TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

ĐOÀN QUỐC TỈNH

XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG
KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN
PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM (Lates calcarifer)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

ĐOÀN QUỐC TỈNH

XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG
KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN
PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM (Lates calcarifer)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGs.Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

2012

11 chủng tan huyết dạng β, 4 chủng tan huyết dạng α và 1 chủng không tan
huyết. Kết quả định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20 Strep cho thấy vi khuẩn
được phân lập từ cá chẽm là Streptococcus iniae và Streptococcus agalactiae.
Lập kháng sinh đồ với 12 loại kháng sinh cho thấy vi khuẩn nhạy cao nhất với
kháng sinh: Ampicilin, Amoxcillin, Cefazolin, trong khi đó 87,5% (14/16)
chủng vi khuẩn kháng với Gentamycin và Neomycin. Bên cạnh đó kết quả mô
học cũng cho thấy có sự xâm nhập của vi khuẩn ở mô thận. Kết quả nghiên
cứu của đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu về chuẩn đoán và phòng trị bệnh ở
cá chẽm.

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ................................................................................................. i
TÓM TẮT...................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG .....................................................................................v
DANH SÁCH HÌNH..................................................................................... vi
CHƯƠNG I GIỚI THIỆU .............................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề............................................................................................. 1
1.1.1 Mục tiêu đề tài................................................................................ 2
1.1.2 Nội dung nghiên cứu ...................................................................... 2
CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................... 3
2.1 Đặc điểm sinh học của cá chẽm ............................................................ 3
2.1.1 Đặc điểm phân loại cá chẽm ........................................................... 3
2.1.2 Đặc điểm hình thái ......................................................................... 3
2.1.3 Đặc điểm phân bố và dinh dưỡng ................................................... 4
2.1.4 Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm ............................................. 4
2.2 Tình hình dịch bệnh trên cá chẽm ......................................................... 5
2.2.1 Bệnh do virus ................................................................................. 5

Phụ lục III..................................................................................................37

iv


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1 Đường kính vòng vô trùng theo tiêu chuẩn CLSI 2011.................. 17
Bảng 3.2 Qui trình xử lý mẫu trong máy tự động.......................................... 18
Bảng 3.3 Quy trình nhuộm mô. .................................................................... 19
Bảng 4.1 Kết quả NaCl 6,5% và Tan huyết. ................................................. 22

v


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Cá Chẽm (Lates calcarifer)............................................................ 3
Hình 4.1 Kết quả nhuộm gram...................................................................... 20
Hình 4.2 Kết quả test O/F............................................................................. 20
Hình 4.3 Kết quả test API 20 Strep sau 4 giờ................................................ 21
Hình 4.4 kết quae test API 20 Strep sau 24 giờ............................................. 21
Hình 4.4 Kết quả NaCl................................................................................. 23
Hình 4.5 Đĩa tan huyết dạng β ...................................................................... 23
Hình 4.6 Đĩa tan huyết dạng α ...................................................................... 23
Hình 4.7 Đĩa kháng sinh đồ .......................................................................... 24
Hình 4.8 Vi khuẩn xâm nhập trong mô thận cá chẽm.................................... 27

vi


CHƯƠNG I

vậy khi cá mắc bệnh thì người nuôi lung túng trong viêc xử lý bệnh. Để góp
phần bổ sung kết quả nghiên cứu về bệnh của cá chẽm cũng như phổ biến
thiêm kiến thức cho người nuôi thì đề tài “Xác định đặc điểm sinh hóa và
khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ cá chẽm
(Lates calcarifer)” được thực hiện.

1


1.1.1 Mục tiêu đề tài
Xác định đặc điểm sinh hóa và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi
khuẩn phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer)
1.1.2 Nội dung nghiên cứu
 Xác định các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập từ cá chẽm
(Lates calcarifer).
 Định danh vi khuẩn phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) bằng bộ kít
API 20 Strep.
 Lập kháng sinh đồ xác định khả năng kháng thuốc của vi khuẩn phân
lập từ cá chẽm (Lates calcarifer).
 Tìm hiểu về đặc điểm mô bệnh học của cá chẽm (Lates calcarifer) bị
nhiễm bệnh.

