chúng.
1.2.3.2. Các yếu tố xâm lấn
a. Hemolysin
Có 4 loại Hemolysin được xác định là α, β, γ và δ . Một chủng tụ cầu có
thể tạo thành nhiều hơn một loại hemolysin. Đó là những phẩm vật bản chất
protein gây tan máu β nhưng tác động khác nhau trên những hồng cầu khác nhau.
Chúng có tính sinh kháng. Một vài loại hemolysin gây hoại tử da tại chỗ và giết
chết sinh vật thí nghiệm.
b. Leucocidin
Mặc dù một số staphylolysin chứa độc tố bạch cầu, nhưng chỉ một độc tố
tụ cầu thật sự độc với bạch cầu và được gọi là leucocidin. Tụ cầu gây bệnh có thể
bị thực bào như tụ cầu không gây bệnh nhưng lại có khả năng phát triển bên
trong bạch cầu
Độc tố này có bản chất là protein, chúng tạo ra các protein nhiều thành
phần và gây tổn hại màng, không chịu nhiệt và gây độc cho bạch cầu người và
thỏ, không gây độc cho bạch cầu các loài động vật khác. Nó cũng có tác dụng
hoại tử da thỏ
Một số chủng S.aureus tiết ra 1 loại độc tố gọi là Panton-Valentine
leucocidin (PVL), độc tố này có mặt trong cơ thể người khỏe mạnh (khoảng
0,6%) gây triệu chứng bệnh viêm khớp, viêm phổi ở người.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


của thrombin đã có các quá trình hoạt hóa trong phức hệ dẫn đến việc chuyển đổi
fibrin (dạng không hòa tan) thành fibrinogen (dạng hòa tan).
Còn theo các nghiên cứu của Soulier, Tager và Zajden thì coagulase và
prothrombin không có hoạt tính enzyme, sự tham gia của chúng tạo nên các phức
hợp bền với các hoạt động ly giải đặc hiệu gọi là Staphylothrombin,
staphylocoagulase không có hoạt tính ly giải, chúng phản ứng một cách chuyên
biệt với các prothrombin và hoạt hóa các hợp chất này để đưa đến sự kết hợp các
fibrinogen thành khối fibrin. Sơ đồ hoạt động như sau:
Staphylocoagulase
Staphylothrombin
Prothrombin
Fibrinogen

Fibrin

Coagulase là dấu hiệu để nhận biết S.aureus trong phòng thí nghiệm. Tuy
nhiên chưa có bằng chứng nào cho thấy coagulase là một yếu tố gây độc. Một số
ý kiến cho rằng các vi khuẩn đã tự bảo vệ mình khỏi thực bào và miễn dịch bằng
cách gây đông máu
Có một vài nhầm lẫn cho rằng coagulase chính là yếu tố đông kết
(clumping). nhưng một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi thiếu coagulase thì vẫn
duy trì sự hoạt động của yếu tố đông kết, trong khi yếu tố đông kết vẫn thể hiện
coagulase 1 cách bình thường.
e. Staphylokinase

g. Một số enzyme khác
S.aureus

còn

có

thể

có

sự

hiện

diện

của

protease,

lipase,

deoxyribonuclease và các acid béo. Đây là những yếu tố để cung cấp các chất
dinh dưỡng cho các vi khuẩn và có thể nó còn gắn vai trò trong quá trình gây
bệnh. Các enzyme này giúp kéo dài sự sống của các vi khuẩn.
1.2.3.3. Các yếu tố chống lại sự tự vệ của tế bào chủ
a. Capsular polysacharide
Phần lớn các chủng lâm sàng của Staphylococcus aureus đều hiện diện
một polysacharide bề mặt của một trong hai serotype (kiểu huyết thanh) 5 hoặc 8.

Các mảnh Fc chính là các receptor cho các đại thực bào, quá trình gắn kết
trên giúp cho tụ cầu vàng tránh không bị thực bào bởi các đại thực bào
Đột biến của S.aureus thiếu protein A có hiệu quả hơn phagocytosed trong
ống nghiệm, các đột biến trong các trường hợp bị lây nhiễm thí nghiệm có hiện
tượng giảm độc tính.
c. Exofoliative exotoxins
Đây là một ngoại độc tố, gây nên hội chứng phỏng rộp và chốc lở da
(scaded skin syndrome) ở trẻ em, gồm 2 loại là ETA và ETB.
* Cơ chế gây bệnh:
ET gây ra sự phân ly bên trong lớp biểu bì giữa các lớp tế bào sống và
chết làm da phồng phồng lên, làm mất dần đi những lớp biểu bì da mất nước và
cứ thế tiếp tục nhiễm trùng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


