LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iii
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... iv
BẢNG KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ vii
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH SỞI TRÊN THẾ GIỚI .......................... 3
1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC BỆNH SỞI ......................................... 4
1.2.1 Phạm vi vật chủ........................................................................................................ 4
1.2.2 Phương thức lây truyền.......................................................................................... 4
1.2.3 Tính cảm thụ - miễn dịch ........................................................................................ 4
1.2.4 Biểu hiện quá trình dịch .......................................................................................... 4
1.3. VIRUS SỞI ....................................................................................................... 5
1.3.1 Phân loại .................................................................................................................. 5
1.3.2 Hình thái học ............................................................................................................ 5
1.3.3 Thành phần hóa học ................................................................................................ 6
1.3.4 Cấu trúc .................................................................................................................... 7
1.3.5 Đặc tính của virus sởi ............................................................................................. 7
1.3.6 Quá trình nhân lên của virus sởi trên tế bào ...................................................... 11
1.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của TB và sự nhân lên của virus .. 14
1.4. BỆNH SỞI ...................................................................................................... 20
1.4.1 Chu kỳ phát triển của virus sởi trong cơ thể bệnh nhân ................................. 20
1.4.2 Triệu chứng bệnh ................................................................................................ 20
1.4.3 Biến chứng của bệnh sởi .................................................................................... 21
1.5. PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH SỞI .............................................................. 22

3.1. Khảo sát mối quan hệ giữa nồng độ NaHCO3 bổ sung vào môi trƣờng nuôi
cấy virus với giá trị pH đo đƣợc của môi trƣờng .................................................. 38
3.2. Kết quả nghiên cứu nhóm I ............................................................................ 40
3.3. Kết quả nghiên cứu nhóm II ........................................................................... 41
3.4. Kết quả nghiên cứu nhóm III.......................................................................... 43
3.5. Kết quả nghiên cứu nhóm IV ......................................................................... 44
3.6. Kết quả nghiên cứu nhóm V ........................................................................... 46
3.7. Đánh giá mối liên hệ giữa pH môi trƣờng với hiệu giá vắc xin sởi bán thành
phẩm từ nhóm I đến nhóm V ................................................................................. 47
3.8. Kiểm định chất lƣợng 3 lô vắc xin sởi bán thành phẩm ................................. 49
3.9. Kết quả hiệu giá vắc xin sởi BTP sản xuất từ năm 2009 ÷ 2012 tại Polyvac 50
KẾT LUẬN ...............................................................................................................53
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................55

ii


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Học viên

Lê Tuấn Anh



iv


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

BẢNG KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Bulk

Vắc xin Sởi bán thành phẩm

BS

Bovine serum – Huyết thanh bò

BSA

Bovin Serum Albumin - Albumin huyết thanh bò

CPE

Cytopathic Effect - Hiệu quả hủy hoại tế bào

CGI

Cell Growth Index - Chỉ số phát triển tế bào

EK


POLYVAC

Trung tâm nghiên cứu sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế

SCD

Soybean Casein Digest – Môi trƣờng Casein đậu tƣơng

TCMR

Tiêm chủng mở rộng

TGC

Thioglycholate – Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn

VX

Vắc xin

TB

Tế bào

TBĐV

Tế bào động vật

WFI

sởi bán thành phẩm nhóm I .......................................................................................40
Bảng 3.3. Kết quả pH môi trƣờng nuôi cấy virus và hiệu giá vắc xin ......................42
sởi bán thành phẩm nhóm II ......................................................................................42
Bảng 3.4. Kết quả pH môi trƣờng nuôi cấy virus và hiệu giá vắc xin ......................43
sởi bán thành phẩm nhóm III ....................................................................................43
Bảng 3.5. Kết quả pH của môi trƣờng nuôi cấy virus và hiệu giá của vắc xin .........45
sởi bán thành phẩm nhóm IV ....................................................................................45
Bảng 3.6. Kết quả pH môi trƣờng nuôi cấy virus và hiệu giá của vắc xin ...............46
sởi bán thành phẩm nhóm V .....................................................................................46
Bảng 3.7: Kết quả pH môi trƣờng và hiệu giá tƣơng ứng của 3 lô vắc ....................47
xin sởi bán thành phẩm từ nhóm I đến nhóm V ........................................................47
Bảng 3.8. Kết quả kiểm định chất lƣợng của 3 lô vắc xin sởi bán thành phẩm ........49
từ nhóm I đến nhóm V ..............................................................................................49
Bảng 3.9. Kết qủa tính toán hiệu suất sản xuất vắc xin sởi thành phẩm từ hiệu giá
các lô BTP nghiên cứu và sản xuất thƣờng quy ........................................................52

