B GIÁO DC VÀ ÀO TO
TRNG I HC M TP. H CHÍ MINH


BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

Tên đ tài:
ÁNH GIÁ KH NNG I KHÁNG VI VI
KHUN Vibrio paraheamolyticus PHÂN LP T
MU TÔM BNH HOI T GAN TY (AHPNS)
CA MT S CHNG Bacillus

KHOA CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGHÀNH: VI SINH – SINH HC PHÂN T

GVHD : Ths. NGUYN THANH THUN
Ths. NGUYN VN MINH
SVTH : LÊ ANH TUN
MSSV : 1053010888
KHÓA : 2010 – 2014

Tp. H Chí Minh, tháng 5 nm 2014
LI CM N
 hoàn thành đ tài này, ngoài s c gng ca bn thân còn có s hng
dn ca thy cô, anh ch và s giúp đ ca bn bè.
u tiên, em xin chân thành cm n tt c các thy cô Khoa Công ngh Sinh
Hc trng i Hc M Tp. H Chí Minh đã truyn đt cho em nhng kin thc
nn tng nht, em xin cm n thy Nguyn Thanh Thun, thy Nguyn Vn Minh,
cô Dng Nh
t Linh và thy an Duy Pháp luôn bên cnh đnh hng, truyn đt
kinh nghim, đng viên em hoàn thành đ tài.

1.2.2 Tình hình dùng hóa cht, kháng sinh điu tr bnh  tôm 9
1.3 BNH HOI T GAN TY EMS/AHPNS TRÊN TÔM TH 11
1.3.1 Tình hình dch bnh 11
1.3.2 Tác nhân gây bnh 13
1.3.3 Mt s đc đim ca Vibrio parahaemolyticus 14
1.4 GII THIU PROBIOTIC VÀ VIC NG DNG TRONG NUÔI
TRNG THY SN 15
1.4.1 nh ngha probiotic 15
1.4.2 iu kin yêu cu cho probiotic 16
1.4.3 Vai trò ca probiotic trong nuôi trng thy sn 16
1.5 GII THIU V Bacillus 19
1.5.1 c đim chung ca chi Bacillus 19
1.5.2 ng dng ca Bacillus trong nuôi trng thy sn 21
1.5.3 S dng ch phm sinh hc t Bacillus đ kim soát mm bnh
do Vibrio 21
CHNG 2. VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU 24
2.1 THI GIAN VÀ A IM NGHIÊN CU 25
2.2 VT LIU NGHIÊN CU 25 
SVTH: Lê Anh Tun

ii
2.2.1 Chng vi sinh vt 25
2.2.2 Tôm dùng đ th nghim 25
2.2.3 Môi trng - hóa cht 25
2.2.4 Thit b - dng c 26
2.3 PHNG PHÁP NGHIÊN CU 27
2.3.1 Hot hóa ging 27

SVTH: Lê Anh Tun

iii
PH LC 2 74


SVTH: Lê Anh Tun

iv

Bng 3.1 Kt qu phân lp 41
Bng 3.2 Kt qu nhum Gram 7 chng phân lp đc t mu bnh 45
Bng 3.3 Kt qu đnh danh Vibrio sp. NT
7
45
Bng 3.4 Kt qu LD
50
ca chng Vibrio parahaemolyticus NT
7
48
Bng 3.5 Kt qu th đi kháng bng phng pháp cy vch vuông góc 49
Bng 3.6 Kt qu th kh nng đi kháng bng phng pháp đc l thch 51
Bng 3.7 Kt qu th nghim tính an toàn ca chng Bacillus sp. F
33
54
Bng 3.8 T l tôm sng sau khi cm nhim vi V. parahaemolyticus NT
7
(%) 54

SVTH: Lê Anh Tun

vi
DANH MC CÁC HÌNH


Hình 3.6 Kt qu th nghim bng phng pháp đc l thch 53

SVTH: Lê Anh Tun

vi
DANH MC S 






S đ 2.1 Phng pháp thí nghim 27
S đ 2.2 S đ th đi kháng bng phng pháp đc l thch 37