2


CHƯƠNG II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Đặc điểm sinh học của cá chẽm
2.1.1 Đặc điểm phân loại cá chẽm
Cá chẽm còn gọi là cá Vược có hệ thống phân loại như sau:

Miệng rộng và hơi so le, hàm trên kéo dài đến phía dưới sau hốc mắt. Răng
dạng nhung, không có răng nanh, trên nắp mang có gai cứng, vây lưng gồm có
2 vi: vi trước có 7-9 gai cứng và vi sau có 10-11 tia mềm. Vi hậu môn có 3 gai
cứng, vi đuôi tròn và có hình quạt. Vẩy dạng lược và có kích cỡ vừa phải, có
61 vẩy đường bên.
Màu sắc cá thay đổi theo vùng nước, trên mặt lưng có màu nâu, mặt bên
và bụng có màu bạc khi sống trong môi trường nước biển, màu nâu vàng khi

3


sống trong môi trường nước ngọt. Khi cá ở giai đoạn trưởng thành sẽ có màu
xanh lục hay vàng nhạt trên lưng và màu vàng bạc ở mặt bụng.
2.1.3 Đặc điểm phân bố và dinh dưỡng
Phân bố theo địa lý: cá chẽm phân bố rộng ở các vùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới thuộc Tây Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương, ngoài ra chúng còn
phân bố ở khắp phần Bắc Châu Á, phía Nam kéo dài đến Queensland (Úc),
phía Tây Châu Phi.
Phân bố theo vùng sinh thái: Cá chẽm là loài rộng muối có thể sống
được ở các vùng nước ngọt, lợ, mặn và có tính di cư xuôi dòng. Cá thành
thục sinh dục thường tìm thấy ở các vùng cửa sông, hồ, hay các vùng nước lợ
có độ mặn cao và ổn định 30 –32 ‰, độ sâu 10 – 15 m. Ấu trùng mới nở (10
– 15 ngày tuổi, chiều dài dưới 1cm) thường phân bố ở các vùng biển ven bờ
gần các cửa sông nước lợ. Cá bột cỡ trên 1cm có thể gặp trong các thuỷ vực
nước ngọt (Lê Vũ Liệt, 2008).
Đặc điểm dinh dưỡng: Cá chẽm là loài cá dữ ăn thịt, tuy nhiên ở giai
đoạn cá giống lại là loài ăn tạp. Khi phân tích dạ dày cá thu ngoài tự nhiên (cỡ
1 – 10 cm) thấy 20% là phiêu sinh vật, chủ yếu là nhóm tảo khuê và thực vật
phù du, phần còn lại là tôm cá nhỏ. Khi cá lớn hơn 20cm, 100% thức ăn là
động vật bao gồm 70% giáp xác và 30% cá nhỏ (Kungvankij,1971).

thử nghiệm thành công, CTCP Vĩnh Hoàn đã tiến hành thả đợt giống đầu tiên
của Dự án nuôi cá Chẽm tại vùng nuôi ở tỉnh Bến Tre với diện tích là 170 ha
sẽ mở rộngdiện tích lên 300 héc ta vào năm 2012. Dự kiến, sản lượng cá
Chẽm của Vĩnh Hoàn trong năm 2011 là 700 tấn và 6.100 tấn vào năm 2013.
2.2 Tình hình dịch bệnh trên cá chẽm
2.2.1 Bệnh do virus
Bệnh hoại tử thần kinh lần đầu tiên được mô tả ở cá chẽm Dicentrarchus
iabrax bởi Bllance và Gallede (1988) và cá chẽm (Lates calcarifer Bloch,
1790) ở Úc (Glazebook et al.,1990). Cá chẽm 15–21 ngày tuổi nhiễm virus
Nordavirus đã gây chết từ 60–90% trong suốt quá trình nuôi (Vương Thị
Thoa, 2009).
2.2.2 Bệnh do ký sinh trùng
Leong và Wong (1990), kiểm tra 642 con cá chẽm giống (501 từ Thái
Lan, 141 từ Malaysia) có 10 loài KST được phát hiện, bao gồm 2 loài
Protozoa, 2 loài Monogenea, 4 loài Trematoda, 1 loài Cestoidea, 1 loài
Nematoda, 1 loài Isopoda. Khi kiểm tra 102 con cá giống bệnh từ Thái Lan,
kết quả tìm thấy 13 loài KST, gồm có 2 loài Protozoa, 2 loài Monogenea, 4
loài Trematoda, 1 loài Cestoidea, 2 loài Nematoda, 2 loài Isopoda. Số loài ký
sinh trùng phát hiện trên cả cá bệnh và cá khỏe là 16 loài, trong đó ở Thái
Lan cá đều bị cảm nhiễm nặng bởi Trichodina sp, Cryptocaryon irritans,
Pseudorhabdosynochus latesi và Diplectanum sp (Vũ Thị Ngọc, 2008).
Năm 1994, Leong và Wong thông báo gặp ít nhất 4 loài thuộc sán lá đơn
chủ (Monogenea) kí sinh trên mang cá chẽm. Bao gồm:
Pseudodorhabdosynochus latesi, P. monosquamodiscus và 2 loài khác thuộc
giống Diplectanum (Vũ Thị Ngọc, 2008).