Những độc tố này có khả năng esterase và proterase và nó tấn công những
protein có chức năng duy trì sự nguyên vẹn của các tế bào biểu bì
Bệnh thường bắt đầu với sự nhiễm trùng da tại những vị trí xác định nhưng
sau đó vi khuẩn bắt đầu sản sinh độc tố ảnh hưởng đến da trên toàn bộ cơ thể
Trẻ phát sốt, phát ban và phồng da. Phát ban bắt đầu từ miệng lan rộng
đến bụng, tay, chân. Khi vết phồng bị bể ra thì phát ban kết thúc. Lớp da ngoài
cũng bị choc ra và bề mặt trở nên đỏ. Đau giống như một vết bỏng.
1.2.3.4. Các siêu kháng nguyên
a. Toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1 )
Độc tố shock nhiễm độc thường gặp ở những người phụ nữ có kinh dùng
bông băng dày bẩn hoặc những người bị nhiễm trùng vết thương, hay còn gọi là
nhiễm trùng huyết. Độc tố này khó phân biệt với enterotoxin F của tụ cầu vàng



Trong các trường hợp nhiễm độc thức ăn do S.aureus và hội chứng sốc do
nhiễm độc lượng cytokine cao cũng gây ra những triệu chứng nhất định.
Trong hội chứng sốc nhiễm độc cũng xuất hiện các triệu chứng như của
nhiễm độc do độc tố ruột như:
-

Các độc tố ruột hoạt động như những chất kích thích phân bào hoạt hóa tất

cả các tế bào T biểu hiện 1 họ gene V (thụ thể của tế bào T).
-

Các cytokine do các tế bào T giải phóng ra khi được hoạt hóa bởi các siêu

kháng nguyên SE sẽ gây nên nhiều triệu chứng sốt, ỉa chảy, sốc trong nhiễm độc
thức ăn do S.aureus.
Trong trường hợp này ngoại độc tố của tụ cầu được gọi là độc tố 1 gây hội
chứng sốc, hoạt động như 1 siêu kháng nguyên kích thích các tế bào T hoạt hóa
đại thực bào tiết ra nhiều TNF.
Các vi khuẩn sống bên trong tế bào thực bào có khả năng hoạt hóa tế bào
T dẫn tới phá hủy các mô. Các cytokine do các tế bào T hoạt hóa tiết ra sẽ tập
trung các đại thực bào và hoạt hóa chúng để hình thành các khối u.
Các enzyme lysosom được giải phóng từ các khối u này sẽ gây ra hoại tử
đáng kể các mô.
b. Enterotoxin
* Cấu trúc:
Là những chuỗi protein đơn tương đối chịu nhiệt, mỗi chuỗi có vị trí
kháng nguyên riêng biệt. Không bị hủy bởi sự đun nấu, trọng lượng phân tử từ
28000-30000 dalton, bao gồm 6 type ký hiệu từ A-F.

SE là những protein đơn giản, hút ẩm, dễ tan trong nước và nước muối, là
những protein cơ bản, độ đẳng điện pI là 7-8,6, trừ SEG và SEH có độ đẳng điện
pI tuần tự là 5,6 và 5,7. Độ ẩm cao nhất là 277 nm, cao hơn so với những protein
thông thường.
Dù có 1 mức độ tương đồng giữa các SE, nhưng vẫn có sự khác nhau giữa
các trình tự amino acid làm cho các độc tố có các vị trí kháng nguyên khác nhau.
SE giàu lysine, acid aspartic, acid glutamid và tyrosine. Hầu hết có vòng
cystein tạo cấu trúc thích hợp có thể liên quan đến hoạt tính gây nôn. Chúng có
tính ổn định cao, kháng với hầu hết các enzyme phân hủy protein và vì thế chúng
giữ được hoạt tính trong ống tiêu hóa sau khi được ăn vào bụng.
Chúng còn kháng với chymotrypsine, rennin và papain. Đặc biệt, tính bền
nhiệt là một trong những tính chất quan trọng nhất của các SE trong lĩnh vực an
toàn thực phẩm. Chúng không bị phân hủy ở 1000C trong 30 phút, thậm chí ở
1210C trong 28 phút thì những SE vẫn giữ được hoạt tính sinh học (khi thí

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14


nghiệm trên mèo). Tính kháng nhiệt của SE trong thực phẩm cao hơn so với môi
trường nuôi cấy.
1.3. Hiểu biết về bệnh viêm vú ở bò sữa
Nguyên nhân bệnh viêm vú ở bò sữa do vệ sinh chuồng trại, vệ sinh vắt
sữa không tốt, tạo điều kiện cho các vi khuẩn (như liên cầu khuẩn, tụ cầu
khuẩn, song cầu khuẩn hay trực khuẩn gây mủ) hay nấm Candida albicals xâm
nhập vào bầu vú và gây bệnh. Sữa là môi trường rất tốt cho các loại vi khuẩn
trên phát triển. Đặc thù của bệnh là tuyến vú bị viêm, sữa bị biến đổi về lý
tính và hóa tính, làm giảm sản lượng và phẩm chất sữa. Thùy vú tổn thương,
nếu viêm nặng bầu vú teo và mất khả năng tiết sữa, thú bị đào thải. Gồm ba

