TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
NGUYỄN THỊ THOA ĐỘC LỰC VÀ THÀNH PHẦN PROTEIN CỦA CÁC
CHỦNG VI KHUẨN Vibrio alginolyticus PHÂN LẬP TỪ
CÁ CHẼM (Lates calcarifer) BỊ BỆNH LỞ LOÉT TẠI
CÁC BÈ NUÔI THƯƠNG PHẨM Ở KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SỸ Cán bộ hướng dẫn Khoa học: TS. Nguyễn Hữu Dũng Nha Trang, tháng 07/2011
ii
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu nhà trường Đại Học
Nha Trang, các thầy cô khoa Nuôi Trồng Thủy Sản đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp thạc sỹ.
Nhân đây tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến sự chỉ dẫn tận tình, những góp
ý quý báu, kịp thời của thầy giáo hướng dẫn TS. Nguyễn Hữu Dũng. Tôi cũng xin
chân thành cảm ơn Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thanh Thùy đã luôn bên cạnh và
hướng dẫn nhiệt tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi nghiên cứu tại
hợp phần bệnh, dự án Nufu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản
III, Giám đốc Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa
Dịch bệnh Thủy sản khu vực miền Trung, trưởng phòng bệnh Thủy sản và Dự báo,
Giám đốc Trung tâm Quốc gia Giống hải sản miền Trung, các anh chị và các bạn
đồng nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện về thời gian để tôi có thể tham gia và hoàn
thành khóa học. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban điều phối dự án NUFU đã cung cấp
mọi điều kiện vật chất trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt
nghiệp.
Và cuối cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình tôi: Bố, mẹ cùng anh, chị và các em,
1.4.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của V. alginolyticus 9
1.4.4. Yếu tố gây độc của V. alginolyticus 11
Chương II: Phương pháp nghiên cứu 14
2.1. Địa điểm, thời gian, đối tượng nghiên cứu 14
2.2. Phương pháp nghiên cứu 14
2.2.1. Phương pháp thu thập, lưu giữ và phục hồi chủng 14
2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa 14
2.2.3. Nghiên cứu độc lực, LD
50
của vi khuẩn 16
2.2.3.1. Chuẩn bị vi khuẩn kiểm tra độc lực 16
2.2.3.2. Bố trí thí nghiệm 17
2.2.3.3. Phân lập lại vi khuẩn 18
iv
2.2.4. Phương pháp phân tích thành phần protein và lipopolysaccharides (LPS)
của vi khuẩn 19
2.2.4.1. Phương pháp nhuộm Pr 20
2.2.4.2. Phương pháp nhuộm LPS 21
2.3. Phương pháp xủ lý số liệu 22
Chương III: Kết quả nghiên cứu 23
3.1. Đặc điểm sinh hóa và hính thái của 4 chủng V. alginolyticus gây bệnh lở loét
trên cá chẽm nuôi lồng bè thương phẩm tại Khánh Hòa 23
3.2 Kết quả kiểm tra độc lực của 4 chủng V. alginolyticus 25
3.2.1 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CH10 26
3.2.2 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CoS01 28
3.2.3 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CoK03 30
3.2.4 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CoVL03 31
3.2.5. Kết quả phân lập trở lại V. alginolyticus 32
3.2.6. Kết quả kiểm tra độc lực 4 chủng V. alginolyticus đợt 2 33
3.3 Thành phần Protein và LPS của 4 chủng V. alginolytics 35
Tris: Electrophoresis purity reagent Tris (hydrorymethyl) - aminomethane
Rpm: Revolutions per minute
KDa : Kilodalton
DNA : Deoxyribonucleic acid
TSA: Tryptic Soy Agar
TSB: Tryptic Soy Broth
API: Analytical Profile Index
TCBS: Thiosulphate Citrate Bile Salt Agar
CFU: Colony forming units.
