----------

BÁO CÁO

Tên đề tài:

Ê

Ứ

Ứ

-GLUCOSIDASE Ừ
(LUMNITZERA LITTOREA)
S
UY

:T

GVHD:

SVTH:
MSSV: 1153010176
-2015

Tp. ồ hí Minh, ngày 05 tháng 05 năm 2015


Trong su t th i gi n h
Th nh ph
v truy n

ih
y

ng vi

guy n Th

o

ho m su t
s u n y.

Thủy v Th

s

d nh r t nhi u th i gi n v t m huy t h ớng
h

o v t o m i i u ki n thu n l i ho m

lu n t t nghi p.
m h n th nh g i l i

o em trong nh ng

m v kho h . T i xin
nghi m Sinh

s

ớ

m n

m n

n Th

u ủ nghi n

nt t

á

n

ủng h t i v m t tinh th n

s

guy n

inh

u v t o ho m ni m
ng l m vi

o ng
m



tinh th n v ng h

n

v

ồng th i l

nh

ng l

lu n ủ m nh.

m n
Tp. ồ hí

inh tháng 05 năm 2015
g

i th

guy n Th

hi n

im



................................... 8

1.2.1

guy n t

tá h hi t ........................................................................................ 8

1.2.2

ỹ thu t hi t lỏng - lỏng.................................................................................. 8

1.2.3

ỹ thu t hi t r n - lỏng .................................................................................... 9

1.2.4

ỹ thu t hi t ph r n ...................................................................................... 11

1.2.5

á y ut

nh h

ng

1.3
1.3.1

u v kh năng

h

nzym α-glucosidase .................. 21

Ầ

Ê

Ứ ............................. 23

V t li u............................................................................................................. 23

2.1

it

2.1.1

ng nghi n

u ...................................................................................... 23

2.1.2

i m nghi n

u ........................................................................................ 23


ph n ng ủ

enzyme -glucosidase ..................................................................................... 29
ghi n

2.5

us

nh h

ng ủ nồng

h t

nv nt

ph n ng ủ

enzyme -glucosidase ...................................................................................... 31
ghi n

2.6

u kh năng

o hi t lá

ỏ........................................................................................... 33



............................................................. 40

3.1

t qu

i u h

o tổng t lá

3.2

t qu

i u h

o ph n o n t

3.3

t qu nghi n

us

nh h

y

ỏ. ................................................... 40

t qu nghi n
ủ

3.6

u kh năng th ho t tính

o hi t t lá

y

So sánh kh năng
y

ỏ với

ỏ. ........................................................................ 44
h

y

nzym -glucosidase

h

nzym -glu osi s

ủ

Xá


.................................................................. 59

4.1

t lu n ............................................................................................................ 59

4.2

i n ngh .......................................................................................................... 64
...................................................................................... 65
................................................................................................................. iii


B ng 1.1: Ưu v nh

i m củ ph

ng pháp hi t Soxhlet. ................................10
nh h

B ng 2.1: B trí thí nghi m nghiên c u s

ng của

p-nitrophenyl-α-D-Glucosidase ...............................................................32
B ng 2.2: B trí thí nghi m nghiên c u kh năng
ủ

ng 2.4:


á

o hi t l n

enzyme α-glucosidase ..............................................................................39
B ng 3.1: S

nh h

ng của th i gi n

n v n t c ph n ng. .................................41

B ng 3.2:

t qu nghi n

nh h

B ng 3.3:

t qu kh năng c ch enzyme -glucosidase củ

us

ng của p-nitrophenyl-α-D-glucosidase ...43
o hi t................45

B ng 3.4: iá tr IC50 th hi n kh năng c ch enzyme -glucosidase của

o hi t n-hexane. .....53

h v m u

o hi t n-hexane ...........54

qu ng th o s th y ổi nồng

4-Nitrophenyl α- - lu opyr nos
ng 3.9:

ỏ và cây Cóc Tr ng ...................50

v nồng
h v m u

h t
o hi t ethyl acetate.56
o hi t thyl

t t .....57

i


DANH M C HÌNH VẼ

nh 1.1 : Lumnitzera littorea (Jack) Voigt ..............................................................3
nh 1.2: Lumnitzera racemosa Willd ......................................................................3
nh 1.3:


h phi

nh 1.9:

ồ th

h kh ng

nh 1.10: ồ th
nh 2.1:

á

nh tr nh .........................................................................19
nh tr nh ...................................................................19
nh tr nh ..............................................................20

h h n h p .............................................................................21

y

ỏ (Lumnitzera littorea) tr ớ v s u khi ph i ...................23

nh 2.2: Quy tr nh i u h

o tổng lá

nh 2.3: Quy tr nh i u h



h t n n khi

nzym α-glu osi s

ồ th th hi n s

nh h

nh 3.1:

nzym α-glu osi s t

ng của th i gi n

o hi t. .34

h . ................35

n v n t c ph n ng

của enzyme -glucosidase .......................................................................42
nh 3.2:

ồ th th hi n kh năng c ch enzyme -glucosidase của cao chi t
t lá

y

ỏ ......................................................................................46

khá nh u ủ

t t . .............................................................................58

iii


Ặ
nh ái tháo
á

i n h ng nh

hi …

ng l m t ăn

U

T T

Ấ

Ề

nh nguy hi m v

nh tim m h t i i n m h máu n o m l

tr th nh nguy n nh n g y t vong th t


igu ni s

tá

Sulphonylur s

n ỏ

th m nhi u l

u á

h t

s

h n ho vi

tr n th giới

n n nguồn th

i t t m ki m v s
nh.
hép

h ng hi u i t v

o th

is

ng ph i nghi n

ng nh

ụng
y ỏ

v t ồi

ng tr nh nghi n
Vi t

m nằm trong v ng khí h u

y ỏ trong t nhi n l m th
l ih y

m t v th nh t

h

ho t tính

o v phong ph . T th i x x

nh h y nh ng kỹ thu t hi n

Ư

n y khi m y h
l nh v

á nh kho h

ụng hi n n y v n

á nguy n li u khá nh u. Trong

nhi t ới gi m
t

ằng á h

ng

í hh n h

ho t tính enzyme α-glucosidas
t

ng lo i 2 h ớng i u tr

h ho t tính enzyme α-glucosidas mới t nhi u nguồn khá nh u.

á nh kho h
sinh h

nh ái


á n ớ

u á ph

h ho t tính enzyme α-glucosidas hi n
h

ng gi tăng nh nh với

uv

nguồn th

n ng y h m
t

trong
phẩm ồi

nh ủ n .

1


U

T T

R ng ng p m n l m t h sinh thái huy n ti p gi
li n

ỏ

hi Lumnitzera h

trong h sinh thái ủ r ng ng p m n

ng

t n trong sá h ỏ

m năm 1996.
Tr n

s

t i “Nghiên cứu và

của enzyme -glucosidase t
hí

tr l

ng tá nghi n

r ng ng p m n.
tr

nhi u lo i l

i n (Clerodendrum inerme), Ô rô (Acanthus

m i tr

ng th nh.

o
ụ

it
í h ủ

Cóc Đỏ (Lumnitzera ittorea)”
u kh ng l m nh h
ng nghi n

ho t tính sinh h

nguy n li u trong l nh v

UY

T

Ư

xu t. Tiêu

ng tới h sinh thái th

u ho



nguồn

phẩm.

2


U

T T

PHẦN I: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI LUMNITZERA
1.1.1 Phân loại[13]
Chi Lumnitzera là m t chi s ng trong r ng ng p m n. Theo tác gi Ph m
Hoàng H

[16]

,

Vi t Nam chi Lumnitzera gồm h i lo i l

ỏ (Lumnitzera

littorea) và Cóc Tr ng (Lumnitzera racemosa).



