BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO




ESCHERICHIA COLI 
  Chuyên ngành: 
 : 62 62 50 10

: 1. 
2. 

ii

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án, tôi
luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này, tôi
xin cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện Đào
tạo Sau Đại học, Khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh - Truyền nhiễm, Cơ quan Thú
y vùng I đã tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình đào tạo Nghiên
cứu sinh tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo và tập thể cán bộ Chi cục Thú
y Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi điều tra, lấy mẫu thực hiện đề tài.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa
học là TS. Nguyễn Bá Hiên - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và TS. Đỗ
Ngọc Thúy - Viện Thú y đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực
hiện đề tài và hoàn thành luận án.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Cù Hữu Phú, ThS. Lưu Thị Hải Yến và tập thể
cán bộ Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia đã giúp đỡ tôi thực hiện đề tài
nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc Ban lãnh đạo và tập thể cán bộ Cơ
quan Thú y vùng I, nơi tôi công tác đã ủng hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực
hiện luận án này.
Tôi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình, bố mẹ, chồng
và hai con trai cùng các bạn đồng nghiệp, bạn bè đã đồng hành, đóng góp công
sức, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.
Hà Nội, ngày tháng năm 2012



1.2.6 Nhiễm VTEC ở người 29
1.3 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E. coli và bệnh do chúng gây
ra tại Việt Nam 31
1.4 Phương pháp phát hiện VTEC trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm 32

iv
1.4.1 Phương pháp vi sinh vật 33
1.4.2 Phương pháp miễn dịch học 33
1.4.3 Phương pháp sinh học phân tử 34
1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng để phân loại vi sinh vật 40
1.5.1 Nguyên tắc 41
1.5.2. Kỹ thuật 42
1.5.3 Ứng dụng của kỹ thuật phân tích PFGE 44
        
 45
2.1 Nội dung nghiên cứu 45
2.1.1 Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ, vệ sinh thú y trên địa
bàn Hà Nội 45
2.1.2 Thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR dùng để xác định vi
khuẩn VTEC 45
2.1.3 Tỷ lệ nhiễm và một số đặc tính cơ bản của những chủng
VTEC phân lập được 45
2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 46
2.3 Đối tượng nghiên cứu 46
2.4 Nguyên liệu nghiên cứu 46
2.4.1 Môi trường, hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 46
2.4.2 Các chủng vi khuẩn đối chứng dương và âm 47

3.2 Thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR dùng để xác định vi
khuẩn VTEC 70
3.2.1 Lựa chọn giữa PCR đơn mồi và Multiplex - PCR 70
3.2.2 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp để tách chiết DNA mẫu 73
3.2.3 Kết quả thực hiện phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn
E. coli tham chiếu 75
3.2.4 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR
dùng để xác định VTEC trong môi trường nhân tạo 77

vi
3.2.5 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp
PCR dùng để xác định VTEC trong mẫu thịt sạch 83
3.2.6 Quy trình xác định sự có mặt của vi khuẩn VTEC trong các
mẫu thịt 85
3.3 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm VTEC trên bò, lợn tại các điểm giết
mổ và chợ thuộc địa bàn Hà Nội 87
3.3.1 Thu thập mẫu 87
3.3.2 Phân lập và giám định đặc tính sinh vật hóa học của các chủng
E. coli 89
3.3.3 Kết quả phân lập VTEC trong thịt 93
3.3.4 Kết quả phân lập VTEC từ mẫu lau thân thịt và mẫu phân tại
lò mổ 96
3.3.5 Kết quả xác định các loại độc tố của các chủng VTEC phân
lập được 98
3.3.6 Kết quả xác định serotyp O của các chủng VTEC phân lập được 100
3.3.7 Kết quả phân tích quan hệ di truyền của một số chủng vi
khuẩn VTEC phân lập được có nguồn gốc khác nhau 103

