BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ SO SÁNH
PROTEIN MÀNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Vibrio
spp. PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM (Lates calcarifer)
Giảng viên hƣớng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc
Sinh viên thực hiện
: Trần Đàn
Mã số sinh viên
: 53130024
Khánh Hòa, tháng 6 năm 2015
i
LỜI CẢM ƠN
Trong 4 năm học tại trƣờng Đại học Nha Trang, tôi đã tiếp thu đƣợc rất nhiều
kiến thức từ sự dạy bảo và giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô và bạn bè. Với tất cả sự chân
thành và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới:
ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt
quá trình làm đề tài tốt nghiệp. Cảm ơn cô đã luôn luôn quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi
điều kiện để em có thể học hỏi đƣợc nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý giá.
điểm sinh hóa tƣơng đồng với các chủng tƣơng ứng là V. mimicus, V. anguillarum, V.
harveyi, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. anguillarum và V. diazotrophicus.
Phân tích protein màng của các chủng thu đƣợc bằng phƣơng pháp điện di SDSPAGE, kết quả cho thấy các protein màng có khối lƣợng phân tử khoảng 140, 80, 78,
40 kDa xuất hiện ở tất cả các chủng. 160, 150, 62, 52, 38, 35 và 31 kDa là những
protein xuất hiện ở đa số các chủng. Đặc biệt, protein màng có khối lƣợng phân tử là
58 kDa chỉ xuất hiện ở chủng NH1 và protein màng 36 kDa chỉ xuất hiện ở chủng
NH3. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có thể làm cơ sở tham khảo cho việc phát triển
một loại vaccine hay làm kháng nguyên để sản xuất kháng thể chống lại nhiều chủng
Vibrio gây bệnh trên thủy sản.
iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. 1
TÓM TẮT........................................................................................................................ii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. v
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................. vi
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................. vi
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
1.1 Tổng quan tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và ở Việt Nam ............................... 3
1.1.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới ...................................................................... 3
1.1.2 Tình hình nuôi cá chẽm ở Việt Nam ...................................................................... 4
1.2 Một số đặc điểm của cá chẽm.................................................................................... 5
1.2.1 Đặc điểm phân loại và hình thái ............................................................................. 5
1.2.2 Đặc điểm phân bố ................................................................................................... 6
1.2.3 Vòng đời ................................................................................................................. 6
1.3 Các bệnh thƣờng gặp trên cá chẽm ........................................................................... 6
2.4.6 Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu ............................................................... 26
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 27
3.1 Xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm ............. 27
3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn .................................................................................... 27
3.1.2 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc .................................. 28
3.2 Kết quả xác định protein màng của các chủng vi khuẩn Vibrio theo phƣơng pháp
điện di SDS - PAGE ...................................................................................................... 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 34
1 Kết luận....................................................................................................................... 34
2 Kiến nghị .................................................................................................................... 34
PHỤ LỤC A
PHỤ LỤC B
v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
APS
Ammonium Persulphate
cfu
Colony Forming Unit
cs
Cộng sự
h
SDS
Sodium Dodecyl Sulphate
TCBS
Thiosulphate Citrate Bile Salt Agar
TEMED
Tetramethylethylenediamine
Tris
Electrophoresis purity reagent Tris (hydrorymethyl) – aminomethane
TSA
Tryptic Soy Agar
TSB
Tryptic Soy Broth
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Tỷ lệ acrylamide trong gel SDS – PAGE và phạm vi phân tách protein ......24
Việt Nam đƣợc thiên nhiên ƣu đãi với nhiều lợi thế trong nuôi trồng các đối
tƣợng thủy sản, đặc biệt là cá biển. Trong số các loài cá biển đang đƣợc nuôi ở nƣớc ta
thì cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch 1790) là một trong những đối tƣợng nuôi có giá
trị dinh dƣỡng và giá trị kinh tế cao. Sản lƣợng và diện tích nuôi cá chẽm đã không
ngừng tăng lên qua từng năm đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nƣớc và xuất khẩu. Tuy
nhiên, đi kèm với sự gia tăng nhanh chóng cả về số lƣợng và diện tích nuôi, đó là sự
suy giảm chất lƣợng môi trƣờng do thiếu sự quản lý, quy hoạch cũng nhƣ ý thức bảo
vệ môi trƣờng của ngƣời nuôi. Những yếu tố này làm cho dịch bệnh xảy ra ngày càng
nhiều và gây ra những thiệt hại ngày càng lớn.