LD
50
: Mean Lethal Dose, 50% (Liều gây chết 50%).
NMSL: Nước muối sinh lý.
LPS : lipopolysaccharides
P : page (trang)
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Sản lượng cá chẽm (Lates calcarifer) theo quốc gia giá trị ở khu vực
châu Á - Thái Bình Dương từ năm 1997 đến 2006 3
Hinh 1.2. Sản lượng cá chẽm (cột) và giá trị (đường) của cá chẽm nuôi ở Australia
từ năm 1986 đến năm 2004 5
Hình 2.1. Sơ đồ khối phân lập vi khuẩn sau cảm nhiễm 18
Hình 3.1. Đặc điểm sinh hóa trên test kit API - 20E của vi khuẩn V. alginolyticus 25
Hình 3.2. Đặc điểm hình thái vi khuẩn V. alginolyticus trên môi trường TCBS và
nhuộm Gram 25
1
MỞ ĐẦU
Nghề nuôi cá biển Việt Nam trong vài năm trở lại đây đã phát triển mạnh mẽ. Nhiều
đối tượng cá biển được đưa vào nuôi với nhiều hình thức nuôi ao đìa hoặc nuôi lồng, bè.
Trong đó, cá chẽm với nhiều ưu điểm như lớn nhanh, phân bố rộng muối, có giá trị kinh
tế, và đã được nghiên cứu sản xuất giống nhân tạo thành công, nên nghề nuôi cá chẽm đã
phát triển mạnh ở khu vực miền Trung (Khánh Hòa, Phú Yên) và một số nơi ở phía Bắc
như Hải Phòng, Quảng Ninh … Đến nay cá chẽm trở thành đối tượng nuôi xóa đói giảm
nghèo, thay thế các đối tượng nuôi khác đang bị suy thoái. Tuy nhiên, trong quá trình
nuôi do kỹ thuật chăm sóc, quản lý môi trường còn nhiều hạn chế nên nghề nuôi cá chẽm
đang đối mặt với nhiều đợt dịch bệnh gây thiệt hại kinh tế cho người nuôi.
Trong thời gian gần đây, cá chẽm nuôi thương phẩm ở vùng biển Vũng Ngán -
Nha Trang bị bệnh lở loét trên thân với tốc độ lây lan nhanh, gây chết khoảng 80% trong
vòng 1 tuần, bệnh xảy ra ở tất cả các cỡ cá nuôi, từ cá mới thả nuôi cho đến cá đã nuôi lớn
(2 - 3kg). Nguyên nhân ban đầu xác định do vi khuẩn Vibrio alginolyticus gây ra.
Trước tình hình thực tế trên và để có cơ sở cho việc xác định chính xác tác nhân
gây bệnh, nghiên cứu vaccin phòng bệnh trên cá biển nuôi, tôi đề xuất thực hiện đề tài: “
Độc lực và thành phần Protein của các chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ
cá chẽm (Lates calcarifer) bị bệnh lở loét tại các bè nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa”.
Mục tiêu của đề tài:
Xác định mối tương quan giữa độc lực và thành phần protein của chủng vi khuẩn
V.alginolyticus phân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét để làm cơ sở cho nghiên cứu sản xuất
vaccin phòng bệnh trên cá biển nuôi, giúp giảm thiệt hại và nâng cao hiệu quả kinh tế cho
nghề nuôi cá biển.
Nội dung thực hiện đề tài:
1. Đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn V.alginolyticus
2. Xác định độc lực của chủng vi khuẩn V.alginolyticus
3
Chương I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và Việt Nam
1.1.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới
Cá chẽm có giá trị dinh dưỡng cao, là loài phân bố rộng và dễ nuôi nên đã trở
thành một trong những đối tượng được lựa chọn để phát triển nuôi chính cho ngành nuôi
trồng thủy sản ở nhiều nước trong khu vực. Kỹ thuật nuôi cá chẽm được phát triển lần đầu
tiên ở phòng thí nghiệm Songkhla Marine (Thái Lan) từ những năm đầu của thập niên
1970 và sau đó phát triển rộng ra các nước trong khu vực như Trung Quốc, Ấn Độ,
Indonesia, Malaysia, Phillipines, Singapore, Đài Loan, Việt Nam và Australia, và gần đây
ở một số quốc gia như Mỹ, Hà Lan, Anh và Israel [35].
