Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

GVHD: 1. PGS.TS. Vũ Đình Hoàng
2. PGS.TS. Phạm Gia Điền

MỤC LỤC
MỤC LỤC ........................................................................................................ 1
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ......................... 5
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ ............................................................ 6
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... 8
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. 9
PHẦN 1: TỔNG QUAN ................................................................................ 11
1.1. Khái quát về họ rau răm (Polygonaceae). ................................................ 11
1.1.1. Họ rau răm (Polygonaceae). ................................................................ 11
1.1.2. Phân loại. .............................................................................................. 11
1.2.

Giới thiệu về chi Đại hoàng - Rheum L. ............................................... 12

1.2.1. Đặc điểm hình thái. ............................................................................... 12
1.2.2. Phân bố ................................................................................................. 12
1.3.

Giới thiệu về cây Đại hoàng – Rheum sp.............................................. 13

1.3.1. Đặc điểm thực vật. ................................................................................ 13
1.3.2. Phân bố và thu hái. ............................................................................... 15
1.3.3. Thành phần hóa học. ............................................................................. 16
1.3.3.1. Anthraquinon.......................................................................... 16
1.3.3.2. Anthrone ................................................................................. 18
1.3.3.3. Stilben .................................................................................... 19

1.4.2. Các hợp chất stilben.............................................................................. 26
1.4.2.1. Khái niệm chung. ................................................................... 26
1.4.2.2. Hoạt tính sinh học của stilben. ............................................... 27
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 28
2.1. Vật liệu nghiên cứu. ................................................................................. 28
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu. .......................................................................... 28
2.1.2. Dụng cụ, hóa chất và các thiết bị dùng trong nghiên cứu. ................... 28
2.1.2.1. Dụng cụ và hóa chất. .............................................................. 28
2.1.2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu. ....................................... 29
2.2.
2.2.1.

Phƣơng pháp nghiên cứu. ..................................................................... 29
Phương pháp nghiên cứu hóa học. .................................................. 30
2.2.1.1. Phƣơng pháp chiết xuất . ........................................................ 30
2.2.1.2. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC). ................................... 31
2.2.1.3. Phƣơng pháp sắc ký cột (CC). ............................................... 32
2.2.1.4.Phƣơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc. . 33

2.2.2.

Phương pháp thử hoạt hoạt tính kháng khuẩn. ............................... 35

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM ..................................................................... 37
3.1. Xử lý mẫu thực nghiệm và nghiên cứu điều kiện chiết chiết xuất
anthraquinon từ mẫu thực nghiệm. ................................................................. 37
3.1.1. Xử lý mẫu thực nghiệm. ........................................................................ 37
HVTH: Bá Thị Dƣơng

2


Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được. ................................ 48
3.4.2.1. Dữ liệu phổ của hợp chất DH01. ............................................ 48
3.4.2.2. Dữ liệu phổ của hợp chất DH02. ............................................ 48
3.4.2.3 Dữ liệu phổ của hợp chất DH03. ............................................ 48
3.4.2.4 Dữ liệu phổ của hợp chất DH04. ............................................ 49

3.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn. ........................................................ 49
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 50
4.1. Kết quả nghiên cứu khảo sát điều kiện chiết anthraquinon từ mẫu thực
nghiệm. ............................................................................................................ 50
4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết. ........ 50
4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất chiết. ...... 51
4.1.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi đến hàm lượng
anthraquinon. .................................................................................................. 52
4.2.

Xác định cấu trúc của các hợp chất DH01, DH02, DH03, DH04. ....... 54

HVTH: Bá Thị Dƣơng

3


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

GVHD: 1. PGS.TS. Vũ Đình Hoàng
2. PGS.TS. Phạm Gia Điền

4.2.1.

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 75
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 82

HVTH: Bá Thị Dƣơng

4


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

GVHD: 1. PGS.TS. Vũ Đình Hoàng
2. PGS.TS. Phạm Gia Điền

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

R.: Rheum.
TCN: Trƣớc Công Nguyên.
IR: phổ hồng ngoại
MS: phổ khối lƣợng
1

H-NMR: phổ cộng hƣởng từ proton

13

C-NMR: phổ cộng hƣởng từ cacbon

2D-NMR: phổ cộng hƣởng từ hai chiều
DEPT: Distortionless enhancement by polarization transfer
TLC (Thin layer chromatography): Sắc ký lớp mỏng

Hình 1.2: Rheum palmatum L.
15
Hình 1.3. Rheum palmatum lai tanguticum
15
Hình 1.4: Rheum tanguticum Maxim. ex Balf
15
Hình 1.5: Rheum officinale Baill.
15
Hình 1.6: Cấu trúc hóa học anthraquinon và các dẫn xuất đã đƣợc 18
phân lập từ cây Đại hoàng
Hình 1.7 : Cấu trúc hóa học các anthrone đã đƣợc phân lập từ cây 19
Đại hoàng
Hình 1.8: Các hợp chất stilben đã phân lập đƣợc từ cây Đại hoàng
21
Hình 1.9: Các hợp chất Acylglucosid đã phân lập đƣợc từ cây Đại 20
hoàng
Hình 1.10: Các hợp chất Flavonoid đã phân lập đƣợc từ cây Đại 21
hoàng
Hình 1.11: Khung anthraquinon – 9,10-anthracendion.
24
Hình 1.12. Khung stilben dạng cis-stilben và dạng trans-stilben
26
Hình 2.1: Cây đại hoàng và củ đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim. 28
Ex Balf)
Hình 2.2: Cách tính giá trị Rf.
31
Hình 2.3: Các bƣớc tiến hành sắc ký bản mỏng.
32
Hình 2.4: Các bƣớc tiến hành sắc ký cột (CC).
33