5


Theo Đỗ Thị Hòa (2001) thì tại trại thực nghiệm hải sản trường đại học

38%. Cũng vậy, trong nghiên cứu của mình về các tác nhân gây bệnh là vi
khuẩn có liên quan đến cá chẽm, Loganathan & ctv cho rằng Vibrio là tác
nhân chính gây nên bệnh lở loét trên da cá (Vương Thị Thoa, 2009).
Theo Ruangpan (2003), cá bệnh xuất hiện dấu hiệu đặc trưng là lở loét,
xuất huyết trên da và mô cơ, xung quanh hậu môn xuất hiện các vết viêm tấy

6


và đỏ. Ngoài ra còn có sự xuất huyết trên gan, lách, thận kèm theo có cả sự
hoại tử. Ruột đặc biệt là trực tràng có thể bị sưng to và chứa đầy dịch. Cũng đã
phân lập được V. alginolyticus, V. parahemolyticus, V. anguillarum từ cá bệnh
(Huỳnh Thanh Thiện, 2010).
Nghiên cứu của Renaul et al. (2009) thì sự xuất hiện bệnh do Vibriosis
gây ra trên cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi lồng ở Malaysia gây tỷ lệ chết cao,
thường mắc bệnh ở giai đoạn cá nhỏ biểu hiện là bỏ ăn, cơ thể sậm màu, xuất
huyết quanh hậu môn và các gốc vây, sau đó chết hàng loạt. Từ các mẫu bệnh
phẩm tác giả đã phân lập được 21 chủng vi khuẩn từ các cơ quan như: gan,
thận, tim, tỳ tạng, dựa vào các đặc điểm sinh hóa và hình thái đã xác định
được sự có mặt của vi khuẩn V. alginolyticus (Nguyễn Thị Thoa, 2011)
Theo nghiên cứu của Ransangan et al. (2009) thấy sự xuất hiện bệnh do
Vibriosis gây ra cá chẽm (Lates calcarifer ) nuôi lồng ở Malaysia gây tỷ lệ
chết cao, tác động rất lớn đến sản lượng cá nuôi ở nước này. Thông thường cá
ở giai đoạn nhỏ biểu hiện bỏ ăn, cơ thể sậm màu, sau đó chết hàng loạt. Ở giai
đoạn trưởng thành, cá có biểu hiện xuất huyết quanh hậu môn và các gốc vây.
Từ các mẫu bệnh nghiên cứu đã phân lập được 21 chủng vi khuẩn từ các cơ
quan bên trong như thận, tim, tỳ tạng và gan. Dựa vào đặc điểm hình thái và
hóa sinh đã xác định sự có mặt của V. alginolyticus (Nguyễn Thị Thoa, 2011)
Nguyễn Thị Thoa (2011) khi phân lập vi khuẩn gây bệnh lở loét trên cá
chẽm đã thu được 4 chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus. Sau khi tiêm vi

