ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ LIỄU

“BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC
TRỪ CỎ GLYPHOSATE VÀO CÂY ĐẬU TƢƠNG NHỜ
VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS”

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ LIỄU

“Bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ
glyphosate vào cây đậu tƣơng nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens”
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 0114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Đặng Trọng Lương

CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về đậu tƣơng
1.1.1. Nguồn gốc
1


Dựa vào sự đa dạng về hình thái, Fukuda (1993) và về sau nhiều nhà khoa học khác đã
thống nhất rằng, đậu tương có nguồn gốc từ Mãn Châu (Trung Quốc). Từ Trung Quốc, đậu
tương đã lan truyền đi khắp thế giới. Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản, vào khoảng 200
năm trước công nguyên, đậu tương đã được đưa vào Triều Tiên và sau đó được chuyển sang
Nhật. Đến giữa thế kỷ 17, đậu tương mới được nhà thực vật người Đức Engelbert Caemfer
đưa về Châu Âu và đến năm 1954 mới du nhập vào Mỹ. Một số tài liệu cho rằng cây đậu
tương được đưa vào trồng ở nước ta từ thời vua Hùng, cây đậu tương được trồng trước cây
đậu xanh và cây đậu đen.
1.1.2. Phân loại
Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.) Merr. Theo khóa
phân loại của Hymowitz T., C.A. Newell và căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý
và số lượng nhiễm sắc thể, cây đậu tương thuộc bộ đậu (Fabales), họ đậu (Fabaceae), phân họ
Leguminosae, chi Glycine. Đậu tương trồng có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 40 là loại cây trồng
mang lại giá trị kinh tế cũng như giá trị dinh dưỡng cao.
1.1.3. Vai trò của đậu tương
Cây đậu tương mang lại những giá trị rất toàn diện. Theo thống kê, trên toàn thế giới có
khoảng 1,2 vạn sản phẩm làm từ đậu tương. Các sản phẩm được tiêu thụ trên thị trường gồm
bột đậu nành đóng gói, đậu phụ, sữa đậu nành, sữa chua đậu nành,… Trong công nghiệp, đậu
tương được sử dụng để chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo,
chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương dùng để ép dầu.
Đậu tương là cây có khả năng cố định đạm nên được sử dụng làm cây luân canh cải tạo đất
trong hệ thống nông nghiệp. Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi
hàm lượng nitơ trong thân chiếm 0,05%, trong lá chiếm 0,19%. Ngoài ra đậu tương còn là
nguồn thức ăn tốt cho gia súc, 1kg hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn

liên tục gây ra khối u.
- Hệ gen thứ hai quy định lên quá trình sinh tổng hợp các opine. Đây là các axit amin lạ có
nguồn gốc từ arginine và không bao giờ xuất hiện trong tế bào bình thường.
T-DNA được giới hạn bởi hai bờ phải (right border) và bờ trái (left border). Hai bờ có
cấu trúc lặp lại gồm 24 cặp bazơ nitơ chỉ những đoạn DNA nằm giữa hai bờ được chuyển vào
tế bào thực vật. Bờ phải và bờ trái là những yếu tố cần thiết cho sự chuyển DNA. Tuy nhiên,
quá trình chuyển T-DNA lại do vùng gây độc quy định.
Vùng gen vir
3


Vùng vir dài 35kb mang các gen gây độc. Vùng này bao gồm gen virA, virB, virC, virD,
virE, virG (một số chủng còn có virF). Trong đó gen virA, virB, virD, virG cần thiết cho tạo
độc tính. Hoạt động của gen vir giúp T-DNA này tách ra khỏi vi khuẩn, xâm nhập vào tế bào
thực vật.
Sự biểu hiện của các gen vùng vir là một quá trình sinh hoá phức tạp mà các tác nhân đầu
tiên tác động đến nó là hợp chất phenolic. Với những đặc tính này A.tumafaciens được sử dụng
như một vectơ để chuyển gen vào cây.
1.2.3. Quá trình chuyển gen thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens
Chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ
hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, động
vật,...) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ.
Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất
hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen. Các bước chính để tạo một thực vật chuyển gen
gồm có: chọn lọc và phân lập gen, chuyển gen vào tế bào thực vật, nuôi tế bào thực vật mang
gen lạ thành cây hoàn chỉnh.
Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau như sử dụng
súng bắn gen, dùng xung điện tế bào và mô thực vật, dùng vi tiêm, chuyển gen thông qua con
đường ống phấn,… Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A. tumefaciens
là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay. Chuyển gen vào thực vật thông qua

