Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang i
LỜI CẢM ƠN
Thực tập tốt nghiệp thật sự là cơ hội quan trọng để sinh viên nói chung, sinh
viên chuyên ngành Bệnh học thủy sản nói riêng có thể tiếp cận với thực tế nghề
nghiệp, rèn luyện phương pháp nghiên cứu khoa học và hoàn thiện những kỹ năng
thực hành cần thiết trước khi rời khỏi giảng đường đại học. Những kiến thức đúc
kết được sẽ là bước đệm vững chắc, hỗ trợ cho công việc thực tế sau này.
Trong thời gian hoàn thành đồ án tốt nghiệp, ngoài những cố gắng của bản
thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của nhiều cơ quan và cá nhân. Với tất cả sự chân
thành và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin được gởi lời cảm ơn tới:
Thạc sĩ Trần Vĩ Hích-giáo viên hướng dẫn, người đã định hướng, động viên
và tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi được thực hiện đề tài này.
Tiến sĩ Nguyễn Hữu Dũng-giám đốc trung tâm Giống và Dịch bệnh thủy sản,
trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi được học hỏi và thực hiện đề tài
tại đây.
Ban chủ nhiệm Khoa Nuôi trồng Thủy sản, các thầy cô bộ môn Bệnh học
thủy sản đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và những người thương yêu tôi đã
luôn bên cạnh, giúp tôi có thêm sức mạnh thực hiện tốt đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, tháng 06 năm 2012
Sinh viên thực hiện

Võ Thị Mỹ Dung

Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung


Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang iii
2.3.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu (Hình 2.1). 15
2.3.2. Kiểm tra một số đặc điểm sinh hóa của hai chủng Streptococcus
iniae. 15
2.3.3 Nuôi cấy vi khuẩn và chuẩn bị vacxin Streptococcus iniae bất hoạt. 16
2.2.4.1. Bố trí thí nghiệm và thu mẫu 18
2.2.4.2. Xử lý mẫu. 18
2.2.4.3.Quy trình nhuộm mô hóa miễn dịch. 18
2.2.5. Phương pháp đánh giá hiệu quả vaccine. 19
2.2.5.1. Chuẩn bị cá thí nghiệm 19
2.2.5.2 Xác định liều gây chết 50% (LD50) bằng phương pháp ngâm 21
2.2.6 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm ngược, xác định tỷ lệ sinh tồn tương
đối RPS (%). 21
2.2.7 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 21
2.2.7.1 Phương pháp xác định các thông số 21
2.2.7.2 Phương pháp xử lý số liệu 22
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
3.1 Các đặc điểm sinh hóa của hai chủng vi khuẩn Streptococcus inae 23
3.2 Kết quả LD50 (%) và độc lực của chủng vi khuẩn Strep1 25
3.3 Sự xâm nhiễm của vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm. 27
3.4 Đánh giá mức độ an toàn của vaccine 31
3.5 Kết quả cảm nhiễm cá sau khi dẫn truyền vaccine và tỷ lệ sinh tồn tương
đối RPS (%) 33
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 38
4.1. Kết luận. 38
4.2. Đề xuất ý kiến 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39


Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang v
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. So sánh đặc điểm sinh hóa 2 chủng Strep1, Strep 2 với S. iniae từ các
nghiên cứu khác. 24
Bảng 3.2. Tốc độ sinh trưởng đặc trưng theo chiều dài của cá chẽm ở các nghiệm
thức. 32
Bảng 3.3. Tỷ lệ chết trung bình và tỷ lệ sinh tồn tương đối ở các nghiệm thức 34

Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cá chẽm Lates calcarifer 3
Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 16
Hình 2.2: Sơ đồ quy trình nghiên cứu mô hóa miễn dịch. 17
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng bảo vệ của vaccine. 20
Hình 3.1: Khuẩn lạc của chủng vi khuẩn Streptococcus iniae trên môi trường BA bổ
sung 5% máu cừu và 2% NaCl (A); mẫu soi tươi của vi khuẩn trên khi được nuôi
trong môi trường TSB (B). 23
Hình 3.2: Đồ thị về tương quan giữa tỷ lệ cá chết với nồng độ vi khuẩn chủng
Strep1 trong thí nghiệm xác định LD50 (%) bằng phương pháp ngâm 26
Hình 3.3: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá chẽm ở những nồng độ vi khuẩn khác nhau khi
cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm 26

dịch và vaccine là những công cụ được ứng dụng để kiểm soát bệnh. Tuy nhiên, so
với vaccine, hai công cụ kháng sinh và chất kích thích miễn dịch còn thể hiện nhiều
hạn chế. Sử dụng kháng sinh có thể để lại dư lượng trong cá, trong môi trường tạo
ra những tác động tiềm ẩn gây nguy hại cho môi trường và con người, từ đó dẫn đến
những sản phẩm dùng kháng sinh gặp phải e ngại của người tiêu dùng, gây khó
khăn trong tiêu thụ. Sử dụng chất kích thích miễn dịch tuy an toàn với con người,
với môi trường và vật nuôi nhưng lại chỉ tạo ra sự bảo vệ trong một thời gian ngắn.
Do đó, sử dụng vaccine là phương pháp kiểm soát tối ưu được các nhà khoa học
hướng đến để kiếm soát bệnh này.
Trên thế giới, vaccine phòng bệnh Streptococcosis đã được nghiên cứu từ
những năm 1980, trên thị trường cũng đã xuất hiện sản phẩm vaccine thương mại để
phòng bệnh S. iniae trên các loài cá khác nhau, nhưng ở Việt Nam lĩnh vực vaccine
còn rất mới. Với mục tiêu phát triển nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam nói chung,
nghề nuôi cá chẽm nói riêng hướng tới sự bền vững, thận thiện với môi trường và
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 2
an toàn với con người, các nỗ lực nghiên cứu để hiểu hơn về tác nhân gây bệnh, từ
đó sản xuất và đưa vaccine phòng bệnh Streptococcosis trên cá chẽm vào ứng dụng
đã và đang được thực hiện.
Được sự cho phép của khoa Nuôi trồng thủy sản, trường Đại học Nha Trang
và sự định hướng, giúp đỡ của thầy Trần Vĩ Hích, tôi đã thực hiện đề tài tốt nghiệp
với tiêu đề: “Nghiên cứu con đường xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus
iniae vào cá chẽm (Lates calcarifer) và đánh giá khả năng phòng bệnh do
Streptococcus iniae gây ra bằng cách ngâm cá trong vaccine”
Nội dung thực hiện:
1. Nghiên cứu con đường xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá
chẽm.
2. Đánh giá khả năng phòng bệnh do Streptococcus iniae gây ra bằng cách

Tên tiếng Việt: Cá chẽm, cá vược.
Tên tiếng Anh: Sea bass, Barramundi, Giant seaperch [9]

Cá chẽm có thân hình thon dài và dẹp bên, cuống đuôi khuyết sâu. Chiều dài
thân bằng 2,7 – 3,6 lần chiều cao. Đầu nhọn, nhìn bên cho thấy phía trên hơi lõm
xuống ở giữa và hơi lồi ở lưng. Miệng rộng và hơi so le, hàm trên kéo dài đến
phía dưới sau hốc mắt. Răng dạng nhung, không có răng nanh, trên nắp mang
có gai cứng, vây lưng gồm có 2 vi: vi trước có 7-9 gai cứng và vi sau có 10-11 tia
mềm. Vi hậu môn có 3 gai cứng, vi đuôi tròn và có hình quạt. Vẩy dạng lược và có
kích cỡ vừa phải, có 61 vẩy đường bên.
Khi cá còn khoẻ, trên mặt lưng có màu nâu, mặt bên và bụng có màu bạc khi
sống trong môi trường nước biển, màu nâu vàng khi sống trong môi trường nước
ngọt. Khi cá ở giai đoạn trưởng thành sẽ có màu xanh lục hay vàng nhạt trên lưng
và màu vàng bạc ở mặt bụng.
Cá chẽm phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc tây Thái Bình
Dương và Ấn Độ Dương, từ Đông Phi đến Papua New Guinea, từ nam Trung Quốc,
Đài Loan đến Bắc Úc. Tại Việt Nam, cá chẽm có thể được tìm thấy ở vịnh Bắc bộ,
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 4
vùng biển Trung và Nam Bộ.
Về khả năng thích ứng với các yếu tố sinh thái, cá chẽm là loài có khả năng
thích ứng rộng với sự thay đổi độ mặn, cá giai đoạn giống và trưởng thành sống
được ở độ mặn từ 0 – 35 ppt và có thể chịu đựng tốt với sự thay đổi độ mặn đột
ngột. Thực tế cho thấy cá giống cỡ 2 – 3 cm có thể thuần hóa từ độ mặn 30 – 32 ppt
xuống 5 – 10 ppt trong 2 – 3 giờ (Kungvankij et al. 1984; Tucker, 2000) [1]