T

Ư

nh 1.2: Lumnitzera racemosa Willd

3


U

nh 1.3: o

nh 1.5: o

UY

T

ủ L. littorea

ủ h i lo i

Ư

T T

nh 1.4: o

nh 1.6:

Cây thân g , cao 10-20 m, vỏ màu nâu th m, có v t n t, m t trong vỏ màu nâu
ỏ, ph n giác màu vàng, lõi màu nâu th m, cành nhánh hình khúc khuỷu, vuông,
khi non m u ỏ nh t, có nhi u m t do nh ng v t s o của lá rụng
u cành, phi n lá hình tr ng ng

Lá m c cách, t p trung
bóng, dài 2-8 cm, r ng 1-2.5 m
cu ng

l i.

nh tròn có khía tai bèo, g c hình nêm, ít gân,

i 0.5-1 cm, lá tích nhi u mu i.
R có kh năng

thành h r trên m t

m s u v o lớp mùn dày. R khí th
t nh

ng không phát tri n

á cây khác. Tuy nhi n trong m i tr

khí có th phát tri n thành h r vòng trên m t

t d ng m u r nhỏ.

mm.


him

i. h 5-10, dài

n. B u lô 5 lá noãn

c bi t là chim hút m t

ng th m gi v o s thụ ph n của

hoa.
Qu h ch, 1 h t, hình tr ng dài 3-4 cm, với nhi u s i

ng m

ủa vỏ qu

nằm r i rác, vỏ qu trong c ng. Qu non m u n u ỏ, qu chín rụng, mùa ra hoa vào
tháng 6

n tháng 8, mùa qu

hín v o tháng 8

n tháng 10.

1.1.3 Phân bố[9,25]
y
lo i


ít ng p n ớ m n nh

Tr ớ năm 2001
ỏ khi gi th

h u

y

n i
ng

i

v ng nhi t ới. Ở Vi t

s ng v n i n n i h ng p
u

h Qu

vv...

n kh i thá r t nhi u. V th n cây Cóc

m i ăn n n tr ớ khi h t

y ng



kh i thá

s

án

o v r ng
ỏ

h Qu

V nh ng tá
á lo i n y

ng ủ

á y u t t nhi n v
hi

n

o
p áo

nh ng s l

ng

y n y.


i – th nh ph

ng ti n h nh m t
ỏ.

t v hủy i t ng y

in n. Ở Vi t

th nh

hi n khá t t ph n n o ngăn h n

ng r t ph h p với

loài Lumnitzera littorea l m t lo i
sá h ỏ với

h Qu

nh n gi ng phát tri n lo i

l m i tr

th y ổi

m t v ng nhỏ

i

1.1.4 Giá trị kinh tế[9,24]
p có ti m năng trong ngh thu t, trang trí. G t t, có th nằm

Màu cánh hoa
trong

n v n ớc ng p m n l u năm m kh ng

c hay ng
n u lo i

i

n

yn y

ph

ng

ng l m

ng ụ lao

mụ n n
ng nh

c s dụng làm c t,
án u


n

c s dụng

x nóng, b nh viêm ru t, loát

mi ng.
1.1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước.
1.1.5.1 C

Cóc Đỏ (Lumnitzera littorea)

 Trong n ớc:
ho
h

h

nn y h

t m th y

v ho t tính sinh h

ủ

ng tr nh nghi n
y



tăng tr

ng s

ỏ (Lumnitzera littorea)
ng ủ vi khuẩn t i nồng

h ng minh

o hi t n-hexane t

kh năng kháng khuẩn.

h năng

h s

0.04 mg ml.