vi


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Nguồn gốc chủng AIK-C .............................................................................3
Hình 1.2 Cấu tạo của hạt virus sởi ..............................................................................7
Hình 1.3. Ảnh hƣởng của pH lên hiệu giá virus sởi chủng Edmonston .....................8
Hình 1.4: Hiệu giá của virus sởi ở các giá trị pH khác nhau ......................................9
Hình 1.5 Sự nhân lên của virus sởi ........................................................................... 11
Hình 1.6 Các virus sởi nẩy chồi qua màng sinh chất của TB phôi gà sau 72 giờ gây

nếu tiếp xúc với bệnh nhân sởi. Bệnh có biểu hiện là sốt, dấu hiệu viêm đƣờng hô
hấp trên và điển hình là phát ban [2,3].
Bệnh sởi là nguyên nhân thứ năm gây tử vong cho trẻ dƣới 5 tuổi và đứng đầu
trong số các bệnh truyền nhiễm. Trƣớc khi có vắc xin sởi, bệnh thƣờng gây ra các
vụ bùng nổ dịch lớn trên khắp thế giới gây tử vong và để lại những biến chứng
nghiêm trọng. Những biến chứng do sởi chủ yếu là ỉa chảy, viêm phổi, viêm tai giữa
nặng hơn có thể viêm não để lại các di chứng về thần kinh[2,3,6]. Biện pháp hiệu
quả nhất để phòng ngừa và tiến tới thanh toán bệnh sởi là tiêm vắc xin sởi. Vắc xin
sởi là một trong những vắc xin có tỷ lệ đáp ứng miễn dịch cao, khả năng miễn dịch
kéo dài, hiệu lực bảo vệ của vắc xin sởi đạt trên 90% [7,8].
Từ năm 2008 trở về trƣớc thì toàn bộ vắc xin sởi sử dụng trong Chƣơng trình
TCMR đều phải nhập khẩu với giá thành cao và không chủ động. Từ thực tế đó,
POLYVAC đã đƣợc Bộ Y tế giao thực hiện dự án sản xuất vắc xin sởi - dự án hợp tác
giữa Chính phủ Nhật Bản và chính phủ Việt Nam với nguồn vốn ODA - nguồn vốn viện
trợ không hoàn lại của chính phủ Nhật Bản. Mục tiêu của dự án là xây dựng một cơ sở
sản xuất vắc xin sởi với công suất 7.5 triệu liều/năm đạt tiêu chuẩn GMP của WHO,
nhận chuyển giao kỹ thuật sản xuất vắc xin sởi tại Việt Nam, nhằm chủ động nguồn
cung cấp vắc xin sởi cho trẻ em Việt Nam và hƣớng tới xuất khẩu, giúp giảm gánh nặng
bệnh tật và giảm chi phí y tế do bệnh sởi gây nên.
Quy trình sản xuất vắc xin sởi đƣợc chuyển giao công nghệ hoàn toàn từ Viện
nghiên cứu Kitasato - Nhật Bản sang cho Polyvac từ nguyên liệu đầu đến vắc xin
Sởi thành phẩm. Trong đó, các giai đoạn sản xuất vắc xin sởi có liên quan mật thiết
với nhau, bên cạnh chủng virus và tế bào thì môi trƣờng nuôi cấy là một trong
những yếu tố đầu tiên quan trọng trong quá trình sản xuất vắc xin sởi.
Năm 2009 Polyvac đã thực hiện thành công việc nhận chuyển giao công nghệ
sản xuất vắc xin sởi từ Viện Kitasato - Nhật Bản và 1,3 triệu liều vắc xin sởi đầu
tiên đã đƣợc đƣa vào chƣơng trình tiêm chủng mở rộng quốc gia để sử dụng cho trẻ