E. coli
Escherichia coli
EHEC
Enterohaemorrhagic E. coli
EIEC
Entero invasive E. coli
EPEC
Enteropathogenic E. coli
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent asay
ETEC
Enterotoxigenic E. coli
FDA
Food and Drug Administration
HC
Hemorrhagic colitis
HUS
Hemolytic uremic syndrome
kDa
Kilodalton
LB
Luria Bertani
MR
Methyl Red
mDa
Megadalton
m-TSB
modified Trypticase Soy Broth
NB
Nutrient Broth

Verotoxigenic Escherichia coli
WHO
Tổ chức Y tế thế giới ix
DAN
STT
Tên bảng
Trang
1.1 Hoạt tính sinh học của các loại VT 19
1.2 Một số enzym cắt hạn chế được dùng cho kỹ thuật PFGE 43
2.1 Trình tự mồi dùng để xác định các gen VT1, VT2 và eae 49
2.2 Thành phần các chất trong phản ứng PCR dùng để xác định các
gen VT1, VT2 và eae 50
2.3 Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng để xác định gen VT1,
VT2 và eae 50
2.4 Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn E. coli
đối chứng dương 51
2.5 Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn đối
chứng âm 51
3.1 Số lượng các điểm giết mổ gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội 59
3.2 Kết quả điều tra điều kiện điểm giết mổ và phương tiện vận
chuyển của các điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội 62
3.3 Thực trạng vệ sinh của các điểm giết mổ gia súc, gia cầm thuộc
địa bàn Hà Nội 68
3.4 Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR đơn và Multiplex - PCR để

xi

TT
Tên hình
Trang
1.1 Cấu trúc kháng nguyên O 12
1.2 Cơ chế tác động của độc tố VT 18
1.3 Nguyên lý của phản ứng PCR 38
1.4 Chu trình nhiệt độ của phản ứng PCR 38
1.5 Sử dụng kỹ thuật PFGE phân tích nhiễm sắc thể sau khi xử lý với
enzym cắt hạn chế Sma I với vi khuẩn Haemophilus influenzae. 42
2.1 Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn 53
3.1 Sản phẩm của phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn đối chứng
dương và âm sau quá trình điện di 77
3.2 Kết quả nuôi cấy chủng FD636 ở các nồng độ pha loãng khác
nhau trên thạch máu 79
3.3 Sản phẩm của phản ứng PCR với nồng độ pha loãng khác nhau
từ môi trường LB đã nuôi cấy chủng FD636 82
3.4 Sản phẩm của phản ứng PCR với nồng độ pha loãng khác nhau
từ môi trường LB đã nuôi cấy chủng FD523 82
3.5 Quy trình xác định VTEC trên thịt 86
3.7 Tính chất mọc của E. coli trên môi trường MacConkey 92
3.8 Tính chất mọc của E. coli trên môi trường thạch máu 92
3.9 Tính chất mọc của E. coli trên môi trường EMB 92
3.10 Tính chất mọc của E. coli trên môi trường CT-SMAC 92
3.11 Khả năng lên men sinh hơi một số loại đường của E. coli 92
3.12 Khả năng sinh Indol của E. coli 92

Năm 2010, cả nước xảy ra 175 vụ ngộ độc thực phẩm, làm hơn 5.000 người
mắc và 42 trường hợp tử vong. Thiệt hại kinh tế cho chi phí điều trị bệnh và
nghỉ làm việc khoảng 8 triệu USD/năm (Phương Thuận, 2011) [101].
Các con số trên đây cho thấy một thực trạng đáng lo ngại về vấn đề vệ
sinh an toàn thực phẩm (VSATTP). VSATTP có vai trò rất quan trọng đối với
cuộc sống con người, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe, tuổi thọ, chất lượng
môi trường, chất lượng cuộc sống, phát triển kinh tế và uy tín thương hiệu sản
phẩm, uy tín quốc gia.
Trong số rất nhiều nguyên nhân vi sinh vật gây ra các vụ ngộ độc thực
phẩm ở người (Salmonella, E. coli, Vibrio cholera, Listeria, Clostridium
botulinum ), những năm gần đây, các vi khuẩn E. coli thuộc nhóm
Verotoxigenic (VTEC) ngày càng được biết đến như là một trong những tác
nhân quan trọng. Verotoxigenic E. coli là khái niệm dùng để chỉ nhóm các vi
khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ra độc tố Verotoxin hoặc Shiga-like toxin.
Các chủng VTEC là nguyên nhân gây ra các ca bệnh lẻ tẻ hoặc các ổ dịch
lớn bệnh viêm ruột xuất huyết (HC) và hội chứng urê huyết (HUS), ban xuất
huyết giảm tiểu cầu (TTP), viêm đường niệu (Urinary tract infections), viêm
màng não (meningitis) (XU và cs. 1999) [92]; (Lake và Cressey, 2002) [49].
Mặc dù E. coli O157: H7 vẫn được biết đến như là một serotyp chính