Từ năm 1997 đến năm 2006, sản lượng cá chẽm hàng năm ở khu vực châu Á -
Thái Bình Dương luôn ở trong khoảng từ 20.000 - 27.000 tấn, phần lớn cá chẽm được
nuôi hồ hoặc lồng ở vùng nước lợ cửa sông hoặc bờ biển [36]. Năm 2004, sản lượng cá
chẽm khoảng 25.399 tấn, năm 2005 khoảng 26.584 tấn [61] và năm 2006 tăng lên 27.522
tấn
[62].
chẽm của Malaysia là 4.003,73 tấn (năm 2002), 4.210,93 tấn (năm 2003), và 4.000,54 tấn
(năm 2004) [36].
Indonesia: Là quốc gia có sản lượng cá có vảy (finfish) biển lớn nhất trong khu
vực Đông Nam Á. Trong đó cá chẽm cũng là một trong những loài nuôi chính của nước
này với sản lượng năm 2004 vào khoảng 2.900 tấn
[36].
Singapore: Dự tính đến năm 2012 sản lượng cá chẽm là 3.000 tấn và đến năm
2020 sản lượng sẽ tăng lên 20.000 tấn [94].
Hàn Quốc: Tổng sản lượng cá nuôi của Hàn Quốc năm 2003 khoảng 72.393 tấn,
trong đó cá chẽm khoảng 2.778 tấn [36].
Australia: Cá chẽm được nuôi ở hầu hết các bang của Australia (ngoại trừ bang
Tasmania)[36], [93], nhưng sản lượng cá chẽm tập trung chủ yếu ở Queensland (phần lớn
là nuôi nước ngọt), Northern Territory (nuôi lồng biển và nuôi ao nước lợ) và Nam
Australia (nuôi nước ngọt) [26]. Cá chẽm được nuôi công nghiệp bắt đầu từ những năm
1980, hiện nay có khoảng 100 trang trại được cấp phép nuôi [93]. Theo dữ liệu của FAO
năm 2004, sản lượng cá chẽm khoảng 1.600 tấn, giá trị đạt 9,9 triệu USD [36]. Theo báo
cáo của O’Sullivan và cộng sự (2005) niên vụ 2003/2004 sản lượng cá chẽm khoảng
2.800 tấn, đạt giá trị 17,6 triệu USD [36]. Niên vụ 2008/2009 sản lượng cá chẽm cả nước
ước khoảng 6.000 tấn và sẽ tăng lên 7.000 tấn trong niên vụ 2009/2010 [93]
.
5
Hình 1.2
S
ản l
ư
ợng cá chẽm (cột) v
à giá tr
ị (đ
ư
ờng) của cá chẽm nuôi ở
Australia từ năm 1986 đến năm 2004 (nguồn FAO, 2006 được trích dẫn bởi [36].
6
hiện nhiều đốm xuất huyết trên bề mặt cơ thể gây lở loét, xuất huyết dưới da và phần cơ.
Đôi khi phần mô xung quanh hậu môn bị viêm và sưng đỏ. Nội quan bên trong cũng bị
sung huyết ở gan, lá lách và thận, thường đi kèm bị hoại tử. Bệnh xảy ra ở nhiều loài cá
biển và cửa sông, chúng thường xuất hiện khi môi trường nước xấu, cá bị sốc và thiếu
dinh dưỡng [35]. Khi nhiễm Vibrio, cơ thể cá trở nên sậm màu, lờ đờ, chán ăn, có các vết
loét đỏ trên cơ thể, tích dịch ở bụng [32].