1


o Thực hiện lấy mẫu và kiểm tra hiệu giá vắc xin của các nhóm nghiên cứu
bằng phƣơng pháp PFU (chuẩn độ hiệu giá bằng phƣơng pháp phủ thạch) để
lựa chọn đƣợc dải pH môi trƣờng tối ƣu cho sản xuất vắc xin sởi bán thành
phẩm đạt hiệu giá cao nhất.

2


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH SỞI TRÊN THẾ GIỚI
Sởi và bệnh sốt phát ban đã đƣợc biết đến từ thế kỷ 17. Đến thế kỷ 19 Nil
Filatow (1885) và Clement Dukes (1894) đã mô tả sự khác nhau giữa các loại sốt
phát ban. Năm 1900, Clement Dukes đề xuất gọi sởi là “bệnh phát ban thứ tư”.
Trong 1 thời gian dài, “bệnh phát ban thứ tư” là 1 trong những nguyên nhân tử
vong hàng đầu ở trẻ nhỏ.
Đến năm 1954 Enders và Peebles lần đầu tiên phân lập đƣợc virus sởi đã
đánh dấu một bƣớc tiến trong nghiên cứu bệnh sởi và trên cơ sở đó vắc xin sởi bất
hoạt đã ra đời. Tuy nhiên vắc xin sởi bất hoạt hiệu quả thấp, do vậy các nhà khoa
học đã nghiên cứu sản xuất vắc xin sống giảm độc lực. Sau 1 số lần cấy chuyển trên
tế bào phôi gà đã tạo ra đƣợc chủng virus giảm độc lực Edmonston A và B.

Edmonston

Edmonston A

Schwarz

yếu hoặc không phát triển ở nhiệt độ 39 – 400C, chứng tỏ sự nhạy cảm với nhiệt của
virus sởi. Từ chủng AIK-C, vắc xin sởi đã đƣợc sản xuất và đƣa vào sử dụng rộng
rãi tại Nhật Bản. Đến năm 1963 vắc xin sống giảm độc lực đã đƣợc cấp phép lƣu

3


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

hành tại Mỹ và đã mang lại hiệu quả phòng bệnh cao, giảm đáng kể tỷ lệ mắc bệnh
và tử vong, thậm chí đã thanh toán đƣợc bệnh sởi ở một số nƣớc Châu Mỹ [14,15].
1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC BỆNH SỞI
1.2.1 Phạm vi vật chủ
Ngƣời là vật chủ tự nhiên cho các virus sởi hoang dại. Ngoài ngƣời ra, ngƣời
ta không tìm thấy một động vật nào khác là vật chủ của virus sởi. Tuy nhiên khỉ
cũng có thể nhiễm với virus sởi, thông thƣờng bệnh gây bởi virus trên khỉ nhẹ hơn
gây trên ngƣời. Một số công bố cho thấy, có thể gây nhiễm với các chủng vắc xin
cho loài gậm nhấm mới sinh và còn bú bằng con đƣờng não tủy [3,5].
1.2.2 Phương thức lây truyền
Mầm bệnh sởi là virus sởi, virus sởi lây từ ngƣời sang ngƣời qua đƣờng hô
hấp. Mầm bệnh đƣợc thải ra khỏi ngƣời bệnh (nguồn truyền nhiễm thông qua nói, ho,
hắt hơi, mớm cơm, hôn... ). Sau khi ra khỏi nguồn truyền nhiễm, mầm bệnh tồn tại tạm
thời trong môi trƣờng không khí, bề mặt dụng cụ, mặt đất. Virus sởi có thể tồn tại trong
môi trƣờng không khí ít nhất 34 giờ nhƣng dễ bị tiêu diệt trong môi trƣờng khô, nóng.
Từ môi trƣờng không khí, bề mặt dụng cụ, virus xâm nhập vào cơ thể cảm nhiễm qua
đƣờng mũi họng, cƣ trú và nhân lên ở các tế bào niêm mạc biểu mô đƣờng hô hấp rồi
xâm nhập vào máu và gây bệnh cho cơ thể[2,3,5].
1.2.3 Tính cảm thụ - miễn dịch