có mặt và hoạt động trong Agrobacterium. (1) Vector chuyển gen: là Ti-plasmid nhỏ có khả
năng tự sao chép và có phổ vật chủ rộng với đoạn T-DNA được cắt bỏ hết các gen không cần
thiết ở giữa hai trình tự bờ trái và bờ phải, gắn thêm các đơn vị sao chép để DNA plasmid có
thể vừa tự nhân trong cả E. coli và Agrobacterium, các gen chọn lọc, gen chỉ thị, vùng có chứa
nhiều điểm cắt của các enzym giới hạn (vùng tạo ra dòng đa năng) nằm ở giữa hai trình tự bờ
trái và bờ phải để chèn gen mong muốn. (2) Vector bổ trợ: với vùng T-DNA và bờ phải, bờ trái
cắt bỏ hoàn toàn, giữ lại vùng vir. Khi các gen trên vector bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm
của nó sẽ tác động tới đoạn T-DNA trên vector chuyển gen dẫn đến sự chuyển đoạn T-DNA
sang tế bào thực vật.
Thực tế cho thấy, plasmid với hai đơn vị sao chép có thể không bền vững trong E. coli
khi cả hai vùng này cùng hoạt động. Tuy nhiên, vector nhị phân có ưu điểm như: không xảy ra
quá trình tái tổ hợp giữa các plasmid, kích thước vector khá nhỏ. Nhờ vậy, hiệu quả quá trình
chuyển gen từ E. coli sang A. tumefaciens đã tăng lên. Hiện nay, vector nhị phân được sử dụng
rộng rãi với rất nhiều loại được thiết kế phù hợp với yêu cầu của quá trình chuyển gen.
5


Hệ thống vector pCAMBIA
Vector pCAMBIA là vector nhị phân có nguồn gốc là vector pPZP. Đặc điểm chung của
pCAMBIA: số lượng bản copy trong E. coli cao, đơn vị sao chép pVS1 bền vững trong
Agrobacterium, kích thước nhỏ (từ 7-12kb) phụ thuộc vào từng loại plasmid, chọn lọc vi khuẩn
bằng chloramphenicol hoặc kanamycin, chọn lọc thực vật bằng hygromycin B hoặc kanamycin,
gen chỉ thị là gen gus.
Hiện nay hệ thống pCAMBIA đã đã thiết kế các vector khác nhau mang các gen thích
hợp với từng đối tượng thực vật, từng chủng A .tumefaciens và từng mục đích sử dụng khác
nhau. Gồm có: p2300, p2201, p1300, p1301, p1302, p1303, p1304, p1305.1, p1305.2.
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens:
Ảnh hưởng của kiểu gen: hiệu quả chuyển gen rất khác nhau giữa các kiểu gen của cùng một
loài. Nhiều báo cáo, tài liệu về chuyển gen đã đề cập đến ảnh hưởng của kiểu gen đến khả năng

trong các thí nghiệm chuyển gen thông qua Agrobacterium vào ngô và lúa ở nồng độ 100 mg/l.
Và đối với đậu tương là cefotaxim 200mg/l, car 250mg/l .
Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn: mật độ vi khuẩn Agrobacterium cao thường gây chết tế
bào thực vật giảm khả năng tái sinh của các tế bào sau khi biến nạp, dẫn tới giảm tần số chuyển
gen bền vững. Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn lây nhiễm cao là cần thiết đối với chuyển gen vào
các loài, các mẫu mô khó, tần số chuyển gen có thể được cải thiện bằng cách lây nhiễm ở mật
độ vi khuẩn cao sau đó rửa mẫu hoặc bổ sung các chất kìm hãm vi khuẩn vào môi trường đồng
nuôi cấy.
1.3. Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate trên cây đậu tƣơng
1.3.1 Cơ chế kháng glyphosate
Để sản xuất cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, người ta cần những gen kháng mã hóa
cho protein, những protein này hoặc làm bất hoạt thuốc diệt cỏ, hoặc thay đổi vị trí tác động
7