SVTH: Lê Anh Tun

vi
DANH MC BIU  VÀ  TH


Biu đ 3.1 Kh nng đi kháng ca Bacillus spp. đi vi Vibrio parahaemolyticus
NT
7
52
 th 3.2. T l tôm sng sau khi cm nhim Vibrio parahaemolyticus NT
7
55
KHÓA LUN TT NGHIP T VN 


Necrosis Syndrome (AHPNS) (Flegel và cs., 2012).
 Vit Nam, cn bnh này đã xut hin t nm 2010, nhng s tàn phá rng
rãi nht do EMS ch đc báo cáo k t tháng 3 nm 2011  đng bng sông Cu
Long (Vit Nam). Nó 
nh hng chính đn khu vc sn xut tôm: Tin Giang, Bn
Tre, Kiên Giang, Sóc Trng, Bc Liêu và Cà Mau vi tng din tích ao tôm khong
98.000 ha. Trong tháng 6 nm 2011, thit hi cha tng thy  tôm sú đã đc báo
cáo trong 11.000 ha nuôi tôm  Bc Liêu, 6.200 ha ti Trà Vinh (tng cng 330
triu con tôm đã cht gây thit hi trên 12 t đng), và 20.000 ha ti Sóc Trng (gây
ra thit hi 1,5 nghìn t) (Mooney, 2012).
Trong nm 2010, hi chng t vong sm (EMS) xut hin trên các trang tri
nuôi tôm  min nam và trên đo Hi Nam ca Trung Quc. AHPNS đã đc xác
nhn ti Vit Nam và Malaysia nm 2011 và bnh đn Thái Lan trong nm 2012.
Bnh xut hin trong vòng 20-30 ngày sau khi th ging, tôm sú và tôm th chân
trng. Tôm b bnh tr nên l đ, ngng n, d dày và rut trng rng, v mng,
màu sc nht nht, tng trng chm, gan ty xanh xao, nhng và teo và t l cht
KHÓA LUN TT NGHIP T VN 

SVTH: Lê Anh Tun

3
lên ti 100% làm cho các ao nuôi tôm b nh hng nghiêm trng (Lightner và cs.,
2012).
Vào đu nm 2013, phòng thí nghim bnh hc trên nuôi trng thy sn i
hc Arizona đã có th cô lp tác nhân gây bnh EMS/AHPNS trong môi trng
nhân to. Th nghim ly t các mu thc đa cho thy nguyên nhân gây bnh là do
vi khun Vibrio parahaemolyticus (Lightner và cs., 2012).
Nm 2013, mt nghiên cu ca Lingtner và cs. cho thy Vibrio
parahaemolyticus b nhim phage (mt th thc khun) làm cho đc t c
a vi khun

Tuyn chn và sàng lc nhng chng Bacillus đi kháng mnh vi vi khun
Vibrio parahaemolyticus phân lp t mu tôm th bnh hoi t gan ty (AHPNS).
Ni dung thc hin:
- Tái phân lp chng Bacillus t b su tp chng ca phòng thí nghim Công
ngh vi sinh.
- Phân lp Vibrio parahaemolyticus t mu tôm bnh.
- Th nghim LD
50
.
- Th đi kháng vi mt s chng Bacillus.
- Th nghim tính an toàn và kh nng bo v ca chng Bacillus lên tôm
ging. KHÓA LUN TT NGHIP TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: Lê Anh Tun
5