2
phân lập được từ các vụ dịch ở hầu hết các quốc gia, các chủng VTEC thuộc
các serotyp khác cũng đã được chứng minh là có mối liên quan chặt chẽ với
các vụ dịch tương tự như serotyp O111 ở Canada, Italia, Đức và Australia,
O103 ở Pháp, Italia và O104 ở Mỹ.
Ở rất nhiều quốc gia, VTEC là tác nhân gây bệnh tiêu chảy rất hay gặp
(Wachsmuth, 1994) [95]. Ví dụ, ở Đức, VTEC được phân lập từ trẻ em bị tiêu

bệnh của chúng thông qua thức ăn có nguồn gốc động vật. Hiểu biết về các
đặc tính của vi khuẩn VTEC ở thịt các loài động vật nuôi (bò, lợn…) làm thực
phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống
cảnh báo sớm và tiến hành các biện pháp phòng chống bệnh thích hợp. Nhiều
công trình nghiên cứu đã được thực hiện và công bố ở hầu khắp các quốc gia
trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam vấn đề này vẫn chưa được chú ý.
Để có được những hiểu biết về vi khuẩn nhóm VTEC trong thực trạng
giết mổ và chế biến thực phẩm tại Việt Nam, chúng tôi đặt vấn đề thực hiện đề
tài: "Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC)
phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội ”
2 
- Xác định đặc tính của vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập được từ
bò, lợn tại điểm giết mổ.
- Xây dựng được quy trình chẩn đoán, xác định vi khuẩn VTEC trong
sản phẩm thịt tươi.
3 
- Đề tài luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống về vi khuẩn
E. coli nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp chúng ta xác định và hiểu được
một số đặc tính cơ bản của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập được từ bò, lợn.
- Một số kỹ thuật mới và phương pháp phân tích kết quả có hệ thống
của đề tài luận án có thể ứng dụng trong nghiên cứu một số vi khuẩn khác ở
mức độ phân tử cũng như tài liệu giảng dạy về vi khuẩn nhóm VTEC.
- Hiểu biết về vi khuẩn nhóm VTEC ở các loài động vật nuôi làm thực

4
phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống

sau nhiều lần đổi tên, vào năm 1919, vi khuẩn này được gọi với một tên thống
nhất là Escherichia coli, viết tắt là E. coli. Từ đó đến nay, E. coli được xác
định là loài vi khuẩn thường gặp nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột của
người và động vật (Vu Khac Hung, 2004) [91].
E. coli là loài chủ yếu của giống Escherichia, họ Enterobacteriaceae.
Chúng là những vi khuẩn bắt màu Gram âm, hình gậy ngắn. Quan sát dưới
kính hiển vi thường thấy vi khuẩn đứng riêng hoặc thành đôi. Phản ứng
Catalase dương tính, Oxidase âm tính, hiếu khí tùy tiện, có thể di động nhờ
lông (flagella) hoặc không di động. Hầu hết các chủng vi khuẩn đều lên men
đường Lactose, một số lên men chậm và một số không sinh hơi. Thông
thường, E. coli có phản ứng Citrate âm tính, Methyl Red (MR) dương tính,
Voges - Proskauer (VP) âm tính và Indol dương tính. E. coli là vi khuẩn
thường thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật; từ đó E. coli được
thải vào nước, đất và đồng cỏ, không chỉ nhiễm lan trong đàn mà có thể
nhiễm vào một số sản phẩm nông nghiệp như rau, củ,
Từ đầu những năm 1940, một số ý kiến cho rằng vi khuẩn E. coli là tác
nhân gây một số bệnh ở trẻ em. Doyle và Padhye (trích dẫn từ Bray và
Beavan, 1989) [28] gọi vi khuẩn này là Bacillus coli typ neopolitanum, mà
sau này được gọi là nhóm O111, và thuộc lớp EPEC. Từ đó, những nhóm
E. coli khác được thừa nhận là nguyên nhân gây tiêu chảy. Các vi khuẩn