Trong số các bệnh thƣờng gặp ở cá chẽm thì bệnh do các chủng vi khuẩn Vibrio
là nguy hiểm và gây ra nhiều thiệt hại nhất. Chúng là những vi khuẩn Gram âm, hình
que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thƣớc 0,3 - 0,5 µm x 1,4 - 2,6 µm. Chúng không
hình thành bào tử và chuyển động nhờ một hoặc nhiều tiên mao mảnh [1]. Nhóm vi
khuẩn này gây ra thiệt hại rất lớn đến nghề nuôi cá biển trên thế giới cũng nhƣ ở Việt
Nam. Vì vậy, việc nghiên cứu các chủng vi khuẩn Vibrio để điều trị bệnh cho cá chẽm
nói riêng và thủy sản nói chung là điều hết sức cần thiết.
Hiện nay, các biện pháp phòng và trị bệnh chủ yếu trong thủy sản vẫn là sử
dụng thuốc sát trùng, kháng sinh. Nhƣng thuốc sát trùng thƣờng để lại hậu quả nghiêm
trọng cho môi trƣờng. Bên cạnh đó, thuốc kháng sinh cũng có nguy cơ phá vỡ cân
bằng hệ vi sinh môi trƣờng và để lại dƣ lƣợng trong sản phẩm, gây nguy hại cho môi
trƣờng và sức khỏe con ngƣời. Trƣớc thực trạng đó, có rất nhiều phƣơng pháp chữa
bệnh mới đã đƣợc nghiên cứu và phát triển nhƣ việc đƣa vaccine vào phòng bệnh cho
thủy sản. Chính vì thế, những hiểu biết về protein màng ở vi khuẩn sẽ góp phần phát
triển cũng nhƣ đem lại hiệu quả cho các phƣơng pháp chữa bệnh mới.
2
Mục tiêu của đề tài:
Xác định một số đặc điểm sinh hóa và so sánh protein màng của các chủng vi
khuẩn Vibrio phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch 1790).
4
1.1.2 Tình hình nuôi cá chẽm ở Việt Nam
Nuôi trồng thủy sản đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển kinh tế ở
Việt Nam và đã đƣợc FAO đánh giá là một phƣơng tiện xóa đói giảm nghèo hiệu quả.
Năm 2014, với sản lƣợng nuôi trồng đạt 3,393 triệu tấn đã góp phần khẳng định thế
mạnh của nƣớc ta trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản so với các nƣớc trong khu vực và
thế giới. Mục tiêu đầy tham vọng của ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam năm 2015
là sản xuất ra 3,95 triệu tấn sản phẩm đã nhận đƣợc sự hỗ trợ to lớn cả về tài chính
cũng nhƣ kỹ thuật từ Bộ Thủy Sản (Việt Nam) và một số tổ chức quốc tế khác.
Biển Việt Nam có tính đa dạng sinh học khá cao, cũng là nơi phát sinh nhiều
loài cá biển có giá trị kinh tế cao và cá chẽm là một trong số đó. Cá chẽm phân bố dọc
theo bờ biển từ Móng Cái đến Cà Mau trong tất cả các thủy vực từ nƣớc ngọt, nƣớc lợ
đến nƣớc mặn. Vì vậy, diện tích nuôi phù hợp cho cá chẽm ở Việt Nam rất lớn. Hiện
nay, cá chẽm đƣợc nuôi ở nhiều nơi trên khắp cả nƣớc nhƣ Đồng bằng sông Cửu
Long, Khánh Hòa, Phú Yên, Bình Định, Thừa Thiên Huế….
Việc chọn đối tƣợng nuôi có ý nghĩa rất quan trọng trong nghề nuôi cá biển.