Nghiên cứu của Renaul cho thấy V. damsela là nguyên nhân gây chết hàng loạt ở
cá chẽm con nuôi ở Tahiti (nằm ở khu vực Thái Bình Dương, thuộc Pháp), dấu hiệu chính
của bệnh là cá lờ đờ, xuất huyết ở gốc đuôi và lở loét lan rộng ra [59].
Theo nghiên cứu của Ransangan và cs (2009) thấy sự xuất hiện bệnh do Vibriosis
gây ra cá chẽm Lates calcarifer nuôi lồng ở Malaysia gây tỷ lệ chết cao, tác động rất lớn
đến sản lượng cá nuôi ở nước này. Thông thường cá ở giai đoạn nhỏ biểu hiện bỏ ăn, cơ thể
sậm màu, sau đó chết hàng loạt. Ở giai đoạn trưởng thành, cá có biểu hiện xuất huyết quanh
hậu môn và các gốc vây. Từ các mẫu bệnh nghiên cứu đã phân lập được 21 chủng vi khuẩn
từ các cơ quan bên trong như thận, tim, lá lách và gan. Dựa vào đặc điểm hình thái và hóa
sinh đã xác định sự có mặt của V. alginolyticus [56].
Bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết do Pseudomonas sp. gây ra và tác động lên cá ở
tất cả các giai đoạn phát triển và gây cá chết từ 20 – 60%. Kumaran
biển ở Northern Territory (Australia) năm 2005. Trong trường hợp cấp tính, cá có thể gần
chết hoặc chết với một vài dấu hiệu bên ngoài và trong các nội tạng. Trong trường hợp ít
trầm trọng hơn thì cá bị nhiễm bệnh có thể bơi nhấp nhô gần mặt nước, có thể bị mù và
không đáp ứng với sự kích thích bên ngoài, xuất huyết có thể thấy ở da và đặc biệt ở chân
vây. Cầu mắt bị lồi và xuất huyết bên trong mắt, mang bị xung huyết. Bên trong, sự xuất
huyết nhiều có thể thấy ở bề mặt của các nội quan lớn, thường thì cơ xương có màu đỏ
hồng [35].
Ngoài ra vi khuẩn Flexibacter cũng liên quan đến bệnh lở loét ở cá. Flexibacteriosis
nước mặn gây bệnh ở cá nuôi và cá ngoài tự nhiên ở châu Âu, Nhật Bản, Bắc Mỹ và
Australia [76], [57], [20], [24], [37], [68], [14]. Trong nhóm cá nuôi, căn bệnh này đã
được báo cáo ở cá chẽm. Bệnh xuất hiện trên cả cá trưởng thành và cá giống, tuy nhiên cá
nhỏ chịu ảnh hưởng bệnh nặng hơn cá lớn. Bệnh gia tăng về tỷ lệ và mức độ nghiêm trọng
khi nhiệt độ nước nuôi cao (trên 15
o
C). Ngoài ảnh hưởng bởi nhiệt độ nước, bệnh này ảnh
hưởng bởi điều kiện gây sốc của môi trường (stress) và yếu tố liên quan đến vật chủ (điều
kiện bề mặt da). Nhìn chung, cá bị bệnh biểu hiện miệng bị xuất huyết và mòn cụt, lở loét
ở da, vây bị xơ và thối đuôi [52].
1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên cá chẽm ở Việt Nam
Ở Việt Nam, theo báo cáo “ Tổng quan về các bệnh nguy hiểm thường gặp trên
động vật nuôi biển” của Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc Du (2007) thuộc viện Nghiên
Cứu Nuôi trồng Thủy sản II cho thấy một số vi khuẩn như: Vibrio anguillarum, V. ordalii,
V. salmonicida, V. vulnificus là tác nhân chủ yếu gây lên bệnh lở loét trên cá mú, cá chẽm
8
khu vực Đông Nam Á với biểu hiện: xuất huyết, đốm đỏ, lở loét, vây bị ăn mòn [1]. Kết
quả nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy, vi khuẩn Vibrio tồn tại rất phổ biến ở nước biển
ven bờ, mật độ Vibrio trong nước biển ven bờ có thể tăng lên nhiều lần vào các ngày biến
động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới [3].