1.1.5.2 Cây Cóc Trắng (Lumnitzera racemosa)


Trong n ớc:
ăm 2013 Tr n Mỹ Linh[22] và c ng s

h ng minh ho t tính c ch n m

và vi khuẩn gây b nh của ba loài th c v t ng p m n Aegiceras corniculatum,
Avicennia marina và Lumnitzera racemosa t i v

cây Lumnitzera racemosa gồm có castalagin (7); corilagin (8); acid chebulagic (9);
acid chebulinic (10); acid neochebulinic (11); 2,3-di-O-galloyl-D-glucopyranose
(12);

1,2,3,6-tetra-O-galloyl-D-glucopyranose

(13);

2,3,4,6-O-galloyl-D-

glucopyranose (14); 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl--D- glucopyranose (15); 2,3-(S)HHDP-D-glucose (16) và punicalagin (17).
ăm 2008 Jun W.[8] v
tính kháng khuẩn trong

ng s

h p h t t nnin

h ng m nh rằng

o m th nol

ho t

kh năng th m gi v o nh m á h p

h t h h ng tăng huy t áp.
ăm 2010, Lisette D.[11] và c ng s

h ng minh cao thô ethanol và cao n-


o v ch



o nh

tm ts g ct

, HRSA,

NO, FRAP, LPO, SOD.
1.2 TỔNG QUAN VỀ

T

1.2.1 Nguyên tắc tách chiết[15]
hi ho nguy n li u v
v o nguy n li u s u

ung m i ti p x

với nh u

nh ng h t trong t

m i rồi khu h tán r ngo i t

o nguy n li u


y với n ớ

n

g il n ớ s .

ng pháp l i u n ằng h i n ớ

ph

ng pháp s

go i
ụng

h t lỏng si u tới h n,…
Có nhi u á h

chi t xu t các h p ch t h u

u xo y qu nh h i ph

ng pháp hính l

tách là s dụng m t lo i dung môi h u

r khỏi cây cỏ, các kỹ thu t

hi t lỏng - lỏng và chi t r n - lỏng. Chi t
thí h h p có kh năng h

í h hính ủa s chi t bằng ung m i l
.

n l u ý rằng s chi t lỏng - lỏng

tăng nhi t

tinh ch h
c th c hi n

cho dung môi thì kh năng h

s
nhi t

m t h p ch t nào
phòng, n u gia

t n ủa dung môi sẽ tăng l n v

nguyên t c trên sẽ có nhi u s th y ổi.

UY

T

Ư

8


o h n v ít m t

chi t liên tục, dung môi trong bình ng m ki t

i hỏi thi t b ph c t p

ng h n v

oh

y l quá tr nh

m u ch t sẽ

c liên tục

thay th bằng dung môi tinh khi t.
1.2.3.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm
ỹ thu t hi t ng m d m
kh ng
m u

i hỏi thi t
y.

nh

g m

n p


ng t

y ho

th g n

v
th

trong

hi t ằng á h th nh tho ng

nh v o máy l

l

thép kh ng r

ung m i h u
h

nh ( h

ng lớn

th h

t n

nhi u h n

thu hồi

t

nm

ng ung
o hòa,

ng m l u h n h m t th i gi n.

hi t nhi u l n m i l n m t ít l

ung m i s u khi
ti p tụ s

n ng m 24 gi l

nh m u h t h h

t n thêm
hi t l

h

h

ng ung m i.

H th ng ho t
lu n

ng d a trên nguyên lý: dung môi h u

ổi mới

un n ng sẽ

T T

hòa tan t i

h p ch t trong mô th c v t.

y h i l n th o nhánh th ng

trình l p l i ho

ung m i

c

n trái khi g p ng sinh hàn, dung môi

ng ng tụ v r i xu ng trụ chi t trung tâm. T i
lôi kéo ra ngoài. Khi trụ

trong trụ chi t luôn


í h th ớc trụ làm giới h n kh i l

ng

m u chi t.

hòa tan.

-

h t hi t trong

nh

un n ng l u

- hi t ki t h p h t o ung m i lu n ph n hủy.
ổi mới.