Đối tƣợng nuôi phải có giá trị kinh tế cao đáp ứng đƣợc nhu cầu tiêu dùng của thị
trƣờng trong và ngoài nƣớc. Đặc biệt là phải chủ động nguồn giống cả về số lƣợng,
chất lƣợng và tính mùa vụ. Cá chẽm đƣợc đƣa vào nghiên cứu, sản xuất giống nhân
tạo ở các Viện Nghiên Cứu Thủy Sản I, II, Trƣờng Đại học Cần Thơ, Trƣờng Đại học
Nha Trang từ những năm 1994. Năm 2000, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II
đã nghiên cứu thành công và xây dựng quy trình công nghệ sản xuất nhân tạo giống cá
chẽm khép kín từ quy trình thuần dƣỡng và nuôi cá bố mẹ thành thục trong bể xi
măng, kích thích sinh sản, ƣơng nuôi cá bột thành cá giống đã góp phần to lớn phát
triển ngành nuôi cá chẽm ở nƣớc ta [6].
5
1.2 Một số đặc điểm của cá chẽm
Hình 1.2. Hình thái bên ngoài của cá chẽm
Khi cá còn khoẻ, trên mặt lƣng có màu nâu, mặt bên và bụng có màu bạc khi
sống trong môi trƣờng nƣớc biển, màu nâu vàng khi sống trong môi trƣờng nƣớc ngọt.
Khi cá ở giai đoạn trƣởng thành sẽ có màu xanh lục hay vàng nhạt trên lƣng và màu
vàng bạc ở mặt bụng.
6
1.2.2 Đặc điểm phân bố
Cá chẽm là loài phân bố rộng từ vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới thuộc Tây Thái
Bình Dƣơng và Ấn Độ Dƣơng, giữa kinh tuyến 500 Đông đến 1600 Tây, vĩ tuyến 260
Bắc đến 250 vĩ tuyến Nam.
Cá chẽm rất rộng muối và có tính di cƣ xuôi dòng, cá lớn lên chủ yếu ở vùng
nƣớc ngọt nhƣ sông, hồ. Khi thành thục (3 - 4 năm tuổi), chúng sẽ di cƣ ra vùng cửa
sông, ven biển có độ mặn thích hợp từ 30 - 32 ‰ để sinh sản. Ấu trùng sau khi nở ra
sẽ di cƣ vào vùng cửa sông, ven bờ và lớn lên, cá con sẽ dần dần di cƣ vào các thủy
vực nƣớc ngọt sinh sống và phát triển thành cá thể trƣởng thành [6].
1.2.3 Vòng đời
Cá chẽm trải qua phần lớn thời gian sinh trƣởng (2 - 3 năm) trong các thủy vực
nƣớc ngọt nhƣ: sông, hồ nơi nối liền với biển. Cá có tốc độ tăng trƣởng nhanh, thƣờng
đạt cỡ 3 - 5 kg sau 2 - 3 năm. Cá trƣởng thành 3 - 4 tuổi di cƣ từ vùng nƣớc ngọt về
vùng cửa sông và ra biển nơi có độ muối dao động 30 - 32‰ để phát triển tuyến sinh
dục và đẻ trứng sau đó. Cá đẻ trứng theo chu kỳ trăng (thƣờng vào lúc khởi đầu của
tuần trăng hay lúc trăng tròn) vào lúc buổi tối (6 - 8 giờ) và thƣờng cá đẻ đồng thời với
thủy triều lên. Điều này giúp trứng và ấu trùng trôi vào vùng cửa sông. Nơi đó, ấu
trùng sẽ phát triển và di chuyển ngƣợc dòng để lớn. Hiện tại, điều chƣa biết là cá
trƣởng thành có đi ngƣợc dòng không hay chúng giữ giai đoạn còn lại cuối đời sống ở
biển [6].
1.3 Các bệnh thƣờng gặp trên cá chẽm
1.3.1 Bệnh do virus
môi trƣờng hoặc bị tổn thƣơng, Aeromonas sp. sẽ bộc phát gây bệnh xuất huyết trong
với mức tử vong cao. Các yếu tố nhƣ: nhiệt độ, pH, CO2, O2 thay đổi bất lợi, NH3 tự
do trong nƣớc cao…đƣợc coi là những nguyên nhân có thể gây sốc và gây ra sự tấn
công của Aeromonas sp. vào cơ thể cá. Bệnh xuất hiện quanh năm, nếu kèm với
nấm, bệnh sẽ nặng hơn, tỷ lệ chết 30 - 80% [18].
Bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio
Vi khuẩn Vibrio tấn công nhƣ là một trƣờng hợp điển hình của bệnh nhiễm
trùng máu và gây chết. Cá bỏ ăn, bị sẫm màu toàn thân, các đặc trƣng của bệnh bao
gồm: xung huyết các vây, có đốm xuất hiện trên cơ thể, xuất huyết lở loét trên mô da
và cơ, phần mô xung quanh hậu môn ửng đỏ và viêm. Gan, lá lách và thận bị xung
huyết và thƣờng kèm theo sự hoại tử. Ruột, trực tràng có thể bị sƣng lên và có dịch
nhờn trong suốt. Bệnh do vi khuẩn Vibrio ở cá con ít biểu hiện rõ triệu chứng lâm
sàng, toàn thân phủ với một lớp chất nhờn, thỉnh thoảng xuất hiện những vết thƣơng
nhỏ nhƣng chƣa lở loét, các vây đuôi và hậu môn bị sƣng đỏ. Cá con chết nhanh hơn
8
cá lớn. Cá trong bể ƣơng chết do bị nhiễm Vibrio thƣờng xuất hiện những đốm đỏ trên
toàn thân, trƣờng hợp cấp tính cá chết khi chƣa có biểu hiện lâm sàng [18].
Bệnh do nhóm vi khuẩn hình trụ
Bệnh do nhóm vi khuẩn hình trụ Plexibacter columnaris gây ra thƣờng gặp ở cá
chẽm nuôi ở nồng độ muối thấp vào suốt mùa mƣa và cả mùa nắng. Biểu hiện bệnh là
xuất hiện những vết thƣơng dạng nhƣ cái yên ngựa ở giữa cơ thể cá. Vết thƣơng xuất
hiện đối xứng hai bên cơ thể có dạng dĩa màu vàng nhạt và biến màu đen ăn sâu vào
da cá. Đây có thể là bệnh mãn ác tính [1].
Bệnh do nhóm vi khuẩn Streptococcus
Chủ yếu là Streptococcus iniae, S. agalactiae..., có dạng hình cầu gây ra, bệnh
xuất hiện gây tổn thất lớn, tỷ lệ chết 50 - 100% thƣờng xảy ra khi môi trƣờng nuôi
không thuận lợi, ở những tháng có nhiệt độ cao và cũng có thể xảy ra bất cứ tháng nào
trong năm. Cá giống và cá trƣởng thành đều dễ mắc bệnh này, nhất là cá dƣới 5 tháng
Bệnh do ký sinh trùng Henneguya sp.
Tiêm mao trùng hay trùng roi thƣờng ký sinh ở trên mang cá nuôi lồng. Trƣờng
hợp bị nhiễm trùng bệnh nặng có thể ký sinh trên da cá. Dấu hiệu bị nhiễm ký sinh
trùng đặc trƣng là lây lan nhanh; mang và cơ thể cá bị viêm dẫn đến hoại tử. Chu kì
sống của trùng roi trải qua giai đoạn bào nang bơi tự do bằng 2 tiêm mao, khi bám vào
vật chủ, trùng chuyển sang giai đoạn sinh trƣởng có dạng túi và có cơ chế ký sinh phức
tạp, chúng hút dinh dƣỡng từ vật chủ và lớn lên rời ký chủ tìm các giá thể để đẻ trứng
bào sát và tạo bào nang [1].
Bệnh do ký sinh trùng Epistylia sp.
Nguyên sinh động vật Epistylia sp. này tìm thấy trên cá chẽm nuôi ở nƣớc
ngọt. Epistylia sp. thƣờng là ngoại cộng sinh, đôi khi chúng là tác nhân gây bệnh bám
vào cá. Nguyên sinh động vật này có thể sống ở những nhiệt độ khác nhau và khi cá bị
ký sinh nhiều, trên cơ thể sẽ thành từng nhóm bề mặt màu xám [1].
Bệnh do giun ký sinh
Sán đơn chủ Diplectanum latersi thƣờng ký sinh trên mang cá và có thể ký sinh
quanh năm ở cá nuôi trong lồng hay trong ao. Nhiệt độ giữ vai trò quan trọng trong
việc dẫn đến sự bộc phát bệnh do sán lá đơn chủ. Trong các giai đoạn sinh trƣởng của
cá thì giai đoạn cá con có tính mẫn cảm cao nhất với bệnh sán lá đơn chủ.