o Virus gây bệnh Newcastle (toi gà)
o Virus Sendai



Các virus Pneumo: Virus hợp bào đƣờng hô hấp



Các virus Morbilli:
o Virus sởi
o Virus gây bệnh Carre ở chó
o Virus dịch hạch bò
Ba virus thuộc chi Morbillivirus có mối liên quan chặt chẽ với nhau nhƣ

giống nhau về hình thái, kích thƣớc, đều là các týp đơn, gây bệnh giống nhau trên
vật chủ mẫn cảm và đặc biệt là đều gây hiệu lực hủy hoại trên nuôi cấy tế bào tạo
các hợp bào đa nhân, các tiểu thể trong bào tƣơng và trong nhân. Tuy bản chất có
nhiều tính chung nhƣng mỗi loài virus đó chỉ có 1 vật chủ riêng biệt. Tác dụng bảo
vệ chéo giữa 3 loại virus nhóm Morbillivirus cho thấy:
o Virus sởi không nhậy cảm và nhân lên ở bò.
o Các virus gây bệnh Carre, dịch hạch bò không nhậy cảm và nhân lên ở ngƣời.
Kết quả nghiên cứu về di truyền học cho thấy các chủng dòng Morbillivirus
có sự khác nhau về biểu vị (epitope) ở các thành phần kháng nguyên ngƣng kết
hồng cầu (HA) và ở Protein khuôn mẫu M.
1.3.2 Hình thái học
Những kết quả nghiên cứu dùng siêu ly tâm và kính hiển vi điện tử cho thấy
các virion sởi là những hạt có vỏ bọc, hình cầu, với lõi nucleocapsid xoắn cuộn hoặc
là hình sợi chỉ. Đƣờng kính của hạt có nhiều kích cỡ, thay đổi từ 120-250 nm, tính
trung bình là 150 nm. Quan sát hình thái học hạt virus sởi dƣới kính hiển vi điện tử


180 – 200K

o Protein P (Polymeraza):

70K

o Protein H (Hemagglutinin):

70 – 80K

o Protein F (Fusion):

56 – 60K

o Protein M (Matrix):

36 – 37K

o Protein NP (Nucleoprotein):

60K

Các Protein virus có chức năng riêng biệt, trong đó 3 protein tạo phức hợp
với ARN virus (L, NP và P) và 3 protein còn lại tham gia vào kết cấu của vỏ bọc
(H, M và F). Protein trội nhất là NP, có trọng lƣợng phân tử 60K và là 1 protein gắn
photphat, có chức năng bảo vệ ARN virus.
o Thành phần protein L chỉ chiếm hàm lƣợng giới hạn.
o Protein P (Polymeraza) có độ nhạy cao với các enzyme ly giải protein
o Cả hai protein L và P đều tham gia vào thành phần các phức hợp phiên mã.

7


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

khoảng pH môi trƣờng từ 7.0 – 8.0. Hiệu giá virus sởi giảm nhanh ở pH dƣới 7.0 và
trên 8.0 [20].