- Thi t

ph

t p kh s n xu t quy m

lớn.
1.2.3.4Kỹ thuật chiết bằng lôi cuốn
y l ph
u
t

u kh ng

nh h

un s i lớp n ớ n y
ng

i quá tr nh un

nóng.
hu h tán l
tinh

u.

t n i

h

nồng

o

á ph n t
T

nn i

nồng


u. Thẩm th u

m t t i ti t. Trong thẩm

ng t m t n i

nồng

th p o
10


U

huy n
th p

ng ph n t . á t
n

ngo i t

o.

n y

o lớn

o


i m n y nhi t
p nhi t l

tăng th m nh ng quá tr nh

ng

n ớ

n

o. Quá trình

hi nồng

h tt n

h i

n ằng nh u á ph n t n ớ sẽ i huy n r khỏi m ng t

l quá tr nh un n ng n ớ . hi ung

n ớ tăng l n

ồng

khuynh h ớng i huy n v o t

o. á ph n t n ớ n y sẽ m ng th o á ph n t tinh

xá

u

un n ng

n áp su t

nh v t o th nh m t h n h p

ng

phí.
h th năm l s ng ng tụ ủ s n phẩm h ng

t.

i n ớ v tinh

u

l m l nh ằng á h ng ng tụ.
h

u i

v r i xu ng

ng l s ph n tá h n ớ v tinh


u

á ph n t tinh

u ng m v o n ớ nh quá tr nh khu ch tán thông qua màng, hai
á t i ti t v

ng

li u trong n ớ s i. T i th i i m n y m t ph n tinh

ph n tán trong á ph n t n ớ

t

u phí

ới.

Quá tr nh un n ng l
h pn yl

u. h t lỏng

u

h n yx yr
khu h tán

y theo h i n ớ .

ụng

11


U

á

h t h p thu gi ng nh lo i s

th

ng, ph

T T

ụng trong s

k

t gồm h t h p thu ph

o v pha trao ổi ion.

ỹ thu t hi t ph r n th

ng

áp ụng

–

phân chia cao th

n

u (có ch a t t c các lo i h p ch t t không phân

n phân c ) th nh á ph n o n có tính phân c c khác nhau.

c
–

n

u

ng là nh ng ch t li u

i

cô l p m t m u h p ch t thiên nhiên c n kh o sát ra khỏi

o th

gi i o n cu i mu n tinh ch m u h p ch t.

ho c

1.2.5 Các yếu tố ản


i khi

ng nghi n

u các h p ch t có tính ái

c th c hi n bằng cách chi t nh ng h p ch t t nhiên có trong

t bằng các dung môi có tính phân c

tăng

n ho c chi t m t l n l y t t

c các lo i h p ch t bằng cách s dụng dung môi v n năng m th nol (

th chi t

h u h t các h p ch t t nhiên trong m u cây).
Nguyên t c của s chi t là dung môi không phân c c (ví dụ: eter d u hỏa,
hexan, heptan, benzen, toluene,…) sẽ hòa tan t t các h p ch t có tính không phân
c c (ví dụ: các alcol béo, ester béo,…)
eter, chloroform,…) h

ung m i ph n

c trung bình (ví dụ: dietyl

t n t t các h p ch t có tính phân c c trung bình (các h p

th p 30 – 40 0C vì th c hi n

nhi t

cao có th l m h h i m t

vài h p ch t kém b n nhi t.
Ch n dung môi ph i

tính trung tính kh ng

c, không quá d cháy, hòa tan

c các h p ch t c n kh o sát. Sau khi chi t tá h xong
lo i bỏ d dàng. C n tránh á
sôi th p nh

ung m i

i tyl t r

nh

ung m i

th

c

nz n ho c d cháy do có nhi t

tan của t p ch t

tăng kh ng h

ng tăng th o l m ho

gôm, ch t nh y…ngo i r khi nhi t
li u b tr

ng n , tinh b t b hồ h

tan của ho t ch t tăng m

ch chi t thu

c sẽ l n nhi u t p nh

t tăng sẽ làm cho m t s ch t trong nguyên
nhớt của d ch chi t tăng g y kh khăn ho

quá trình tách chi t.
–

i với dung môi d

yh i

nhi t

sôi th p khi tăng nhi t


ng nhỏ (th
s u

ng là ho t ch t) sẽ

n các phân t lớn h n (

n u th i gian chi t ng n sẽ không chi t h t

y nh ng n u th i gian chi t dài quá thì d ch chi t sẽ

l n nhi u t p gây b t l i cho quá trình tinh ch và b o qu n.
1.2.5.4 Độ mịn của nguyên liệu
hi kí h th ớc của nguyên li u cây thô quá dung môi sẽ khó th m ớt
nguyên li u, ho t ch t khó chi t vào dung môi nên th i gian chi t sẽ l u h n.
nguyên li u cây m n quá thì b m t ti p xúc gi a nguyên li u v
l

ng ch t khu h tán v o ung m i tăng

o

hi

ung m i tăng l n

th i gian chi t sẽ ng n h n.