Sán lá song chủ ký sinh trong ruột cá chẽm thƣờng là Pseudometadena
celebesensis.
Giun tròn có nhiều loài đƣợc phát hiện ở cá chẽm lớn, nhỏ và ấu trùng cá bột,
cá con nhƣng chỉ có 1 vài loài đƣợc xem là mầm bệnh gây nguy hiểm cho cá. Giun
tròn Cucullanus thƣờng thấy trong ruột cá lớn hơn là ruột cá nhỏ.
10
Giun đầu móc mặc dù có vòi với những hàng móc bám đáng sợ nhƣng không
đƣợc xem là gây bệnh nguy hiểm cho cá. Phần lớn giun đầu móc ở cá chẽm thƣờng
thấy ở ruột những con cá trƣởng thành [18].
Các loài giáp xác ký sinh
trƣng của loài Vibrio là khả năng phát triển trong điều kiện pH rất cao (8,5 - 9,5) và bị
tiêu diệt nhanh ở môi trƣờng acid [1], [10].
Về cơ bản, các loài vi khuẩn này đều có mặt trong môi trƣờng nƣớc, đặc biệt là
nƣớc biển và cửa sông, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và
nhiều loài là nhu cầu cần thiết tuyệt đối.
1.4.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển
Bệnh Vibriosis trên cá biển xảy ra ở khắp nơi trên thế giới ở cả môi trƣờng
nƣớc mặn và các vùng gần cửa sông. Một khi đã bùng phát dịch Vibriosis thì tỷ lệ tử
vong là rất cao và có thể lên đến trên 50 % đối với cá nuôi.
Vibrio anguillarum là loài vi khuẩn đầu tiên thuộc giống Vibrio đƣợc phát hiện
gây bệnh trên cá và nó đã đƣợc phân lập từ cá chình nuôi ở Địa Trung Hải bởi
Canestrini vào năm 1883. Và những năm sau đó, ngƣời ta cho rằng các tác nhân gây
bệnh Vibriosis chính là loài vi khuẩn này. Cho đến nay, có rất nhiều loài Vibrio đã
đƣợc báo cáo là nguyên nhân gây bệnh trên cá biển bao gồm: V. parahaemolyticus, V.
vulnificus, V. alginolyticus, V. carchariae, V. damsela, V. harveyi….
Nghiên cứu của Austin B. và cs (2006) đã xác định V. harveyi là một tác nhân
gây bệnh nghiêm trọng trên cá biển và động vật không xƣơng sống. Đối với cá biển, V.
harveyi gây ra các bệnh: viêm mạch, viêm dạ dày - ruột và tổn thƣơng mắt [7].
Một nghiên cứu khác của Sadok Khouadja và cs (2013) cho thấy độc lực của các
chủng V. parahaemolyticus phân lập từ cá chẽm bệnh ở các trang trại ở Tunisia là rất nguy
hiểm với liều gây chết 50% (LD50) dao động từ 3,52 x 104 và 2,29 x 106 cfu/g cá [17].
Các dấu hiệu bệnh Vibriosis ở cá cũng tƣơng tự nhƣ những bệnh khác do vi
khuẩn gây ra. Bệnh thƣờng bắt đầu với các dấu hiệu là cá bơi lờ đờ, bỏ ăn, xung huyết
các vây, có đốm xuất hiện trên cơ thể. Đặc biệt xuất huyết lở loét trên mô da và cơ,
phần mô xung quanh hậu môn ửng đỏ và viêm. Gan, lá lách và thận bị xung huyết và
thƣờng kèm theo sự hoại tử. Ruột, trực tràng có thể bị sƣng lên và có dịch nhờn trong suốt.
Sự quan tâm ngày càng nhiều đối với nghề nuôi cá trên thế giới đã giúp cho vấn đề
dịch bệnh đƣợc hiểu một cách rõ ràng hơn đối với mỗi vùng nuôi, từng hệ thống nuôi và vai
trò của mỗi loài vi khuẩn trong sự bùng nổ của dịch bệnh. Tuy nhiên, qua quá trình tồn tại và
phát triển, các loài vi khuẩn gây bệnh đã có sự biến đổi cấu trúc gen khác so với ban đầu, việc
Vi khuẩn Vibrio phân chia cơ thể rất nhanh ở độ mặn 10 - 40 ppt, lây lan nhanh ở nhiệt
độ cao (mùa nóng). Phát triển nhanh ở nơi có nhiều chất hữu cơ, oxy thấp và pH 7 - 9.