chân trng ca Trung Quc nm 2003 đt 600 nghìn tn (chim 76% tng sn lng
tôm nuôi ti nc này); đn nm 2008 tôm th chân trng đt sn lng 1,2 triu tn
(trong tng s 1,6 triu tn tôm nuôi). Inđônêxia nhp tôm th chân trng v nuôi t
nm 2002 và nm 2005 đt 40 nghìn tn, n
m 2007 là 120 nghìn tn (trong tng sn
lng 320 nghìn tn).
Nm 2004, tôm th chân trng dn đu v sn lng tôm nuôi, đóng góp trên
50% tng sn lng tôm nuôi trên th gii. Nm 2007, tôm th chân trng chim
75% tng sn lng tôm nuôi toàn cu và là đi tng nuôi chính  3 nc châu Á
(Thái Lan, Trung Quc, Inđônêxia). Ba nc này cng chính là nhng quc gia dn
đu th gii v nuôi tôm.
KHÓA LUN TT NGHIP TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: Lê Anh Tun
7
n nm 2003 thì các nc châu Á bt đu nuôi đi tng này và sn lng
tôm th chân trng trên th gii đt khong 1 triu tn, t đó sn lng tôm liên tc
tng nhanh qua các nm, đn nm 2010 sn lng tôm đt khong 2,7 triu tn
(FAO, 2011). n nm 2012 sn lng tôm đt khong 4 triu tn (GOAL 2013).
Các nc nuôi tôm ch yu trên th gii gm Trung Quc, Thái Lan, Indonesia,
Brazil, Ecuador, Mexico, Venezuela, Honduras, Guatemala, Nicaragua, Belize, Vi
t
Nam, Malaysia, Thái Bình Dng, Peru, Colombia, Costa Rica, Panama, El
Salvador, Hoa K, n , Philippines, Campuchia, Suriname, Saint Kitts, Jamaica,
Cuba, Cng hòa Dominica, Bahamas (FAO, 2012). Trong đó Trung Quc có sn
lng cao nht th gii đt khong 1,3 triu tn vào nm 2012 (GOAL, 2012). Hình
thc nuôi ch yu là thâm canh và siêu thâm canh. D kin sn lng tôm th chân
trng đt sn lng khong 6 triu tn vào nm 2015 (GOAL, 2012).
1.1.2 Tình hình nuôi tôm th chân trng  Vit Nam
Tôm th chân trng đc đa vào Vit Nam nm 2001 và đc nuôi th

2006 18.441 57.185 3.100
2007 19.919 64.776 3.250
2008 15.079 47.827 3.170
2009 21.339 89.521 4.190
2010 25.397 136.719 5.380
2011 28.683 152.939 5.330
2012 41.789 186.197 4.460
Tháng 9 -2013 47.300 106.479 2.251
Ngun: Tng cc thy sn, 2013.
1.2 TÌNH HÌNH DCH BNH
1.2.1 Mt s bnh do Vibrio gây ra trong nuôi trng thy sn
Bnh do mt s loài vi khun thuc nhóm Vibrio spp. đã đc công b là tác
nhân gây bnh nghiêm trng  mt s đi tng nuôi thy sn (Austin và cs., 1993).
Bên cnh V. anguillarum và V. ordalii đc xem là mt trong nhng tác nhân gây
bnh ch yu thuc nhóm Vibrio spp., mt s loài thuc nhóm này cng đc công
b là tác nhân gây bnh  mt s đi tng nuôi thy sn quan trng. Mt s tr
ng
hp đin hình nh: V. vulnificus  cá chình Anguilla anguilla (Biosca và cs., 1991);
V. alginolyticus  cá tráp Sparus aurata và cá mú Epinephelus malabaricus
(Colorni và cs., 1981; Lee 1995); V. salmonicida  cá hi (Austin và cs., 1993).
Mt s loài vi khun Vibrio có kh nng phát sáng nh V. harveyi, V.
splendida, V. orientalis, V. fischeri, V. vulnificus. Trong đó, V. harveyi đã đc xác
đnh là tác nhân gây bnh phát sáng  trai ngc Pinctada maxima, tôm sú Penaeus
KHÓA LUN TT NGHIP TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: Lê Anh Tun
9
monodon và tôm he Nht Bn Penaeus japonicus (Lavilla-Pitogo và cs., 1990;
Karunasagar và cs., 1994). Bnh do nhóm vi khun phát sáng đã gây thit hi kinh
t trong nuôi tôm công nghip  Philipines, n  và Indonesia. Các nghiên cu