Tuy nhiên n u nguyên li u quá m n, khi ng m vào dung môi b t nguyên li u


h im ts

qu n trong

i v o máu. á th

t
ăn

á lo i th

th

i

th

th l m tổn

ánh m

ph n hủy

m kho i t y trái

ng. h ng t s

ng x y r khi kh ng
ng


o trong th i gi n

r ohy r t gồm

ng máu. nsulin ho phép glu os

ủ

ng

th .

s ... Tuy n tụy m t
v o

nh tr ng khi l

ng l nguồn năng l

ng n y trong máu quá

ng glu os n y
v

o.

ng) l

ụng năng l


huy n m n l

i

ng kh ng nh ng
hính v th m

thu

h

khỏi

ng

ng trong máu

nh ái tháo

t s m llitus th o ti ng y

i nn y h

l

p

nh ti u



insulin v h th ng mi n

ng x y r
nh.

h ủ

nh ái tháo

ng

trẻ m t 10 tuổi tr l n v

hi m

guy n nh n l
th nh m l n

ủ tuy n tụy l m ho tuy n tụy kh ng s n xu t insulin.
o sẽ kh ng huy n h

UY

T

glu os l m ho l

Ư


tháo
ho

kém nh y

m với s

huy n h

ng x y r

ng h p

ng lo i 2 m

T T

ng

ái tháo

i tr n 50 tuổi hi m kho ng

ng.

i với nh ng ng

th v n s n xu t

insulin nh ng á t


nh n ti m ẩn trong
nh ng ng

n

n gi m.

ut og n

i u n y l m ho

i m ng g n ti m ẩn

nh v n gi

ng lo i 2

nh

nguy n
u

i n pháp ph ng ng

th kh ng xu t hi n ho

ng ti m ẩn. Trong tr

n

i m

ng xuy n trong

u

nsulin

nh ái tháo
iv

th h kh ng

nhi u lo i nh ng nằm trong h i

h m:

ng tá

ụng nh nh

th ph h p với l
uổi t i

ng

gi l

ng lo i 1 h sẽ ph i tiêm insulin
ng hính t y th o tá

u ng insulin
phân hủy. o

trong m t vỏ nang thích h p

thu

ng viên là kh ng th vì insulin trong môi
các nhà khoa h
có th qua

ru t non và ng m vào máu. Th i gian g n
t nó

vào máu ằng

phát hi n

UY

ng thu

T

Ư

ng nghiên c u

insulin


vào tình tr ng ủ

ăn u ng thích h p tăng

2 mới dùng thu

nh nhân, ph

ng ho t

ng pháp ch

ng. h

nh nhân ái tháo

u ng k t h p với nh ng h t

ng huy t.

nh nhân có th dùng riêng thu

tr g n li n với
ng lo i

hi u nhằm làm gi m l
viên ho

ng


metformin (Glucophage, Glucophage XR, Metformin XR, nhóm thiazolidinedione:
glitazone, rosiglitazone (Avandia), pioglitazone (Actos).
–

h m ngăn ru t bớt h p thu ch t

ng khi ăn ằng ch t c ch enzyme α-

glucosidase: acarbose (Precose, Glucobay), miglitol (Glyset).
h
2
h

ng pháp
u ti n s

h
ụng v

nzym α-glu osi s trong i u tr
h

n gi n

n to n

h x y r trong

h kh ng th m gi v o quá tr nh huy n h



UY

T

Ư

17