. Vì
vậy, đây là loài rất thích hợp cho phát triển nuôi cả trong nước ngọt, nước lợ cũng

[1]. Cá chẽm nuôi tại Úc dễ dàng đạt > 0,6
kg sau 12 tháng nuôi. Tại các vùng có nhiệt độ cao, cá có thể đạt 0,8 kg sau 12
tháng, 3 kg sau 18 – 24 tháng (Tucker et al. 2002)

[1].
1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Streptococcosis trên cá.
1.2.1 Bệnh Streptococcosis.
Streptococcosis là một bệnh thường gặp ở người, động vật trên cạn và cả ở
động vật thủy sản. Ở cá, Streptococcosis được xem là một phức hợp các bệnh giống
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 5
nhau được gây ra bởi các loài vi khuẩn khác nhau. Bệnh được phát hiện xảy ra đầu
tiên ở châu Á vào năm 1957 trên cá hồi Oncorhynchus mykiss tại Nhật Bản
(Hoshina et al. 1958) [28]. Từ đó, bệnh đã không ngừng lan rộng cả về quốc gia
phân bố, loài cá cảm nhiễm và trở thành một bệnh nhiễm khuẩn gây thiệt hại kinh tế
nghiêm trọng cho các quốc gia nuôi trồng thủy sản trên thế giới.
Phân lập vi khuẩn từ các loài cá bệnh khác nhau và phân loại dựa vào lai
đoạn DNA của chuỗi 16S cho thấy có ít nhất 6 loài Streptococcus khác nhau
Streptococcus parauberis, S. iniae (S. shiloi), S. difficilis (S. agalactiae),
Lactococcus garvieae (Enterococcus seriolicida), L. piscium và Vagococcus
salmoninarum (Mata et al. 2004) [25]. Trong những thông báo đầu tiên, các chủng
vi khuẩn gây bệnh này được phân chia làm 3 nhóm dựa vào đặc điểm dung huyết:
dung huyết α, dung huyết β (Boom-ker et al. 1979; Kitao et al. 1981) và dung huyết
γ (Plumb et al. 1974; Rasheed et al. 1985; Baya et al. 1990) [16], [27]. Ngày nay,
người ta chia những vi khuẩn này thành hai nhóm dựa vào độc lực của vi khuẩn
theo nhiệt độ. Trong đó, L. Garvieae, S. iniae, S. agalactiae và S. parauberis
được xem là các tác nhân gây bệnh Streptococcosis cho các loài cá nước ấm với
việc gây chết ở nhiệt độ trên 15