1.4. Hiểu biết về màng sinh học của vi khuẩn
1.4.1. Định nghĩa màng sinh học (biofilm)
Màng sinh học là một tập hợp các vi sinh vật liên kết chặt chẽ với nhau ở
trên bề mặt vật chất và được bao bọc bởi chất nền ngoại bào (extracellular
matrix) có thành phần chính là polysaccharide (Donlan, 2002). Tế bào vi sinh vật
nằm trong màng sinh học khác biệt với những tế bào vi sinh vật tự do (planktonic
bacteria) ở các gen được biểu hiện.
1.4.2. Sự hình thành màng sinh học
Màng sinh học có thể hình thành ở tất cả các loại bề mặt hữu sinh (biotic)
như mô bào, hoặc vô sinh (abiotic) như bề mặt dụng cụ y tế, đường ống, v.v…
Sự hình thành màng sinh học là một quá trình phức tạp và ở trạng thái động.

Hình 1.1. Quá trình hình thành màng sinh học (biofilm)
Nguồn: (Simões et al., 2010)
*Chú thích:
- Substratum pre-conditioning by ambient molecules:quá trình phủ bề mặt.
- Cell deposition: tế bào lắng đọng.
- Cell adsorption: tế bào hấp phụ.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 16


- Deposition: quá trình lắng đọng.
- Cell-to-cell sigaling and onset of exopolymer production: vật chất dẫn
truyền thông tin.
- Convective and diflusive transport O2 and nutrients: vận chuyển O2 và
dinh dưỡng.
- Replication and growth: nhân rộng và tăng trưởng.

communities) được bao bọc bởi lớp polysaccharide ngoại bào, do vậy đề kháng
với kháng thể đặc hiệu, hiện tượng thực bào và sự tác động của kháng sinh. Do
tính chất lạ, màng sinh học cũng thu hút sự tập trung của đại thực bào, giải phóng
enzyme và gây ra tổn thương cho mô bào xung quanh vị trí vi khuẩn hình thành
màng sinh học. Do quá trình hình thành màng sinh học là một quá trình động, vi
khuẩn nằm trong lớp màng này có thể được giải phóng dưới dạng vi khuẩn tự do,
phát tán tới các vị trí khác trong cơ thể.

Hình 1.3. Vai trò của màng sinh học trong cơ chế sinh bệnh của vi khuẩn
Một số vi sinh vật được xác định có khả năng sản sinh màng sinh học
trong quá trình phát triển gồm: Haemophilus influenza, Escherichia coli,
Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia,
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Actinomyces israeli,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 18


Acinetobacter baumanii, Actinobacillus equuli, Aeromonas hydrophila, Listeria
monocytogenes, Salmonella enteric, Bacillus cereus, Bacillus anthracis, v.v…
(Costerton et al., 1999, Clutterbuck et al., 2007, Djordjevic et al., 2002, Scher et
al., 2005, Auger et al., 2009, Lee et al., 2007). Về thành phần vi sinh vật, màng
sinh học có thể bao gồm một hoặc nhiều loài vi khuẩn khác nhau (Thornton et
al., 2011, Yang et al., 2011).
1.4.4. Các phương pháp xác định sự hình thành màng sinh học
Hiện nay, có khá nhiều phương pháp được dùng để định tính hoặc định
lượng sự hình thành màng sinh học của vi sinh vật, ví dụ như: định lượng trên đĩa
nuôi tế bào (Tissue Culture Plate (TCP)), ống nghiệm (Tube method (TM)), thử
khả năng tạo chất nhày (slime) trên thạch bổ sung đỏ Congo (Congo Red Agar

cho rằng việc kéo dài thời gian nuôi cấy tĩnh vi khuẩn lên 48 giờ có thể làm rõ
kết quả hình thành biofilm (Freeman et al., 1989).
1.4.4.2. Phương pháp xác định biofilm trên thạch bổ sung đỏ Congo
Phương pháp này lần đầu tiên được mô tả bởi (Freeman et al., 1989) nhằm
cải tiến những nhược điểm của phương pháp ống nghiệm của (Christensen et al.,
1982). Trong phương pháp này, vi khuẩn được ria cấy trên thạch BHI (brain
heart infusion agar) được bổ sung thuốc nhuộm đỏ Congo ở nồng độ 0,08%.
Theo tác giả (Freeman et al., 1989), cơ chế cụ thể của thuốc nhuộm Congo trong

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 20