Ở Việt nam, trong nghề nuôi cá lồng trên biển, bệnh Flexibacter đã xảy ra ở một số
tại ở mẫu hải sản bán phổ biến ở chợ tại Jakarta [43].
Vi khuẩn V. alginolyticus xuất hiện với tần số cao hơn so với V. parahaemolyticus
đã được báo cáo trong các mẫu nước biển và hải sản thu thập tại Na Uy, Hà Lan, và Nhật
Bản [34], [44], [67]. Sự phong phú tương đối của V. alginolyticus và V. parahaemolyticus
trong nước biển nhiệt đới và các nguồn hải sản ít được nghiên cứu, nhưng một báo cáo
gần đây cho thấy một tỷ lệ lớn các mẫu cá biển tươi sống thu được khuẩn lạc màu vàng
hơn là khuẩn lạc xanh trên môi trường thạch TCBS [69]. Sakazaki đã đề xuất V.
alginolyticus là một chỉ số so sánh cho bề mặt bị ô nhiễm thứ cấp của hải sản và đồ dùng
so với V. parahaemolyticus. Tuy nhiên, đề xuất này nên áp dụng đối với các vùng ở khu
vực nhiệt đới, nơi và 2 loài vi khuẩn V. alginolyticus và V. parahaemolyticus phát triển
phong phú [67].
Theo Zhi, V. alginolyticus được phát hiện từ mẫu tôm ướp muối từ vụ ngộ độc thực
phẩm, là tác nhân gây bệnh thông qua điều tra dịch tễ và kiểm tra nguyên nhân gây bệnh.
V. alginolyticus gây nhiễm trùng máu cho người và nhiễm vào vết thương và nó được tìm
thấy từ mẫu phân của người bị tiêu chảy chưa tìm được nguyên nhân gây bệnh. Từ các
mẫu thức ăn dẫn đến ngộ độc thức phẩm [82]. Vi khuẩn V. alginolyticus cũng liên quan
đến dịch bệnh ở cá biển nuôi và tự nhiên cũng như dịch bệnh ở ấu trùng và con giống của
nhuyễn thể và giáp xác trên thế giới [84], [81], [19], [41]. Dựa vào nghiên cứu của
Hörmansdorfer, V. alginolyticus được tìm thấy sự có mặt của chúng trong nước biển, chất
lắng cặn ở bề mặt đá san hô [40].
1.4.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của V. alginolyticus
Dựa theo nghiên cứu của Hoa T.T.T , V. alginolitycus có đặc điểm phản ứng
dương tính với lysine, nitrate, lipid, gelatin, oxidase nhưng âm tính với ure, arginine và
không phát sáng. Vi khuaant phát triển tốt trong môi trường peptone 1% có chứa 3, 6, 8,
10% NaCl, nhưng lại không phát triển ở 0% NaCl. Ngoài ra vi khuẩn còn dương tính với
glucose, glycerol, mannitol, sucrose nhưng âm tính với lactose, salicin và H
2
S [38].
10
chẳng hạn như Li
+
, K
+
và Mg
2+
, chỉ thay thế NaCl ở nhiệt độ dưới 28 ° C [75].
Theo Gjerde và Boe cho biết tỷ lệ tăng V. alginolyticus ở trai, cá, nước, và các
mẫu trầm tích từ bờ biển Na Uy trong những tháng hè (tháng Sáu đến tháng Chín) khi
nhiệt độ nước ấm nhất (10 - 16 ° C) . Trong kết quả một báo cáo ở đây, sự xuất hiện của
V. alginolyticus biến động theo mùa, phụ thuộc vào nhiệt độ nước ấm hơn trong mùa khô
(tháng 5-Tháng 9) tại các khu vực nhiệt đới [34].