Hình 1.3. Ảnh hƣởng của pH lên hiệu giá virus sởi chủng Edmonston

Virus sởi có sức đề kháng yếu, nhậy cảm với nhiệt độ, ở 4oC trong 2 tuần có thể
còn khả năng gây nhiễm, ở 56oC nó bị phá hủy trong vòng 30 phút. Còn ở 37oC chỉ
trong vòng 2 giờ mất 1/2 hoạt tính gây nhiễm. Nó bị bất hoạt bởi ánh sáng, siêu âm,
cồn, formalin, tia cực tím. Sức đề kháng của virus sởi sẽ cao hơn nếu đƣợc bảo quản
ở dạng đông khô và có thêm các chất bảo quản nhƣ S.Glutamate, D.Sorbitol,
Lactose, Gelatine [12, 26].
Một số tác giả nghiên cứu hiệu giá tồn dƣ của virus sởi ở các dải pH khác nhau
bằng cách trộn 1 thể tích virus sởi với 2 thể tích dịch đệm để lạnh với giá trị pH
khác nhau và ủ trong bể đựng nƣớc đá trong 3 giờ. Số lƣợng virus đƣợc xác định
thông qua việc đếm số đám hoại tử. Kết quả cho thấy virus sởi ổn định nhất ở điều
kiện pH môi trƣờng là 7.6 và virus sởi sẽ bị bất hoạt nhanh chóng ở cả môi trƣờng
pH axit và pH kiềm [12, 26].

8


LÊ TUẤN ANH 2013B


Kháng nguyên của virus sởi
Virus sởi chỉ có 1 typ kháng nguyên, phân tích đặc tính di truyền của virus sởi
lƣu hành ở các vùng khác nhau cho thấy sự khác biệt về trình tự các nucleotide thì ở
Việt Nam chỉ khác nhau

Hình 1.5 Sự nhân lên của virus sởi

Hấp phụ và thâm nhập:
Một trong những điều quan trọng nhất là khả năng nhận biết các receptor đặc
hiệu trên bề mặt của tế bào đích, điều đó cho phép virus sởi gắn vào màng tế bào và
phân hủy bởi enzyme. Sau đó nucleocapsit thâm nhập vào bên trong bào tƣơng.
Phiên mã ARN của virus:

11


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

ARN của virus sởi là một sợi đơn âm (-) Genom của nó là một phân tử liên tục,
là khuôn mẫu để tổng hợp các ARN thông tin (ARNm). Virus có một polymeraza
đặc hiệu gọi là transcriptaza. Nếu thiếu polymeraza này thì ARN của virus không
còn có khả năng gây nhiễm. Sợi ARN (-) làm khuôn mẫu để tổng hợp ARNm với 3
tiểu đơn vị, từ đó tổng hợp các protein của virus. ARNm mang đoạn poly (A) có 70
– 140 nucleotid ở đầu 3’. ARN genom không có đoạn poly (A). Bằng phƣơng pháp
Clon gen di truyền, một số tác giả nghiên cứu thấy đoạn đầu cùng 3’ là các gen NP,
P và M. ARN(-) của tiểu đơn vị 52s là khuôn để tổng hợp ARN(+). Chính sợi
ARN(+) này đến lƣợt làm khuôn để tổng hợp sợi ARN(-) và chính ARN(-) đƣợc
bọc trong vỏ capsit.
Dịch mã (tổng hợp protein của virus):
Protein đƣợc tổng hợp trƣớc tiên là Nucleocapsit (NP). Sau đó lần lƣợt 6 chuỗi
polypeptid đƣợc tổng hợp trong bào tƣơng. Các protein H và F xuất hiện ở vùng
quanh nhân, sau đó di chuyển ra phía ngoài màng và tập hợp trong bào tƣơng.

ngày thứ 12. Trong thời gian đó tế bào chủ dần dần thoái hoá. Số lƣợng virus giải
phóng ra ngoài chỉ bằng 1/10 - 1/100 số lƣợng virus đƣợc tổng hợp và số còn lại
đều dính chặt vào tế bào chủ.
Gây nhiễm virus sởi trên tế bào phôi gà đƣợc sử dụng để sản xuất vắc xin sởi
sống, giảm độc lực. Khả năng nhân lên của virus sởi có thể đƣợc xác định bằng kỹ
thuật tạo đám hoại tử trên tế bào nuôi.