của thuốc trong tế bào, làm thuốc không còn gây hại.
Thuốc diệt cỏ glyphosate ức chế đặc hiệu enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase (EPSP-synthase). Đây là enzyme cần thiết trong thực vật để tổng hợp amino acid
thơm (phenylalanin, tryptophan và tyrosin), một số vitamin và các hợp chất có nguồn gốc thứ
cấp. Enzyme này không có ở người và động vật, vì vậy glyphosate không độc đối với người.
Glyphosate được phân giải trong đất nhờ vi sinh vật và không để lại sản phẩm độc hại nào.
Kháng glyphosate có thể do những cơ chế khác nhau:
+ Thứ nhất trong cây có sự biểu hiện mạnh mẽ của enzyme của EPSP-synthase dưới sự
điều khiển của promoter CaMV-35S và đồng thời tạo nên một enzyme oxidoreductase của vi
khuẩn. Nhờ enzyme oxidoreductase mà thuốc bị bất hoạt và với một lượng lớn EPSP-synthase
được tạo nên thì lượng thuốc còn lại không thể gây hại ở cây biến đổi gen. Ở đây 2 gen cần
thiết, trong đó gen oxidoreductase là không có trong thực vật.
+ Một khả năng thứ hai là sử dụng EPSP-synthase của vi khuẩn. Từ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens (loài CP4), EPSP-synthase vi khuẩn được phân lập và do sự thay
đổi trình tự amino acid nên enzyme này không còn mẫn cảm với glyphosate và vì vậy được sử
dụng trong nhiều cây trồng thương mại.

Vật liệu thực vật là hai giống đậu tương DT2008 và giống ĐT26.
Các chủng vi khuẩn GV3101, C58C1, LBA4404được lưu giữ tại Viện Di truyền Nông
nghiệp. Các chủng này chứa vector pCAMBIA2300
2.2 Hóa chất thiết bị
2.2.1. Hóa chất và môi trường
Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm: H2O2, BAP, IAA, các muối đa lượng, vi
lượng, vitamin thuộc môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) và B5 (Gambor, 1968). Các
chất kháng sinh, chất dẫn dụ acetosyringone (AS)...
2.2.2. Các thiết bị thí nghiệm
Các máy móc và thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: máy khuấy từ,
máy ly tâm, máy khuấy trộn vortex, máy quang phổ, máy soi chụp ảnh gel, pipetman các loại,
máy ly tâm lạnh, bộ điện di DNA, và một số trang thiết bị khác.
2.3. Nội dung nghiên cứu
9


Nội dung 1: Xây dựng quy trình tái sinh giống đậu tương DT2008 và ĐT26
Nội dung 2: Bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen CP4-EPSPS kháng thuốc trừ cỏ
vào hai giống đậu tương DT2008, ĐT26 nhờ Agrobacterium tumefaciens.
Nội dung 3: Đánh giá xác định sự biểu hiện của gen chuyển.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào để xây dựng hệ thống tái sinh cây





Phương pháp lây nhiễm chủng vi khuẩn vào mẫu thực vật
Phương pháp tách chiết DNA
Phương pháp PCR

mẫu

mẫu

mẫu

nhiễm

chết

sống

nhiễm

chết

sống

(%)

(%)

(%)

(%)

(%)

(%)


2

34

64

5

40

55

8

35

20

45

40

23

37

10

2


(phút)