Trong bể ƣơng lƣợng vi khuẩn Vibrio tăng theo thời gian nuôi, tầng đáy cao hơn tầng
mặt. Mật độ vi khuẩn tăng nhanh rõ rệt khi thời tiết thay đổi, vào các thời điểm biển
động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới hoặc theo con nƣớc thủy triều [1].
13
Tác hại của bệnh
Bệnh do Vibrio gây ra có thể xảy ra ở dạng cấp tính hoặc mãn tính. Trong
trƣờng hợp cấp tính, tỉ lệ chết có thể là 100% .
1.4.3 Biện pháp phòng trị bệnh trên cá chẽm do vi khuẩn gây ra
Để hạn chế rủi ro và đạt hiệu quả cao trong nuôi trồng thủy sản thì phòng bệnh
là việc làm hết sức cần thiết. Do động vật thủy sản sống trong nƣớc nên vấn đề phòng
và trị bệnh không giống nhƣ gia súc, gia cầm trên cạn. Các biện pháp trị bệnh không
mang lại hiệu quả cao do phụ thuộc vào quá nhiều yếu tố. Vì vậy, trong nuôi trồng
thủy sản vấn đề phòng bệnh đƣợc đặt lên hàng đầu và nguyên tắc là “phòng bệnh là
chính, chữa bệnh khi cần thiết” [1].
Ngăn chặn sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh:
Xử lý nguồn nƣớc trƣớc khi đƣa vào ao nuôi
Sử dụng đàn bố mẹ và đàn giống không mang mầm bệnh
Sử dụng thức ăn không mang mầm bệnh
bệnh sẽ phát triển và gây bệnh cho vật nuôi. Hiện nay biện pháp chủ yếu dùng để tiêu
diệt vi khuẩn trong ao nuôi là sử dụng thuốc kháng sinh. Một số loại kháng sinh đƣợc
dùng để tiêu diệt vi khuẩn nhƣ Enrofloxacin, Oxytetracyline, Sulfamethazine.
1.5 Tổng quan về tình hình nghiên cứu protein màng ngoài của vi khuẩn Vibrio
Phần lớn các nghiên cứu về protein màng ngoài của vi khuẩn Vibrio là nhằm
mục đích phát triển vaccine chống lại chính các chủng vi khuẩn này để phòng ngừa
dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản.
14
Theo kết quả phân tích thành phần protein màng của các chủng Vibrio
alginolyticus phân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét tại các bè nuôi thƣơng phẩm ở Khánh
Hòa [4] cho thấy thành phần protein của 4 chủng V. alginolyticus là tƣơng tự nhau với
các band protein có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 106; 92; 75; 73; 68; 62; 55; 45; 38;
36; 32; 30; 27,5; 16,4 và 15,5 kDa.
Một kết quả nghiên cứu khác của Koga T. và Kawata T. (1983) khi phân tích
protein màng ngoài tách chiết từ Vibrio parahaemolyticus nuôi cấy trong môi trƣờng
dinh dƣỡng bổ sung 3% NaCl cho thấy có 5 protein với trọng lƣợng phân tử gần đúng
lần lƣợt là 44; 36; 33,5; 26,5 và 22 kDa [11].
Nghiên cứu của Ningqiu L. và cs (2008) đã đƣa ra kết luận là các protein màng
ngoài của Vibrio harveyi, cụ thể là OmpK có một vai trò quan trọng trong sự tƣơng tác
giữa vi khuẩn và ký chủ và là một “ứng cử viên” tiềm năng để phát triển vaccine
chống lại V. harveyi [14].