Hình 1.6 Các virus sởi nẩy chồi qua màng Hình 1.7 Các virion virus sởi sau khi thoát
sinh chất của TB phôi gà sau 72 giờ gây ra khỏi màng TB phôi gà nằm tập trung sát
màng TB với đa dạng về kích thƣớc.

nhiễm

1.3.6.3 Bản chất của hiện tượng hủy hoại tế bào
Sự nhân lên của virus sởi không liên quan đến sự giảm sút quá trình trao đổi
chất của tế bào chủ. Trong tất cả các trƣờng hợp không có sự phá vỡ một cách nhanh
chóng tế bào, ngƣợc lại tế bào vẫn còn khả năng trao đổi chất trong thời gian dài. Tuy
nhiên sự tổng hợp các protein capsit xâm nhập chậm chạp và đôi khi làm ngừng quá
trình tổng hợp ARN, AND và protein của tế bào chủ. Tác động hủy hoại có hai dạng:
o Dạng 1:
Tƣơng đối điển hình, do hiện tƣợng liên hợp của tế bào trong quá trình nhân
lên của virus sởi đƣợc miêu tả bởi Enders và Peebles. Virus gây ra sự xáo trộn
chức năng phân chia của tế bào dẫn đến sự hình thành các tế bào khổng lồ đa nhân

13


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

nhân lên của virus. Vì thế cần đặc biệt lƣu ý khi pha chế môi trƣờng nuôi cấy, phải

14


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

đảm bảo đầy đủ về thành phần và chính xác về hàm lƣợng các chất dinh dƣỡng (đa
lƣợng, vi lƣợng, nguồn Carbon), chất điều hòa sinh trƣởng… Một yếu tố rất quan
trọng đó là pH của môi trƣờng nuôi cấy, pH không chỉ ảnh hƣởng đến khả năng hòa
tan các chất khoáng mà còn ảnh hƣởng đến hoạt tính của các chất điều hòa sinh
trƣởng, các chất điều hòa sinh trƣởng sẽ bị mất hoạt tính nếu pH quá acid hoặc quá
kiềm [33].
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy tế bào đƣợc thiết lập gần giống nhƣ thành
phần dịch lỏng trong cơ thể sống bao gồm muối vô cơ, carbonhydrate, vitamin, axit
amin, các tiền chất biến dƣỡng, nhân tố tăng trƣởng, hormone, các yếu tố vi lƣợng
và đặc biệt quan trọng là huyết thanh. Các chất dinh dƣỡng thiết yếu giúp tế bào
phân chia nhƣ amino acid, acid béo, đƣờng, các ion, các vitamin, cofactor và các
phân tử cần thiết để duy trì môi trƣờng hóa học cho các tế bào. Có hai loại môi
trƣờng để nuôi cấy tế bào:
o Nhóm môi trường tự nhiên là những môi trƣờng chứa các hợp chất tự nhiên
nhƣ Lactabumin hydrolysat, huyết thanh, tinh chế mô phôi (gà, ngƣời…)
o Nhóm môi trường tổng hợp là những môi trƣờng đƣợc chế từ các chất hóa học
nhƣ các axit amin, các vitamin, các muối khoáng…
Việc phát hiện ra khả năng nuôi cấy TBĐV ở mức in vitro cũng dẫn tới những
nỗ lực tìm kiếm các môi trƣờng nhân tạo với các thành phần phù hợp để nuôi cấy
chúng. Cho đến nay, các môi trƣờng nhân tạo này đã đáp ứng đƣợc việc nuôi cấy
TBĐV và đảm bảo cho sự phát triển của rất nhiều loại tế bào khác nhau. Từ loại

chuyển đòi hỏi cao vế Glutamine.
Trong môi trƣờng nuôi cấy lơ lửng và các công nghệ nuôi cấy đặc biệt khác
có thể đòi hỏi thêm các axit amin khác chẳng hạn nhƣ Serin cho việc phát triển tế
bào đơn lẻ. Vì vậy các axit amin khác ngoài 10 axit amin không thể thay thế thƣờng
đƣợc thêm vào hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy tế bào. Vì các tế bào chỉ sử dụng
các đồng phân L của các axit amin, các đồng phân D có thể bị hạn chế, nhìn chung
trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào chỉ chứa các L axit amin. Những axit amin mà tế
bào không tự tổng hợp đƣợc là nhu cầu tối cần thiết cho sự phát triển của tế bào vì
nó là nguồn dƣ trữ tạo ADN và protein trong tế bào giúp tế bào sống và phát triển
tốt sau khi nuôi cấy. Hiện nay, một số nghiên cứu cho thấy rằng Glutamate đƣợc sử
dụng trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào nhƣ nguồn cung cấp năng lƣợng và carbon.
Vitamin:
Khi tăng thành phần môi trƣờng lên (mục đích để giảm hàm lƣợng huyết
thanh xuống) thì danh sách các Vitamin môi trƣờng cũng tăng theo. Khi mật độ tế
bào trong môi trƣờng thấp (trong giai đoạn nhân dòng tế bào) thì cần phải tăng
lƣợng Vitamin cho dù trong môi trƣờng đã có sự hiện diện của huyết thanh. Sự hạn
chế về Vitamin có ảnh hƣởng rõ rệt trên sức sống và tốc độ tăng trƣởng của tế bào
hơn là trên mật độ tế bào.