loài cá biển như yellowtail Seriola spp. (Kitao, 1982), cá bơn ở Nhật Bản
Paralichthys olivaceus (Nakatsugawa, 1983), cá chẽm châu Âu (Dicentrarchus
labrax) và cá đù đỏ (Sciaenops ocellatus) (Eldar et al. 1999) ở Israel, gần đây là cá
chẽm (Latex calcarifer) ở Australia (Bromage et al. 1999), cá giò (Rachycentron
canadum ) cũng đã được thông báo là phân lập được vi khuẩn này. Theo thống kê
đến năm 2007, đã có trên 27 loài cá nước ngọt và nước mặn nhiễm bệnh do vi
khuẩn này gây ra [28]. Các quốc gia được thông báo chịu ảnh hưởng nặng nề của
bệnh như Nhật Bản, Irasel, Mỹ, Australia .
Những loài cá khác nhau khi bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae biểu
hiện những dấu hiệu khác nhau, tuy nhiên đều xuất hiện một số dấu hiệu chung, bao
gồm: Màu sắc đen tối, mắt cá lồi và đục, xuất huyết ở các gốc vây và xương nắp
mang, cá mất thăng bằng, bơi lội không bình thường (Perera et al. 1994; Bromage
et al. 1999; Eldar et al. 1999; Colorni et al. 2002) [25]. Các vết xuất huyết lan rộng
thành lở loét, nhưng các vết loét thường nông hơn các bệnh có lở loét khác. Dấu
hiệu điển hình của bệnh là cá vận động khó khăn, bơi xoắn, không định hướng,
xoang bụng tích dịch, xuất huyết các cơ quan nội quan, thận và lá lách tăng lên về
thể tích do phù nề (Bromage et al. 1999; Suanyuk et al. 2011). Kiểm tra mô học cho
thấy các biến đổi rõ rệt trong gan, thận, lách, tim, mắt và não. Gan, thận và tim thể
hiện phản ứng viêm nghiêm trọng. Trong mô gan, các mao mạch gia tăng về kích
thước, xuất hiện nhiều các tế bào lympho, các tế bào gan xuất hiện nhiều không
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 7
bào, thoái hóa và hoại tử (Suanyuk et al. 2011). Màng tim phình to với sự xuất hiện
nhiều các tế bào lympho và các trung tâm Melanomacrophage. Lách, não thể hiện
sự thâm nhập lượng lớn các tế bào lympho và sự tắc nghẽn nội mạch thường xuyên
chứng tỏ sự suy giảm các sợi fibrin trong các mao mạch (Bromage và Owen, 2002).
Bệnh có thể xảy ra ở dạng cấp tính hay bán cấp tính, ở dạng bán cấp tính cá
thể hiện các dấu hiệu bệnh lý bên ngoài đặc trưng của bệnh, nhưng nội quan không

xuất hiện bệnh trên cá chẽm, bệnh được thông báo đồng thời với dịch bệnh nghiêm
trọng do vi khuẩn này gây ra trên cá dìa (Singanus canaliculatus), mặc dù dịch bệnh
gây chết lên đến 100% trên cá dìa nhưng trên cá chẽm tỷ lệ chết lại rất thấp (Foo et
al.1985) [10]. Trung Quốc là quốc gia thứ hai thông báo bệnh Streptococcosis trên
cá chẽm với tỷ lệ chết từ 16.7- 32.6%, tuy nhiên chưa xác định được loài
Streptococcus gây bệnh (Huang et al, 1990) [10]. Ở Australia, từ năm 1992,
Streptococcus iniae đã gây bệnh vào mỗi hè với thiệt hại khoảng 8-15% sản lượng
cá chẽm nuôi lồng trên biển hàng năm, thậm chí thiệt hại có thể lên 70% khi bệnh
bùng phát dữ dội (Bromage et al. 1999). Kết quả thử nghiệm cảm nhiễm chủng S.
iniae ở cá chẽm cho thấy tỉ lệ tử vong cao với tỷ lệ chết tích lũy lớn hơn 75%
(Bromage et al. 1999). Vào năm 2003 và 2004, S. iniae cũng đã được thông báo gây
tác động nghiêm trọng đến nghề nuôi cá chẽm ở khu vực phía Nam Thái Lan
(Suanyuk et al. 2010). Ngoài ra còn có các báo cáo về bệnh xảy ra trên cá chẽm ở
Port Hurt, đảo Bathhurst (2005) với những dấu hiệu đặc trưng như đã nêu trên [3].
Ở Việt Nam, bệnh cũng đã xuất hiện với thông báo của Hich và Duzng (2011) về
phân lập được vi khuẩn này trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa.
1.3. Vaccine
Ngành nuôi trồng thủy sản thế giới ngày càng phát triển, với sự tác động của
con người cùng hàng loạt mô hình nuôi thâm canh và siêu thâm canh ra đời đã làm
tăng hiệu suất trong nuôi trồng thủy sản, tuy nhiên một hệ quả kéo theo là sự mất
cân bằng sinh thái, dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều hơn đã gây tổn thất không nhỏ
cho người nuôi. Việc sử dụng kháng sinh để kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn - một
trong những nguyên nhân gây thiệt hại nặng nề cho nghề nuôi trồng thủy sản, là một
phương pháp truyền thống, tuy nhiên bên cạnh hiệu quả chữa trị thì việc dùng
kháng sinh còn kéo theo những mối nguy hại trực tiếp cho môi trường và cho sức
khỏe con người khi hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn càng gia tăng. Trong bối
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 9

GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 10
vaccine đã cho kết quả tốt, lượng kháng sinh sử dụng đã giảm đi rất đáng kể. Sau
đó, một lọai vi khuẩn mới (Aeromonas salmonicida) lại xuất hiện, vaccine sử dụng
theo phương pháp ngâm không mang lại hiệu quả bảo vệ nên đến những năm 1990
vaccine sử dụng theo phương pháp tiêm kết hợp cùng chất bổ trợ ra đời. Vài năm
tiếp sau đó, nhiều loại chất bổ trợ cùng những kháng nguyên tái tổ hợp được tiến
hành thử nghiệm. Ngày nay, vaccine đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới, đặc biệt
ở các vùng nuôi cá hồi công nghiệp của các nước Bắc Âu, Chile, Canada, Mỹ, Nhật;
các trang trại nuôi cá da trơn ở Mỹ, mô hình nuôi cá chẽm, cá rô phi ở Châu Âu hay
các mô hình nuôi nhỏ ở Trung Quốc, Nga, Tây Ban Nha và Đức. Từ vaccine thương
mại được cấp phép đầu tiên ở cá là vaccine Yersinia ruckeri bất hoạt chống lại bệnh
viêm đỏ miệng được dẫn truyền bằng phương pháp ngâm trên cá hồi thì cho đến
tháng 7 năm 2005, đã có 35 loại vaccine phòng bệnh vi khuẩn và 2 loại vaccine
phòng bệnh virut được đăng ký bản quền và sử dụng cho 6 đối tượng nuôi phổ biến
trên 41 quốc gia trên thế giới bao gồm cá hồi, cá chẽm châu Âu, cá chẽm châu Á, cá
rô phi, cá turbot, và cá bơn đuôi vàng (Klesius và Shoemaker, 2009) [4]. Bên cạnh
đó 5 loại vaccine phòng bệnh virus trên động vật thủy sản khác đang được nghiên
cứu và phát triển
1.3.2 Tình hình nghiên cứu vaccine phòng bệnh Streptococcosis trên cá.
Những nghiên cứu kiểm soát bệnh Streptococcosis đã được thực hiện trong
suốt bốn thập kỷ kể từ khi bệnh được phát hiện đầu tiên trên cá, trong đó có
vaccine. Vaccine phòng bệnh Streptococcosis được nghiên cứu đầu tiên vào năm
1982, vaccine được dùng là vaccine bất hoạt formaline dẫn truyền bằng phương
pháp tiêm phòng bệnh do L. garvieae gây ra ở cá yellowtail. Vaccine này đã cho
hiệu quả bảo vệ cao với tỷ lệ sinh tồn tương đối RPS đạt 70% (Idia et al. 1982) [27].
Sau sự thành công này, các nghiên cứu vaccine phòng bệnh do L. garvieae trên một
số đối tượng Oncorhynchus mykiss, yellowtail Seriola spp. và vaccine phòng bệnh
do những loài Streptococcus khác tiếp tục được phát triển.