nghiêm trọng khi nhiệt độ nước nuôi cao (trên 150C). Ngoài ảnh hưởng bởi
nhiệt độ nước, bệnh này ảnh hưởng bởi điều kiện gây sốc của môi trường
(stress) và yếu tố liên quan đến vật chủ (tổn thương bề mặt da). Nhìn chung, cá
bị bệnh biểu hiện miệng bị xuất huyết và mòn cụt, lở loét ở da, vây bị xơ và
thối đuôi (Nguyễn Thị Thoa, 2011)
Nghiên cứu của Đỗ Thị Hòa và ctv. (2004), ở Việt Nam, trong nghề nuôi
cá lồng trên biển, bệnh Flexibacter đã xảy ra ở một số loài cá biển có giá trị
kinh tế như cá mú, cá chẽm, vào mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc, vào mùa
mưa ở miền Nam.
Đỗ Thị Hòa và ctv. (2007), cũng xác định một loài vi khuẩn dạng sợi có
đặc điểm sinh hóa tương tự như Flexibaterium maritimus đã được xác định là
tác nhân gây bệnh ở cá chẽm, cá mú bị bệnh thối đuôi, mòn vây cũng như một
số loài cá biển nuôi ở Khánh Hòa. Bệnh thường gặp ở cá nuôi lồng hơn là ao
nuôi, tính chất mùa vụ không rõ ràng. Sự xảy ra của bệnh liên quan đến nhiều
yếu tố gây sốc như mật độ nuôi quá cao, biến động môi trường, sau những trận
mưa to.
Ngoài ra, ở cá chẽm nuôi tại Australia, người ta còn phân lập được một
loại trực khuẩn gram(-), sợi mảnh, trơn trượt, được xác định là Cytophaga
johnsonae. Cá bị nhiễm nhiều nhưng chỉ bị mòn trên bề mặt da, chủ yếu lầ
phần sau lưng, các con cá bị nặng ở cả vây ngực và miệng dưới. Loganathan
và ctv. (1989), nghiên cứu thành phần các loài vi khuẩn hiện diện trên cá chẽm
lở loét đã tìm thấy vi khuẩn dạng sợi thuộc giống Flavobaterium – Cytophaga
(Vương Thị Thoa, 2009).
Theo kết quả nghiên cứu của Vương Thị Thoa (2009) cho biết bệnh mòn
cụt, thối đuôi, lở loét do vi khuẩn là bệnh rất thường gặp ở cá chẽm và gây tỷ
lệ tử vong rất cao, gây thiệt hại không nhỏ cho người nuôi. Bệnh xảy ra ở giai

8



động vật thủy sản là:, S. iniae và S. parauberis, S. agalactiae.
Các nhà khoa học phát hiện bệnh Streptococcus xảy ra đầu tiên ở châu Á
vào năm 1957 ở cá hồi vân tại Nhật Bản (Hoshina et al., 1958) và bắt gặp lần
đầu ở châu Âu vào năm 1993. Hiện nay, bệnh cũng đã thấy xuất hiện ở nhiều
quốc gia trên thế giới như: Nhật, Israel, Mỹ, Indonesia, Malaysia, Thái Lan….
Bệnh Streptococcus cũng đã gây ra các vấn đề nghiêm trọng cho thủy sản ở
Nam Phi và Nhật Bản. Ngoài ra cũng đã phát hiện Streptococcus sp trong

9


nước và trong dạ dày- ruột ở một số ít cá cảnh nhập khẩu ở Bắc Mỹ từ các
quốc gia ở khu vực Đông Nam Á (Trust và Bartlett 1974, Shotts et al., 1975).
Những loài cá khác nhau khi bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus đều xuất
hiện một số dấu hiệu chung, bao gồm: màu sắc đen tối, bơi lội không bình
thường, mắt cá lồi và đục, xuất huyết ở các vây và xương nắp mang. Các vết
xuất huyết lan rộng thành lở loét, nhưng các vết loét thường nông hơn các
bệnh có lở loét khác. Cá bị bệnh vận động khó khăn, không định hướng, cá
bệnh có hình thức bơi xoắn, thận và tỳ tạng tăng lên về thể tích do phù nề. Sự
tổn thương nội quan là lý do gây chết. Tuy vậy, bệnh cũng có thể xảy ra ở thể
nhẹ (mãn tính), chỉ có một vài nốt xuất huyết trên thân mà không có hiện
tượng tổn thương nội tạng. Nhưng nếu bệnh ở dạng cấp tính, tỷ lệ gây chết cao
. Từ các mẫu cá nhiễm bệnh, người ta đã phân lập được ba nhóm Streptococci:
có khả năng gây tan huyết dạng alpha, beta va gamma (Đỗ Thị Hòa và ctv.,
2004).
Vào năm 1985, đã có báo cáo về bệnh xảy ra ở đối tượng cá chẽm tại
Singapore (Foo et al., 1985) và tại Trung Quốc vào năm 1990. Chủng vi
khuẩn gây bệnh được xác định là Streptococcus iniae, với tỉ lệ tử vong 16,7%32,6% (Huang et al., 1990) . Ngoài ra còn có các báo cáo về bệnh xảy ra trên
cá chẽm ở Port Hurt, Bathhurst (2005) với những dấu hiệu đặc trưng như đã
nêu trên ( trích dẫn bởi Nguyễn Xuân Nguyên, 2011).