Zanal Abiddin và cs (2010) đã nghiên cứu phân tử và đặc tính kháng nguyên của
hai loài Vibrio (V. fluvialis và V. mimicus) phân lập từ cá chẽm châu Á. Kết quả của
nghiên cứu cho thấy đối với V. fluvialis, các kháng nguyên protein màng ngoài quan
trọng nhất của tế bào có trọng lƣợng phân tử 50, 60 và 75 kDa. Trong khi đó, đối với
V. mimicus là 40 và 80 kDa. Những protein kháng nguyên này có thể gây đáp ứng
miễn dịch tốt trong sản xuất vaccine chống lại bệnh nhiễm trùng Vibrio [27].
VhhP2 là một protein màng ngoài của V. harveyi đƣợc phân lập từ cá bệnh. Khi
độc tố thần kinh mạnh, khi hít phải sẽ làm mê mệt. Nó có khả năng thấm qua da khi
tiếp xúc trực tiếp. Hiệu quả độc tố sẽ tích tụ dần. Vì vậy khi thực hiện làm thí nghiệm
với acrylamide nên đeo khẩu trang và găng tay. Tuy nhiên ở dạng đã đƣợc polymer
hóa thành polyacrylamide thì lại không độc.
Gel polyacrylamide là gel đƣợc tạo thành do sự polymer hóa các đơn phân tử
acrylamide và N,N’- methylene-bis-acrylamide. Kích thƣớc lỗ gel phụ thuộc vào chiều
dài của chuỗi polymer và mức độ polymer hóa. Gel polyacrylamide đƣợc mô tả qua 2
đặc điểm: %C và %T.
Tổng lƣợng đơn phân tử acrylamide chứa trong gel (% T)
%T=
ổ
ể í
Lƣợng bis-acrylamide chứa trong gel (% C)
% C=
16
Quá trình polymer hóa đƣợc xúc tác bởi Ammoniumpersulfate (APS),
N,N,N’,N’- tetramethylethylenediamine (TEMED). Sử dụng gel polyacrylamide chạy
điện di thì việc chuẩn bị phức tạp hơn so với chạy điện di trên gel agarose.
Sự di chuyển của các phân tử sinh học trên gel phụ thuộc vào kích thƣớc của lỗ
gel, điện tích của phân tử cần phân tách và điện trƣờng. Giới hạn trọng lƣợng phân tử
của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và
bis-acrylamide: Nếu nồng độ gel thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân
tử sinh học có kích thƣớc lớn và ngƣợc lại nếu nồng độ gel cao sẽ tạo ra lỗ gel nhỏ,
cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thƣớc nhỏ [4].
trong hỗn hợp dung dịch: 0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v), 40% methanol
(v/v), 10% acid acetic (v/v) khoảng một giờ. Ngoài ra chúng cũng có thể đƣợc nhuộm
với 0,025% Coomassie Brilliant Blue G-250 (w/v) trong methanol và acid acetic từ 12 giờ [8].
1.6.5 Một số yếu tố cần quan tâm trong điện di trên gel polyacrylamide
Hệ đệm điện di và các tác nhân gây biến tính protein
Hệ đệm quyết định nhu cầu về năng lƣợng và ảnh hƣởng đến sự phân tách
protein. Hệ đệm bao gồm đệm dùng để pha gel và đệm dùng để chạy điện di. Hệ đệm
của gel không liên tục đầu tiên đƣợc phát triển bởi Ornstein (1964) và Davis (1964) và
đã đƣợc ứng dụng để phân tách protein nguyên thể, tức là những protein chƣa bị biến
tính. Hệ đệm mà các nhà khoa học sử dụng gồm 4 yếu tố: gel gom dùng đệm Tris HCl pH 6,8; gel phân tác dùng đệm Tris - HCl pH 8,8; đệm điện di Tris - glycine pH
8,3; mẫu cần phân tách dùng đệm Tris - HCl pH 6,8. Nhƣng với hệ đệm đƣợc sử dụng
nhƣ vậy thì trong mô hình này, không thể tiến hành phân tách đƣợc một khoảng rộng
về trọng lƣợng protein.
Dựa trên mô hình và hệ đệm của Ornstein và Davis, Laemmli đã phát triển trong
việc sử dụng thêm tác nhân khử cầu nối disulfite và SDS. Nhờ đó, việc phân tách
protein trên gel chỉ phụ thuộc vào trọng lƣợng phân tử của protein. Do đó, việc phân
tách protein trở nên dễ thực hiện hơn và không bị phụ thuộc vào điện tích của các phân
Copyright: Tài liệu đại học ©