15

20

Qua bảng số liệu cho thấy sử dụng dung dịch H2O2ở nồng độ 15% trong thời gian 10 phút
10


thích hợp cho việc khử trùng hạt đậu tương giống DT2008 và ĐT26, cho tỷ lệ mẫu sống cao: Với
giống DT2008 tỷ lệ mẫu sống đạt 92% và giống ĐT26 tỷ lệ mẫu sống đạt 90%.
3.1.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng tạo chồi từ lá mầm và nốt lá mầm
của các giống đậu tương nghiên cứu
BAP là một cytokinnin tổng hợp nhân tạo, có tác dụng kích thích sự phân bào và tái sinh
chồi mạnh mẽ từ mô nuôi cấy. Sau 9 tuần nuôi cấy với 2 lần cấy chuyển chúng tôi quan sát và
ghi nhận được kết quả ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP và IBA lên khả năng tạo cụm chồi từ lá mầm
Công thức

Giống ĐT26

Giống DT2008
Tỉ lệ tạo

Chất

Tỉ lệ tạo

lƣợng


83

4,89

+++

86

4,88

+++

2

0,1

100

6,22

+++

100

6,46

++

2,5


1,5

0,2

76

4,36

+++

80

4,67

+++

2

0,2

100

5,2

++

100

5,31


0

1

0,1

1,5

cụm
chồi

Số
chồi/cụm

Số
chồi/cụm

Chất
lƣợng
chồi

+: chồi trung bình, lá biến dạng
++: chồi khỏe, lá có màu xanh
+++: chồi to khỏe, bản lá rộng, lá có màu xanh đậm
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy khi kết hợp BAP với IBA thì khả năng tạo cụm chồi và số
chồi/mẫu của cả 2 giống đều cao hơn công thức đối chứng (không bổ sung BAP và IBA).
Trong thí nghiệm này chúng tôi chọn ra được công thức có bổ sung kết hợp 0,1 mg/l IBA với 2
mg/l BAP là công thức tốt nhất để tạo cụm chồi cho hai giống đậu tương DT2008 và ĐT26.
3.1.3. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của các giống đậu tương nghiên cứu


0,1

0,1

3.2

3.8

2

0,5

0,1

6,2

7,4

3

1

0,1

5,8

6,6

Kết quả cho thấy, khả năng kéo dài chồi của hai giống đậu tương nghiên cứu trên môi

Số rễ
TB/cây

Chiều

Chất

dài rễ

lƣợng

(cm)

rễ

12

Đặc điểm hình thái
cây con


0,1

47

1,26

2,05

Xấu

0,1

45

1,50

2,82

Xấu

Thân cây nhỏ, có 2-3
lá xanh nhạt.
Thân cây nhỏ, có 3-4
lá xanh nhạt
Thân cây mập,

ĐT26

0,5

98

4,36

7,65

Tốt

khoẻ, có 3-4 lá xanh
đậm

H2O215% trong 10
phút

MS-B5+ 0,1 mg/l IBA + 2 mg/1BAP
+ 100 ml/l nước dừa
Tạo cụm chồi
MS-B5 + 0,5 mg/l GA3 + 0,1
mg/l IAA

Kéo dài chồi
MS-B5 + 0,5 mg/l α-NAA

Ra rễ
Hình 3.5. Sơ đồ quy trình tái sinh hai giống đậu tương DT2008 và ĐT26
3.2. Bƣớc đầu xây dựng quy trình chuyển gen CP4-EPSPS kháng thuốc trừ cỏ vào hai
giống đậu tƣơng DT2008 và ĐT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
3.2.1. Xác định chủng vi khuẩn Agrobacterrium tumefaciens phù hợp để chuyển gen CP4EPSPS vào giống đậu tương DT2008, ĐT26
Trong thí nghiệm này, ba chủng vi khuẩn được thử nghiệm là LBA4404, C58C1 và
GV3101. Hiệu quả chuyển gen của từng chủng vi khuẩn được xác định dựa vào tần số biểu
hiện tạm thời của gen gus, kết quả thu được như sau:

Bảng 3.5. Biểu hiện tạm thời của gen gus khi lây nhiễm các chủng Agrobacterium khác nhau
với nốt lá mầm giống đậu tương DT2008 và ĐT26
Giống ĐT26

Giống DT2008
CT

Chủng


tạm thời

mẫu

gus

thời (%)