nghiệm thức dẫn truyền vaccine bằng phương pháp cho ăn cho hiệu quả thấp chỉ
9,75%.
Trên cá chẽm, vaccine phòng bệnh S.iniae được nghiên cứu đầu tiên ở
Australia vào năm 2006 với các nghiên cứu của Creeper và Buller, Delamare-
Deboutteville et al. Kết quả khả quan về đáp ứng miễn dịch dịch thể trên đối tượng
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 12
này đã được thông báo khi dẫn truyền vaccine bất hoạt bằng phương pháp tiêm
xoang bụng với một lượng lớn kháng thể đặc hiệu được tìm thấy trong cả dịch nhầy
và huyết thanh sau 21 ngày, ở phương pháp ngâm đáp ứng miễn dịch dịch thể mạnh
mẽ được tìm thấy trong dịch nhầy (Delamare- Deboutteville et al. 2006). Tuy nhiên,
khi áp dụng vaccine ngoài thực nghiệm thì gặp một số hạn chế khi cá lại bị cảm
nhiễm bệnh sau vài tuần dẫn truyền vaccine (Agnew and Barnes, 2007).
Với hơn 25 năm phát triển vacxin chống Streptococcosis, đã có nhiều
nghiên cứu vaccine trên nhiều loài Streptococcus khác nhau và trên những loài cá
khác nhau như cá hồi Oncorhynchus mykiss (Bercovier et al. 1997; Eldar et al.
1997b), cá chẽm (Delamare-Deboutteville et al. 2006), cá rô phi (Bercovier et al.
1997; Shoemaker et al. 2006; Suanyuk và Itsaro, 20110), yellowtail (Idia et al.
1982; Ooyama et al. 1999) và cá bơn Nhật Bản (Shin et al. 2007b; Shutou et al.
2007) [27]. Một số vaccine thương mại đã được đưa ra thị trường như vaccine
phòng bệnh S. iniae dùng cho cá chẽm châu Á của Intervet, vacxin dùng cho cá rô
phi của Schering-Plough [27].
Tùy theo từng loài cá, loài vi khuẩn, loại vaccine, phương pháp dẫn truyền,
tuổi cá cũng như việc dùng các chất kích thích miễn dịch kèm theo mà có sự khác
nhau trong hiệu quả bảo vệ khi dùng vaccine phòng bệnh Streptococcosis. Khoảng
thời gian bảo vệ sau khi dẫn truyền có sự khác nhau trên một số loài cá : báo cáo
cho thấy trong khi vaccine phòng bệnh do L. garvieae và S. iniae gây ra cho hiệu
quả bảo vệ cao trong khoảng 3-6 tháng ở cá hồi O. mykiss khi chủng ngừa trong

II. Ngoài ra, một số công ty nước ngoài cũng đang nghiên cứu sản xuất và thử
nghiệm vaccine phòng bệnh cho cá tra, cá điêu hồng và cá giò…[4]. Vào năm 2011,
vaccine thương mại đầu tiên cho cá ở ViệtNam đã được phép thử nghiệm, đó là
vaccine ALPHA JECT Panga 1 trên cá tra của công ty Pharmaq. Trên cá chẽm,
cùng với các công trình nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất giống và nuôi
thương phẩm, các nghiên cứu về bệnh thì những nghiên cứu sâu về đặc điểm miễn
dịch với vi khuẩn S. iniae cũng đang được thực hiện để tiến tới phát triển vaccine
phòng bệnh do S. iniae gây ra trên đối tượng này. Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 14
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu.
 Đối tượng nghiên cứu: Cá chẽm Lates calcarifer (Bloch, 1790).
 Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 20/2/2012 đến 02/06/2012.
 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm nghiên cứu Giống và Dịch bệnh thủy sản,
trường Đại học Nha Trang.
2.2. Vật liệu nghiên cứu.
2.2.1. Môi trường.
- Môi trường tổng hợp bổ sung 2% NaCl: TSA (Tryptic Soy Agar), TSB
(TrypticSoy Broth), BA (Blood Agar) có bổ sung 5% máu cừu.
- Môi trường Nutrient Broth ở các nồng độ muối khác nhau: 0 ppt, 10 ppt,
30 ppt, 40 ppt, 50 ppt để kiểm tra khả năng chịu mặn của vi khuẩn.
- Môi trường Manitol để kiểm tra khả năng di động và lên men đường manitol
của vi khuẩn.
- Test API Strep để thử đặc điểm sinh hóa của các chủng liên cầu khuẩn.
2.2.2. Hóa chất.