6
E. coli gây bệnh có độc lực rất khác nhau và có khả năng gây ra một số bệnh
nghiêm trọng. Một số chủng sản sinh độc tố gây phá hủy tế bào Vero và Hela,
tương tự như độc tố do Shigella dysenteriae typ 1 sản sinh ra. Những độc tố
này được gọi với những tên khác nhau như Verotoxin, Verocytotoxin hoặc
Shiga-like toxin. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tên gọi thống nhất

sau đó, vi khuẩn này đã trở thành một vấn đề lớn liên quan đến sức khỏe cộng
đồng, được chính phủ nhiều nước quan tâm. Vụ dịch lớn nhất được báo cáo
xảy ra ở Nhật Bản trong tháng 7 - 8/1996, với 9.578 ca bệnh được ghi nhận và
11 người chết, 90 bệnh nhân được xác định là bị HUS. Vụ dịch lớn thứ hai xảy
ra ở Mỹ, với 732 ca bệnh trong đó 4 người chết, 55 người bị HUS hoặc TTP.
Mặc dù, serotyp O157: H7 là typ vi khuẩn nổi bật nhất của nhóm VTEC, một
số serotyp khác của nhóm này cũng liên quan tới một số bệnh ở người. Hơn
nữa, sự tồn tại của các serotyp này là khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau.
Có hơn 100 serotyp VTEC được xác định dựa trên kháng nguyên O có khả
năng gây một số bệnh nghiêm trọng ở người như HC, HUS, TTP.
Ở nhiều nước, VTEC là một tác nhân gây tiêu chảy thông thường
(Wachsmuth, 1994) [95]. VTEC gây nên các triệu chứng khác nhau, từ gần
như không có triệu chứng gì, có hoặc không có triệu chứng đau bụng nhẹ, đến
những triệu chứng nặng hơn như HC, HUS hoặc TTP. Đối tượng thường bị
nhiễm VTEC là trẻ em dưới 5 tuổi hoặc người già. Ở những người trưởng
thành và trung niên, các triệu chứng có thể nhẹ như bị tiêu chảy nhưng không
xuất huyết. Điều này xảy ra khi bị nhiễm ở liều thấp, dưới 100 vi khuẩn. Ở
động vật, VTEC gây viêm ruột xuất huyết và tiêu chảy ở trâu bò, chúng cũng
có thể gây bệnh phù đầu ở lợn (Đỗ Ngọc Thúy, 2004) [8].
Hầu hết các vụ dịch VTEC, thường do serotyp O157: H7, có liên
quan tới sử dụng thịt bò chưa chín kỹ, và một số thực phẩm tương tự hoặc
sữa tươi. Truyền qua thực phẩm là phương thức lây truyền chủ yếu của
VTEC. Vật nuôi, đặc biệt là trâu bò, là nguồn tàng trữ VTEC chính (Beutin
và cs. 1993) [18]. Trong quá trình giết mổ, động vật mang trùng có thể
truyền vi khuẩn sang thịt qua phân, nhiễm chéo sang thân thịt của các gia