vn sng sót, bi chúng đã mang gen kháng thuc. Bt c mm bnh nào tr li
KHÓA LUN TT NGHIP TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: Lê Anh Tun
10
trong ao hay các b cha t rut cá hay t đng ng nc, đu có th trao đi gen
vi các vi khun kháng thuc và còn khe hn trc. Do vy, các mm bnh kháng
thuc phát trin rt nhanh do đi th cnh tranh đã b loi tr. Nng đ tetracycline
không đ mnh đ dit tr vi khun, do vy t l truyn gen gia Vibrio cholerae và
Aeromonas salmonicida tng 100 ln.
i
u đáng quan tâm là mô hình nuôi tôm  các h dân đa phn không có h
thng x lý nc thi. Do vy lng hóa cht này cùng nc thi ca h nuôi đa
trc tip ra môi trng và gây ô nhim ngun nc, to thành vòng lun qun ô
nhim cho ngi nuôi tôm, gây tác hi cho h sinh vt trong môi trng. Nu ch
mt vài h nuôi x b cht thi kiu đó ra bin thì không sao, nhng vài chc h
dân cùng th
i nc nh vy t hn c vùng bin b ô nhim, ngun bin li thông
vi các ca sông nên nh hng li càng nghiêm trng hn. c bit, cn ht sc
thn trng khi s dng thuc tr sâu hu c bi l chúng có đc tính và kh nng n
đnh rt cao, gây nh hng đn cht lng sn phm nuôi trng và s
c khe con
ngi do c ch tích ly sinh hc.
Các loi phân bón nh Superphotphat urê, phân trâu bò, phân gà,… dùng đ
tng cng s sinh trng ca các đi tng làm thc n cho tôm cng có th góp
phn làm tng thêm ti trng cht dinh dng vô c hay hu c cho thy vc nuôi.
Tóm li, vn đ s dng hóa cht cng nh kháng sinh ch gii quyt tình
trng bnh trong thi đi
m nht thi nng nó li mang đn không ít tác hi trong
đi sng và kinh t nh sau:

 phía đông vnh Thái Lan (Flegel, 2012; Enduardo và cs., 2012).
Bnh nh hng nghiêm trng đn trang tri nuôi tôm  ông Nam Á, nh
hng lên c tôm sú (Penaeus monodon) và tôm chân trng (Penaeus vannamei),
đc đc trng bi vic cht hàng lot (có th lên đn 100% trong mt s trng
hp) trong 20-30 ngày đu tiên th nuôi (sau th ging trong ao nuôi thng phm).
Du hiu lâm sàng có th quan sát đc bao gm: tng trng chm, bi xon c,
v m
m, cng nh màu sc nht nht. Tôm b nh hng cng đu cho thy du
hiu bt thng  gan ty (teo tóp li, nh, sng hoc đi màu). Các tác nhân gây
bnh chính (xem xét bnh có th lây bnh) cha đc xác đnh, trong khi s hin
din ca mt s vi khun bao gm c vi khun Vibrio, Microsporidians và giun tròn
đã đc quan sát thy trong mt s mu. (Lightner và cs., 2012)
 Trung Qu
c, s xut hin ca EMS nm 2009 ban đu không đc chú ý
bi hu ht nông dân. Nhng trong nm 2011, s bùng phát tr nên nghiêm trng
hn, đc bit trong các trang tri vi thâm niên nuôi hn 5 nm và nhng ni gn
KHÓA LUN TT NGHIP TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: Lê Anh Tun
12
hn vi bin bng cách s dng nc rt mn (Panakorn, 2012). Nuôi tôm  Hi
Nam, Qung ông, Phúc Kin và Qung Tây b trong na đu nm 2011 vi gn
80% b thit hi.
Ti Malaysia, EMS ln đu tiên đc báo cáo vào gia nm 2010  b bin
phía đông ca bán đo bang Pahang và Johor. Các  dch EMS dn đn s st gim
đáng k trong sn xut tôm th chân tr
ng, t 70.000 tn nm 2010 xung 40.000
tn trong nm 2011. Sn xut trong nm 2012 (đn tháng 7) ch là 30.000 tn và ti
t hn d kin báo cáo cha đc xác nhn nh trên dch EMS ti các bang Sabah
và Sarawak đn tháng t nm 2012 (Enduardo và cs., 2012).