14


(%)
1

GV3101

101

4

3,96

100

5

5,0

2


Kết quả thí nghiệm ở bảng 3.5 cho thấy, trong số 3 chủng vi khuẩn sử dụng trong thí
nghiệm thì chủng vi khuẩn C58C1 tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở giống DT2008 và
ĐT26 đạt cao nhất (19,1% và 18,2%).
Như vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi chọn được các chủng C58C1 để lây nhiễm với
giống đậu tương DT2008 và ĐT26 cho hiệu quả biến nạp tương đối cao.
3.2.2. Ảnh hưởng của mật độ dung dịch vi khuẩn (OD600) đến hiệu quả chuyển gen vào
giống DT2008 và ĐT26
Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ dung dịch vi khuẩn
(OD600) đến khả năng biểu hiện gen gus của DT2008 và ĐT26
Giống ĐT26

Giống DT2008
Tỷ lệ

Tỷ lệ

sống

chết

(%)

(%)

0,0

86,5

13,5


14,7

0,0

15,5

1,65

82,5

17,5

1,64

84,2

15,8

3,5

84,0

16,0

3,2

0,6

83,4


17,4

82,7

17,3

17,2

1,2

65,3

34,7

4,5

66,4

33,6

4,7

1,4

60,4

39,6

2,2


sống
(%)

Tỉ lệ
chết
(%)

Tần số biểu

Tỉ lệ

hiện tạm

sống

thời (%)

(%)

Tỉ lệ
chết
(%)

Tần số biểu
hiện tam
thời (%)

0

87,5


7,5

82,5

17,5

6,5

60

81,5

18,5

18,7

80

20,0

18,2

90

65,5

34,5

10,5

0

2

3

10,0

8,5

3

4

12,8

11,4

4

5

18,5

18,1

5

6



Vancomycin

Cefotaxim

Giống ĐT26

Giống DT2008

(mg/l)
Tỉ lệ

Tỉ lệ

Số chồi

Tỉ lệ

mẫu

mẫu

tái sinh

mẫu

sạch

tái sinh



1,17

0

9

1,17

250

150

45

41

1,32

38

40

1,32

250

200

62


81

39

1

78

32

1

17


Kết quả nghiên cứu thu được tương đương với kết quả nghiên cứu của Wiebke và cs
(2006). Như vậy, dựa trên tất cả các chỉ tiêu theo dõi có thể kết luận công thức thí nghiệm sử
dụng 250 mg/l cefotaxim và 250 mg/l vancomycin cho hiệu quả ức chế vi khuẩn tốt nhất.
3.2.6. Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến sức sống và khả năng tái sinh của mẫu lá
mầm giống DT2008 và ĐT26
Nồng độ kanamycin được sử dụng cho nghiên cứu chọn lọc mô tế bào mang gen thường
dao động từ 50-500 mg/l tùy thuộc vào loài thực vật và loại mô tế bào sử dụng trong thí
nghiệm. Với cây đậu tương non, Zhang và cs (2006) sử dụng nồng độ kanamycin cao 400 mg/l
để chọn lọc cá thể chuyển gen. Cũng trên cây đậu tương nhưng với vật liệu lá mầm Muhammad
và cs (2010) lại sử dụng nồng độkanamycin thấp trong khoảng từ 20-50 mg/l trong quá trình
tiến hành chọn lọc. Nhằm xác định liều lượng kanamycin thích hợp giúp ức chế hoàn toàn sự
tái sinh của các mô tế bào đậu tương không mang gen kháng, chúng tôi bố trí thí nghiệm bổ
sung kanamycin ở các nồng độ khác nhau vào môi trường tái sinh của giống DT2008 và ĐT26.
Dưới đây là kết quả thí nghiệm chúng tôi thu được sau 40 ngày thí nghiệm.

trung bình
(chồi/mẫu)

1

0

90

2,22

0

94

2,27

2

60

40

1,15

56

44

1,14

chế sự phát triển của mô không mang gen ngoại lai của cả hai giống đậu tương thí nghiệm là
50-75 mg/l. Qua các thí nghiệm đã tiến hành, chúng tôi xác minh được nồng độ kháng sinh
kanamycin thích hợp để chọn lọc mô mang gen là 50-75 mg/l. Ở khoảng nồng độ này, 96100% mẫu lá mầm của giống đậu tương ĐT26 và 92-100% mẫu lá mầm của giống đậu tương
18


DT2008 không mang gen kháng mất khả năng tái sinh.