bàng que trãi thủy tinh độ đục của vi khuẩn được so sánh với ống chuẩn 0,5
McFarland và cho 0,1 ml dung dịch vi khuẩn trãi trên môi trường thạch. Đặng
Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương (2002) đã sử dụng phương pháp
tráng dung dịch vi khuẩn lên môi trường MHA và NA để xác định loại kháng
sinh mẫn cảm với vi khuẩn gây bệnh. Trong thí nghiệm 2 tác giả đã cho khuẩn
lạc vi khuẩn vào 5ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng, cho lên môi trường thạch
khoảng 2/3 dung dịch vi khuẩn trong ống nghiệm, sau đó dùng pipet hút bỏ
dung dịch dư thừa.
Năn 2007, Tiết Ngọc Trân và Huỳnh Chí Thanh đều chọn cách so sánh
đọ đục của dung dịch vi khuẩn với ống McFarland số 3 và đều cho 0,2 ml
dung dịch vi khuẩn với cách trãi dung dịch vi khuẩn lên đĩa môi trường MHA.
Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008) đã so sánh phương pháp lập kháng sinh
đồ dùng tâm bông để quét, trải vi khuẩn bằng que trải thủy tinh, tráng vi khuẩn
bằng pipet so sánh độ đục của vi khuẩn bằng 2 phương pháp đo bằng máy
quang phổ và ống McFarland số 3 trên 2 môi trường là MHA và NA kết quả
cho thấy cách trãi vi khuẩn ít dao động hơn cách quét và tráng, kích thước
vòng vô trùng trên môi trường MHA nhỏ hơn hoặc bằng so với đường kính vô
trùng trên môi trường NA, phương pháp so mật số vi khuẩn bằng máy quang
phổ cho đường kính vô trùng ít dao động hơn so với phương pháp dựa theo
ống McFarland số 3.
2.4 Một số nghiên cứu về vi khuẩn kháng thuốc trong nuôi trồng thủy sản
ở Việt Nam
Với nỗ lực tăng nhanh sản lượng thuỷ sản và kim ngạch xuất khẩu, các
nước đang phát triển nói chung hay Việt Nam nói riêng đều đang rất chú trọng
tới nuôi trồng thuỷ sản. Ðể đạt được sản lượng và lợi nhuận cao nhất, nhiều
ngư dân hiện đang áp dụng các phương thức nuôi thâm canh. Nhưng các vật
nuôi lại bị ảnh hưởng nhiều hơn bởi những áp lực và bệnh tật dẫn đến những

11


Bên cạnh đó, từ kết quả kháng sinh đồ của Trương Thị Mỹ Duyên (2009)
đã có 3/8 chủng vi khuẩn A. hydrophila (37,5%) kháng với oxolinic acid.
Theo nghiên cứu của Phạm Thị Ngọc Xuân (2009) kết quả kháng sinh đồ
cho thấy 100% các chủng vi khuẩn E. ictaluri kháng hoàn toàn với oxolinic
acid.
Năm 2009, kết quả nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh cho biết E.
ictaluri phân lập ở cá tra bệnh gan thận mủ từ các nghiên cứu tại Khoa Thủy Sản,
Đại Học Cần Thơ, kháng với Oxytetracylin (84,4%), Oxolinic acid (34,6%),
12


Sulphonamid (100%), Flofenicol (12,1%), Flumequin (7,8%) (www.uvvietnam.com.vn)

13


CHƯƠNG III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện tại Bộ
môn Sinh Học và Bệnh Học Thủy Sản – Khoa Thủy Sản – Trường Đại Học
Cần Thơ.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 01 năm 2012 đến tháng 04 năm 2012.
3.1 Vật liệu nghiên cứu
-

Thiết bị: Nồi hấp tiệt trùng, tủ sấy, tủ lạnh, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, máy
Vortex, kính hiển vi, máy lắc, máy so màu UV-Vis, Kính hiển vi, cân điện
tử, micropipet 1-5ml, 100-1000μl và 10-100μl…

-


Các chủng vi khuẩn nghiên cứu: 1 não 2a, 1 não 4, 1 thận 5, 2 thận 1, 2 não
1, 2 thận 2, 2 não 2a, 2 não 2b, 2 não 3, 2 thận 4, 2 não 4, 2 thận 5, 2 não 5,
2 thận 6, 2 não 6, 2 não 7.