1.3.2 Tác nhân gây bnh
Vào đu nm 2013, phòng thí nghim bnh hc trên nuôi trng thy sn i
hc Arizona đã có th cô lp tác nhân gây bnh EMS/AHPNS trong môi trng
nhân to. Th nghim ly t các mu thc đa cho thy nguyên nhân gây bnh là do
vi khun Vibrio parahaemolyticus (Lightner và cs, 2012).
Hin nay đã có nhiu công b tác nhân gây bnh EMS/AHPNS, nhóm
nghiên cu ca TS. Lightner đã phát hin thy rng EMS đc gây ra bi mt loi
vi khun (Vibrio parahaemolyticus) b nhim phage (mt th
 thc khun) làm cho
đc t ca vi khun tng lên. Chúng xâm chim đng tiêu hóa ca tôm và sinh ra
đc t gây phá hy mô và ri lon chc nng ca gan ty, c quan tiêu hóa ca tôm
(theo FAO); (Lightner và cs, 2012).
Tác đng ca vi khun Vibrio parahaemolyticus đã đc đa ra nhiu ln.
Vibrio parahaemolyticus tip tc đc phân lp t tôm b nhim EMS / AHPNS.
Da trên công vic thc hin  Trung Quc, các nhà nghiên cu Trung Quc đã báo
KHÓA LUN TT NGHIP TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: Lê Anh Tun
14
cáo v đc lc ca mt chng V. parahaemolyticus phân lp t tôm th chân trng
b bnh t vong sm trong nm 2010 ti tnh Qung Tây (Zhang và cs., 2012).
1.3.3 Mt s đc đim ca Vibrio parahaemolyticus
1.3.3.1 Phân loi
Theo phân loi ca Bergey (1994) Vibrio parahaemolyticus thuc
Ngành: Proteobacteria
Lp: Gammaproteobacteria
B: Vibrionales
H: Vibrionaceaae
Chi: Vibrio
Loài: Vibrio parahaemolyticus

nh lý nh chm ln, l đ, c th
chuyn sang màu đ và cht (Abhay và cs., 2003). V. parahaemolyticus cng đc
ghi nhn cùng vi V. harveyi và V. vulnificus đã gây cht tôm nuôi  Thái Lan
(Nash và cs., 1992), Philiphine (Lavilla và cs., 1998), n  (Jayasree và cs.,
2006), liên quan đn mt s bnh nh nhim khun cc b, nhim khun trên gan
ty trên tôm sú, hi chng đ thân và mm v trên tôm (Lightner, 1996).
 Vit Nam, nhng dng nhim vi khun phát sáng thng thy
 tri sn
xut hoc ng tôm ging. Khi vi khun phát sáng hin trong c th tôm vi s
lng ln có th làm tôm nhim bnh phát sáng, có th quan sát đc trong bóng
ti. Vibrio phát sáng có th phát thành dch và gây cht đn 100% u trùng tôm, tôm
ging và k c tôm trng thành. Chính vì vy mà bnh phát sáng  tôm đc lit
kê vào danh sách các ch tiêu kim dch tôm ging.  các tri sn xut tôm ging,
thuc kháng sinh hin v
n là cách ph bin s dng đ phòng tr bnh phát sáng.
1.4 GII THIU PROBIOTIC VÀ VIC NG DNG TRONG NUÔI
TRNG THY SN
1.4.1 nh ngha probiotic
Vi khun Vibrio là mt thm ha cho ngh nuôi tôm khi vic s dng kháng
sinh đ tr không còn tác dng nhiu mà ngc li còn có th làm cho vi khun
kháng thuc (Moriarty, 1999). Vì vy vic s dng ch phm sinh hc đang tr
thành xu hng cng nh gii pháp mi đ kim soát tính hình dch bnh nh hin
nay.
Probiotic có ngun gc t ting Hy Lp bao gm hai t
"pro" có ngha là
dành cho và "bios" có ngha là s sng (Sahu và cs., 2008). Thut ng probiotic vn

Trích đoạn VT LIU NGHIÊN CU Th tính an toàn ca ch ng Bacillus lên tôm ging

---