8


9
có kháng nguyên O được xác định, các vi khuẩn E. coli được xếp thành nhóm
kháng nguyên O (serogroup O). Hiện nay, nhóm E. coli dựa trên kháng
nguyên O đã được xác định được đánh số từ O1 đến O173 (trừ 7 nhóm đã bị
loại : O31, O47, O67, O72, O93, O94, O122).
1.1.2 Đặc tính của vi khuẩn E. coli
1.1.2.1 Đặc tính hình thái
E. coli là trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, có kích thước 2 - 3 x 0,6 µm.
Trên tiêu bản nhuộm Gram, vi khuẩn bắt màu Gram âm, đứng riêng rẽ, đôi
khi xếp 2 - 3 vi khuẩn thành một chuỗi dài. Vi khuẩn không sinh nha bào và
không bắt màu với các thuốc nhuộm axit. Vi khuẩn có lông và có khả năng di
động (Nguyễn Như Thanh và cs. 2001) [7]. Khi quan sát dưới kính hiển vi
điện tử, một số chủng vi khuẩn nhất định có mang cấu trúc fimbriae hay còn
gọi là yếu tố bám dính (Nguyễn Thị Liên Hương, 2010) [4].
1.1.2.2 Đặc tính nuôi cấy
E. coli là trực khuẩn hiếu khí tùy tiện. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh
trưởng và phát triển của vi khuẩn này là 37
0
C, pH thích hợp là 7,4; nhưng vi
khuẩn cũng có thể phát triển được ở môi trường có pH từ 5,5 - 8,0 (Nguyễn
Như Thanh và cs. 2001) [7].
Vi khuẩn E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông
thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản.
- Môi trường thạch thường: hình thành những khuẩn lạc dạng S tròn,
ướt, bóng láng không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2 -
3mm. Nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát
thấy cả những khuẩn lạc dạng R và M.
- Môi trường nước thịt: phát triển rất nhanh, tốt, môi trường đục đều có
lắng cặn màu tro nhạt dưới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi

+ Các phản ứng: Indol, Catalase, MR dương tính; Citrat, Oxidase, VP,
Urease, H
2
S âm tính. Vi khuẩn E. coli có khả năng khử nitrat thành nitrit, khử
cacboxyl trong môi trường lysine decacboxylase.
1.1.2.4 Sức đề kháng
Vi khuẩn E. coli có sức đề kháng yếu, bị diệt ở nhiệt độ 55
0
C trong 1

11
giờ hoặc 60
0
C trong 30 phút, đun sôi ở 100
0
C thì chết ngay. Các chất sát trùng
như axit phenic 3%, HgCl
2
0,5%, formol 1-2% có thể tiêu diệt vi khuẩn nhanh
trong 5 phút.
Trong phân, chất độn chuồng ẩm ướt, thiếu ánh sáng mặt trời, vi khuẩn
có thể tồn tại trên 2 tháng. Vi khuẩn E. coli có khả năng đề kháng với sự sấy
khô và hun khói. Những chủng E. coli trong phân có xu hướng đề kháng với
nhiệt cao hơn những chủng phân lập được ở môi trường bên ngoài. Ở môi
trường bên ngoài, các chủng E. coli gây bệnh có thể tồn tại đến 4 tháng
(Gross W. G. 1994) [34].
1.1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli

1.1.2.5.2 Kháng nguyên H (Flagella antigen)
Kháng nguyên H được cấu tạo bởi thành phần lông của vi khuẩn, có
bản chất là protein. Việc xác định kháng nguyên H chỉ phù hợp khi khả năng
di động của vi khuẩn được thể hiện tốt qua một hoặc vài lần cấy chuyển trên
môi trường bán cố thể. Hầu hết các kháng nguyên H đều có tính đặc hiệu cao,
ít hoặc không có phản ứng chéo. Các chủng không di động được ký hiệu là
NM (Non motile) hoặc H
-
.
Kháng nguyên H kém bền vững hơn so với kháng nguyên O, kém chịu
nhiệt, bị phá hủy trong cồn 50% và các enzyme tiêu hóa protein, không bị tác
động khi xử lý bằng formol 0,5% .
Kháng nguyên H khi gặp kháng thể H tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng
ngưng kết. Phản ứng xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O và các hạt
ngưng kết cũng lớn hơn, giống như những cụm bông. Do vậy, vi khuẩn có