3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phục hồi vi khuẩn
Vi khuẩn được lấy từ trong -80 0C, rã đông, sau đó dùng que cấy tiệt
trùng lấy vi khuẩn cấy lên môi trường BHIA + 1,5% NaCl để ở 36 0C sau 2414


48 giờ quan sát hình thái, màu sắc khẩn lạc. Nếu khuẩn lạc đã rời rạc và đồng
nhất thì tiến hành nhuộm gram để kiểm tra độ thuần, nếu chưa thuần thì tiếp
tục tách ròng.
3.2.2 Kiểm tra một số chỉ tiêu sinh hóa
Phản ứng oxidae: Dùng que cấy phết một ít vi khuẩn lên giấy lọc đã tẩm
dung dịch oxidase. Vi khuẩn cho phản ứng oxidase (+) sẽ làm giấy lọc chuyển
sang màu xanh trong 10 giây và ngược lại là âm tính (-).
Phản ứng catalase: Nhỏ 1 giọt dung dịch 3% H2O2 (3ml H2O2 trong
100ml nước cất). Dùng que cấy lấy 1 ít vi khuẩn cho lên giọt H2O2 có sẵn trên
lame. Vi khuẩn cho phản ứng catalase (+) sẽ gây hiện tượng sủi bọt trong dung
dịch 3% H2O2 và ngược lại âm tính (-).
Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O/F): Đun và khuấy cho
tan hoàn toàn môi trường O/F.Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội
450C. Thêm 1% glucose tiệt trùng. Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm. Cấy
vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường O/F. Sau đó phủ 0,5 – 1ml dầu
paraffin tiệt trùng vào ống nghiệm để tạo môi trường yếm khí trong ống
nghiệm. Để trong tủ ấm 280C theo dõi kết quả 1- 7 ngày.
Khả năng sinh H2S: Đun cho tan hoàn toàn môi trường TSI
(60g/1000ml). Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội 450C. Cho 3ml môi

-

Rửa bằng nước cho hết màu tím trên lame ( khoảng 2 giây), để khô

-

Nhỏ dung dịch iodine (dung dịch 2) lên lame dể khoảng 1 phút

-

Lật nghiên lame cho dung dịch 2 chảy ra hết khỏi lame

-

Dung dung dịch cồn aceton (dung dịch 3) để tẩy màu bằng cách nghiên
lame nhỏ từ từ dung dịch 3 cho đến khi giọt cuối cùng trên lame không
còn màu tím. Rửa qua nước và để khô.

-

Nhỏ dung dịch safranin (dung dịch 4) lên lame, để khoảng 2 phút. Rửa
và để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát ở vật kính 100X
Đọc kết quả
-

Vi khuẩn Gram dương (G +) có màu tím xanh

-

Vi khuẩn Gram âm (G -) có màu hồng đỏ

Khả năng phát triển ở môi trường có bổ sung 6,5 % NaCl
Pha môi trường TSB + 6,5% NaCl, sau đó rút 5ml dung dịch cho vào ống
nghiệm đem thanh trùng ở nhiệt độ 121 0C trong 15 phút. Tiếp theo dùng que
cấy đã tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn, lấy 1 khuẩn lạc cho vào ống nghiệm.
Đọc kết quả sau 24- 48 giờ: vi khuẩn cho phản ứng (+) thì ống nghiệm có
chứa dung dịch bị đục ngược lại thì kết quả (-)
16


Khả năng gây tan huyết
Sử dụng môi trường BA (Blood Agar) + 5% máu cừu, dùng que cấy tiệt
trùng lấy 1 khuẩn lạc cấy lên đĩa petri có chứa BA (Blood Agar) + 5% máu
cừu, để trong tủ ấm ở nhiệt độ 360C đọc kết quả sau 24- 48 giờ.
-

Tan huyết dạng β: sự tan huyết lan rộng ra từ đường cấy tạo thành
những vòng tan huyết

-

Tan huyết dạng α: trên đường cấy vi khuẩn sử dụng máu biến đổi
thành màu xanh trên đường cấy

-

Tan huyết dạng γ: không có biến đổi gì khác

3.2.3 Định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep
Cho 5ml nước cất vào các giếng của khuôn nhựa. Đặt kit API 20 Strep
vào khuôn nhựa. Dùng que cấy hoặc tâm bông vô trùng lấy vi khuẩn cho vào