- Đèn cồn, lam, lamen.
- Bông không thấm nước, etiket.
2.2.3.2. Xác định hiệu quả vaccin.
- 500 con cá chẽm giống cỡ 2-4 cm, nguồn gốc từ trung tâm Giống và Dịch
bệnh, trường Đại học Nha Trang.
- Bể 2m
3
, hệ thống cung cấp khí, vợt cá và một số dụng cụ khác.
2.3. Phương pháp nghiên cứu.
2.3.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu (Hình 2.1).
2.3.2. Kiểm tra một số đặc điểm sinh hóa của hai chủng Streptococcus iniae.
Vi khuẩn được dùng trong nghiên cứu này là hai chủng vi khuẩn
Streptococcus iniae ký hiệu Strep1, Strep2 được cung cấp từ dự án SRV2701.
Những chủng vi khuẩn này trước đó được phân lập từ cá chẽm bệnh ở Khánh Hòa
và lưu giữ trong TSB bổ sung 20% Glycerol ở -80
o
C.
Kiểm tra đặc điểm sinh hóa bằng API Strep kit và kết hợp kiểm tra bổ sung
một số đặc điểm sinh hóa bằng phương pháp truyền thống: Manitol di động,
catalase, oxidase, khả năng chịu đựng nồng độ muối.
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 16

quả bảo vệ.
Kết luận
Tỷ lệ
chết do
dẫn
truyền
Đánh
giá tốc
độ sinh
trưởng
đặc
trưng.
Tỷ lệ
sinh tồn
tương
đối
RPS
(%).
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 17
2000 mL TSB bổ sung 2% NaCl ở 27
o
C trong 24h. Sau đó, dung dịch formalline
40% (w/v) được cho dung dịch vi khuẩn để đạt nồng độ 0.5% (v/v) và ủ trong 24h ở
27
o
C. Tiến hành ly tâm (400 x g ) trong 30 phút, rửa trong nước muối sinh lý 0.85%
và tạo dịch huyền phù. Mật độ vi khuẩn trong dung dịch huyền phù được đo bằng

S. iniae
10
7
CFU/mL
trong 60 phút.

Thu và cố
định mẫu. Làm mất
nước và mềm
mẫu.
Thấm parafin
và đúc mẫu. Cắt mẫu
bằng máy
Microtone.

Nhuộm mô
hóa miễn
dịch.

Gắn tiêu bản
bằng bom-

 Ngâm trong Xilen 2 lần, mỗi lần 5 phút.
 Ngâm trong cồn ethanol 100% trong 5 phút, trong cồn ethanol 70% trong 3
phút.
 Rửa bằng nước cất.
 Đặt lam trong buồng ẩm và giữ lát cắt luôn được ẩm ướt.
 Dùng bút dầu khoanh tròn khu vực lát cắt.
 Ủ lam với H
2
O
2
trong methanol trong 10 phút ở nhiệt độ > 22
o
C.
 Rửa lam 3 lần với TBS.
 Ủ với huyết thanh dê pha loãng với TBS 1/10 trong 10 phút ở > 22
o
C.
 Đổ huyết thanh dê ra ngoài và lau huyết thanh thừa bằng cách dùng khăn
giấy thấm ở góc lam.
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 19
 Đặt 50-100 µl Mabs đã được pha lên lát cắt và ủ 60 phút ở >22
o
C trong
buồn ẩm.
 Rửa lam 3 lần với TBS.
 Thêm kháng thể IgG liên kết HRP được pha loãng với TBS 1/50 trong 30
phút.