16


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Muối:
Các loại muối chủ yếu là thành phần chính tạo ra áp suất của môi trƣờng.
Trong huyền phù tế bào, lƣợng thƣờng đƣợc giẩm xuống để hạn chế sự kết cụm
của tế bào. Nồng độ đƣợc xác định bằng nồng độ CO2 ở dạng khí.


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

yếu tố vi lƣợng nhƣ Mn, Mo, Ni, Se, Si, Sn, V, Cd, các yếu tố sinh trƣởng và
hormone sinh trƣởng nhƣ insulin, transferring, hydrocortisol... [10,13].
Đƣợc cung cấp đầy đủ các yếu tố cần thiết kể trên từ môi trƣờng, tế bào nuôi
cấy có đủ khả năng tự tổng hợp các tiền chất của các axit nucleic để thực hiện quá
trình sinh trƣởng và phân chia của mình ở mức in vitro, duy trì đƣợc sự phát triển
ổn định trong quá trình nuôi cấy.
Điều kiện nhiệt độ và điều kiện môi trƣờng khí quyển trong khu vực nuôi cấy
rất cần thiết cho quá trình nuôi cấy TBĐV in vitro. Nhiều nghiên cứu cho thấy nhiệt
độ thích hợp nhất cho các tế bào nuôi cấy phát triển là 36.5-370C. Đây là nhiệt độ
cơ thể bình thƣờng của nhiều loài động vật. Sau khi đƣợc tách khỏi cơ thể, sống
trong nuôi cấy in vitro, các tế bào cũng yêu cầu điều kiện nhiệt độ tƣơng thích nhƣ
trong cơ thể sống để có thể phát triển và thực hiện các chức năng.
Về điều kiện môi trƣờng khí quyển trong khu vực nuôi cấy ví dụ nhƣ trong
tủ ấm thì nồng độ Oxygen và khí CO2 đƣợc xem là có ảnh hƣởng lớn nhất đến khả
năng phát triển của tế bào nuôi cấy.
Các loại tế bào hay mô khác nhau có yêu cầu khác nhau về nồng độ oxygen
trong môi trƣờng. Trong khi hầu hết các tế bào nuôi cấy in vitro chỉ cần có nồng độ
oxygen thấp 4] thì một số mô tế bào nhƣ phôi ở giai đoạn sớm lại yêu cầu thành
phần oxygen lên tới 95% trong khí quyển nuôi cấy chúng 35]. Sự khác biệt này chủ
yếu do các tế bào nuôi cấy dàn trải trên bề mặt nuôi cấy nên có thể dễ dàng tiếp xúc
với oxygen khuyếch tán và hoà tan trong môi trƣờng, ngƣợc lại các tế bào ở sâu
trong mô nuôi cấy không đƣợc tiếp xúc trực tiếp với môi trƣờng nên lƣợng oxygen
hoà tan cần cao hơn nhiều lần để thẩm thấu với hàm lƣợng cao hơn và tế bào nội mô
có thể hấp thụ đƣợc. Ngoài ra, trong môi trƣờng nuôi cấy không có huyết thanh thì vai
trò của oxygen hoà tan rất quan trọng, do đó nồng độ oxygen trong môi trƣờng thiết bị