Từ các kết quả đạt đƣợc chúng tôi đƣa ra quy trình chuyển gen nhƣ sau:
Khử trùng hạt

Chủng vi khuẩn C58C1

Cho hạt nảy mầm
Nuôi lỏng tạo huyền
phù

Làm tổn thương nốt lá
mầm của hạt

Cho mẫu đậu tương tiếp xúc với dịch khuẩn với
OD600 = 0,8 (lây nhiễm trong 60 phút)
Đồng nuôi cấy trên môi trường A2 (trong 5 ngày)
Khử khuẩn bằng cefotaxim (250 mg/l) và
vancomycim (250 mg/l)
Chọn lọc bằng Kanamycin (50 mg/l)

Tạo chồi trên môi trường MS-B5 + 0,1mg/l IBA +
2mg/l BAP (trong 9 tuần)
Kéo dài chồi trên môi trường MS-B5 +0,5 mg/l

sống sót trên môi trường chọn lọc thì có 4 mẫu có sự xuất hiện của băng kích thước xấp xỉ 1,5 kb,
giống như băng kích thước của mẫu DNA plasmid pCAMBIA2300.1 mang gen CP4-EPSPS đã
khuếch đại (mẫu đối chứng dương tính). Trong khi 21 mẫu giống đậu tương ĐT26 đã biến nạp còn lại
thì không thấy xuất hiện băng kích thước nào, có nghĩa là không có sự khuếch đại gen CP4-EPSPS,
tương tự như mẫu đối chứng âm tính (cây đậu tương không chuyển gen) (hình 3.15).

21


CHƢƠNG IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
Dựa trên kết quả thu được từ thí nghiệm, chúng tôi rút ra những kết luận sau:
1. Đã xây dựng được quy trình tái sinh cây đậu tương giống DT2008 và ĐT26: sử dụng
H2O2 15% trong thời gian 10 phút để khử trùng mẫu, tạo cụm chồi đậu tương trên môi trường
MS-B5 có bổ sung 0,1mg/l IBA, 2 mg/l BAP, kéo dài chồi trên môi trường MS-B5 có bổ sung
0,1mg/l IAA, 0,5 mg/l GA3. Các chồi đậu tương đạt tiêu chuẩn chuyển sang môi trường ra rễ là
môi trường MS-B5 có bổ sung 0,5 mg/l α-NAA.
2. Đã xây dựng được quy trình chuyển gen CP4-EPSPS vào 2 giống đậu tương DT2008
và ĐT26 bằng cách sử dụng chủng C58C1 có OD = 0,8 lây nhiễm trên nốt lá mầm với thời gian
lây nhiễm là 60 phút, sau lây nhiễm đồng nuôi cấy trong 5 ngày. Mẫu đậu tương được khử
khuẩn bằng cefotaxim (250 mg/l) và vancomycin (250 mg/l), sau đó cho tái sinh theo quy trình
như trên để thu được cây chuyển gen.
3. Bằng kĩ thuật PCR đã xác định được 5 mẫu giống DT2008 (trong tổng số 25 mẫu thu
được sau biến nạp) và 4 mẫu đậu tương ĐT26 (trong tổng số 25 mẫu thu được sau biến nạp)
mang gen CP4-EPSPS, với kích thước xấp xỉ 1,5 kB.
Đề nghị
1.Tiếp tục tiến hành các thí nghiệm bổ sung để xác minh sự tồn tại của gen kháng thuốc
trừ cỏ trong các cây chuyển gen, đồng thời thực hiện tự thụ và chọn lọc để thu được các cây
chuyển gen đồng hợp tử làm vật liệu ổn định cho các thí nghiệm lai tạo giống kháng thuốc trừ
cỏ glyphosate tiếp theo.