11
1.4.4 Yếu tố gây độc của V. alginolyticus
Theo nghiên cứu của Josenhans và cs (2002), nhiều vi khuẩn gây bệnh của người,
động vật và thực vật sử dụng roi để di chuyển. Sự xem xét lại các kết luận nghiên cứu gần
đây đã phân tích vai trò của việc di động của các vi khuẩn gây bệnh. Những nghiên cứu
này đã chỉ ra rằng đối với nhiều tác nhân gây bệnh, vận động là điều cần thiết trong một
số giai đoạn của chu kỳ cuộc sống của nó và độc tính đó cùng với sự vận động được điểu
khiển chặt chẽ bởi hệ thống gen [42]. Hörmansdorfer và cs (2000), V. alginolyticus được
tìm thấy trong 5 mẫu từ 20 mẫu thu từ biển và chất lắng cặn ở bề mặt đá san hô. Dựa vào
đặc điểm hóa sinh đã xác định được 45 chủng vi khuẩn trong đó có 13 chủng là
V. alginolyticus. Tất cả các chủng này đều có tính độc tạo ra sản phẩm men phân
giải casein và lipid, 11 chủng phân giải tinh bột và gelatin, 7 chủng thể hiện tác
dụng với lecithin và 2 chủng có men phân giải hồng cầu. Tất cả các chủng thể
hiện tính không độc với mẫu tế bào thực vật ở tảo nước mặn Asteromonas
gracilis. Điều này có thể khẳng định vai trò của vi khuẩn trong việc làm tàn lụi
và tẩy trắng các rạn san hô cũng như tác nhân gây bệnh trên người [40]. Vi khuẩn
V. alginolyticus là một trong những tác nhân chính gây bệnh Vibriosis trên cá
biểu mô ở người và cơ của cá [70].
Wang và cs (2007) đã chứng minh rằng sự tiết ra enzym phân giải protein ngoại
bào và các chất làm tan huyết cũng như sự lấy sắt được theo quy định của LuxO và σ54
của V. alginolyticus [77].
Gần đây, Amel Ben Kahla-Nakbi (2009) nghiên cứu trên 34 chủng vi khuẩn V.
alginolyticus phân lập từ cá tráp biển (Sparus aurata L.) và cá chẽm (Dicentrarchus
labrax L.) nuôi trong trang trại nuôi cá trên bờ biển Địa Trung Hải Tunisia cho thấy sự
hiện diện của một số độc tính như sự sản sinh các sản phẩm ngoại bào (ECP), tăng trưởng
trong điều kiện giới hạn sắt và sự tồn tại trong huyết thanh cá. Ngoài ra ông còn kiểm tra
sự hiện diện của gen độc tương đồng với với các gen độc ở V. cholerae (toxR, toxS, vpi
và ace); toxR đã được tìm thấy trong 16 chủng V. alginolyticus và toxS trong 17 chủng và
vpi trong 12 chủng trong số 34 chủng phân tích . Như vậy, khả năng gây bệnh của V.
alginolyticus có thể là kết quả của một sự kết hợp của tất cả các yếu tố. Một số yếu tố,
chẳng hạn như khả sắt trong huyết thanh cá, mà ảnh hưởng đến sự sống còn, đã được liên
quan đến đóng góp cho căn bệnh do vi khuẩn V. alginolyticus gây bệnh [11]. Độc lực
cũng liên quan đến khả năng của mầm bệnh để sản xuất các sản phẩm ngoại bào [48],
13
[16]. Theo Balebona và cs (1998b), ECPs chủ yếu bao gồm protease, có thể tạo thuận lợi
các vi khuẩn nhiễm vào phần lớn mô tế bào vật chủ, do đó làm giảm sự cung cấp protein
[16].
Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III.
Bảng 2.1: Ký hiệu, nguồn phân lập của đối tượng nghiên cứu
STT
Ký hiệu Nguồn phân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét
1 CH10 Thận cá chẽm bị bệnh thu ngày 28.10.2009 tại bè Vũng Ngán
2 CoVL03
Vết loét cá chẽm bị bệnh thu ngày 28.10.2009 tại bè Vũng Ngán
3 CoS01
Lách cá chẽm bị bệnh thu ngày 17.12.2009 tại bè Vũng Ngán
4 CoK03
Thận cá chẽm bị bệnh thu ngày 17.12.2009 tại bè Vũng Ngán
2.2 Phương pháp nghiên cứu:
2.2.1 Phương pháp thu thập, lưu giữ và phục hồi chủng:
Các chủng vi khuẩn được thu thập ở Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III,
được nuôi cấy tăng sinh trong 10ml môi trường TSB 2%NaCl, nuôi ở nhiệt độ 30
o
C sau
24 giờ bổ sung 20% glycerol tiệt trùng, phân liều vào trong các tube với thể tích 0,5 ml
dịch khuẩn/tube, dán nhãn và lưu ở tủ đông băng -70
o
C. Khi lấy chủng ra nghiên cứu cần
phục hồi chủng bằng cách, lấy mỗi chủng 1 tube, để ra ngoài ở nhiệt độ phòng cho tan
băng, sau khi tan băng, chuyển dịch khuẩn trong mỗi tube sang ống nghiệm chứa 5ml môi
trường TSB 2%NaCl, nuôi ở nhiệt độ 30
o
- Thực hiện dãy các phản ứng sinh hóa bằng test kit API-20E (Analytical Profile
Index) để xác định đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn:
1. Oxidase
2. Catalase
3. ONPG
4. ADH (Arginine)
5. LDC (Lysine)
6. ODC (ornithine)
7. CIT (Citrate)
8. H
2
S
9. URE (Urea)
10. TDA (Tryptophane)
11. IND (Indol)
12. VP
13. GEL (Gelatine)
14. GLU (Glucose)
15. MAN (Malnitole)
16. INO (Inositole)
17. SOR (Sorbitole)
18. RHA (Rhaminose)
19. SAC (Sucrose)
20. MEL (Melibiose )
21.AMY(Amygdalin)
22. ARA (Arabinose)
23. NO
2
(khử nitrate)
trên đĩa thạch, lấy giá trị trung bình của 3 đĩa hợp lồng có cùng độ pha
loãng.
+ Số lượng vi khuẩn tính theo công thức:
X: Số lượng vi khuẩn/ml (cfu/ml)
A: Số khuẩn lạc trung bình ở một độ pha loãng
V: Thể tích mẫu đưa vào nuôi cấy (0.1 ml)
K: Hệ số pha loãng (10)
Thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn được lặp lại 3 lần trong cùng điều kiện. X =
A
V
x K
17
2.2.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định độc lực:
Cá thí nghiệm: cá chẽm mua từ trại sản xuất giống nhân tạo có chiều dài khoảng
10- 12 cm, được nuôi thuần dưỡng trong bể composit trong 2-3 tuần cho đến khi cá quen
với bể nuôi và bắt mồi bình thường. Chọn cá khoẻ mạnh cân đo và phân bố vào hệ thống
bể thí nghiệm.
Điều kiện nuôi:
Mật độ: 10 con/bể composit 200 lít.
Độ mặn: 33-35 ‰.
Nhiệt độ: 27-28
o
C.
Sục khí liên tục, nước biển qua xử lý chảy liên tục.
50 - a
LgLD
50
=
[ LgA + (
b-a
x Lg (bậc pha)) ]
Copyright: Tài liệu đại học ©