Hình 4.14: Phổ DEPT-135 của hợp chất DH03.
Hình 4.15: Công thức của hợp chất emodin (DH03).
Hình 4.16: Phổ 1H-NMR của hợp chất DH04
Hình 4.17: Phổ 13C-NMR của hợp chất DH04.
Hình 4.18: Phổ DEPT-135 của hợp chất DH04
Hình 4.19: Công thức của hợp chất rhapontigenin (DH04).
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ xử lý bột Đại hoàng.
Sơ đồ 3.2: Xử lý cao chiết metanol
Sơ đồ 3.3: Sơ đồ phân lập cặn diclometan.

HVTH: Bá Thị Dƣơng

7

54
55
56
57
58
59
59
61
62
63
63
65
66
67
67
69

Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của dung môi chiết đến 53
hàm lƣợng anthraquinon.
Bảng 4.4: Dữ liệu phổ 1H-NMR và

13

C-NMR của DH01 so sánh 56

với chrysophanol.
Bảng 4.5: Dữ liệu phổ 1H-NMR và

13

C-NMR của DH02 so sánh 60

13

C-NMR của DH03 so sánh 64

với physcion.
Bảng 4.6: Dữ liệu phổ 1H-NMR và
với emodin.
Bảng 4.7: Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của DH04 so sánh 68
với rhapontigenin.
Bảng 4.8. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết sau 70
24 giờ
Bảng 4.9. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất 71
phân lập đƣợc sau 24 giờ đo độ đục (OD600nm).
Bảng 4.10. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của các chất phân 72
lập đƣợc sau 48 giờ đo độ đục (OD600nm).

(Rheum tanguticum Maxim. Ex Balf) chƣa hệ thống và đầy đủ. Chính vì vậy,
cần có các nghiên cứu hệ thống lại về các thành phần hóa học đã phân lập
đƣợc cũng nhƣ hoạt tính sinh học của cây Đại hoàng (Rheum tanguticum
Maxim. Ex Balf), thuộc chi Rheum L., họ Rau Răm (Polygonaceae).
Dựa trên sự tổng hợp đó, chúng tôi quyết chọn đề tài: “Nghiên cứu
thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các chất phân lập được từ
cây Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim. Ex Balf)”, thực hiện đề tài này
HVTH: Bá Thị Dƣơng

9


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

GVHD: 1. PGS.TS. Vũ Đình Hoàng
2. PGS.TS. Phạm Gia Điền

nhằm góp phần vào việc tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học, hoạt tính kháng khuẩn, nâng cao giá trị sử dụng của nguyên liệu Đại
hoàng vốn đã rất quen thuộc.
 Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Nghiên cứu khảo sát điều kiện chiết anthraquinon từ cây Đại hoàng
(Rheum tanguticum Maxim. Ex Balf)
- Phân lập các chất tinh khiết từ cây Đại hoàng (Rheum tanguticum
Maxim. Ex Balf).
- Xác định cấu trúc các chất phân lập đƣợc.
- Thử hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết và các chất phân lập đƣợc.
 Đối tƣợng nghiên cứu:
Rễ của cây Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim.Ex Balf) vẫn đƣợc
sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền Việt Nam.

và sự có mặt của bẹ chìa các bao (vỏ, mang bọc) phát triển từ các lá kèm ở
gốc lá đính kèm. Một số bẹ chìa có các tua lông. Phân họ này bao gồm
khoảng 330 chi và 800 loài.
 Phân họ Eriogonoideae với khoảng 330 loài, chỉ tìm thấy tại khu vực
tân thế giới.
Nhƣ vậy ở Việt Nam chỉ có phân họ Polygonoideae.

HVTH: Bá Thị Dƣơng

11


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

GVHD: 1. PGS.TS. Vũ Đình Hoàng
2. PGS.TS. Phạm Gia Điền

1.2. Giới thiệu về chi Đại hoàng - Rheum L.
1.2.1. Đặc điểm hình thái.
Chi Đại hoàng gồm các loài thân thảo sống lâu năm, rễ dài thƣờng
phình to dạng củ, thân thƣờng rỗng, có rãnh, nhẵn hoặc có lông, lá đơn, có
mép lá dạng lƣợn sóng, răng cƣa hay xẻ thùy chân vịt. Những lá phía dƣới
thƣa, dày, hoặc xếp hình hoa thị, lớn hơn những lá phía trên, bẹ lá thƣờng lớn;
dạng màng mép thƣờng nguyên. Hoa mọc thành chùm đơn hoặc chùm kép,
thƣờng hình chùy, hình cầu hoặc hình bông, cuống hoa có đốt, hoa lƣỡng tính
hoặc đơn tính cùng gốc. Bao hoa sống dai, lá đài 6. Nhị thƣờng 9 (6 + 3),
hiếm khi 7 hoặc 8. Nhụy ngắn, 3 ô nằm ngang; đầu nhụy phình to, mép uốn
ngƣợc xuống. Quả bế ba cạnh, có cánh [29].

Hình 1.1: Một số loài trong chi Đại hoàng

nhanh chóng, nên Rheum sp. bao gồm một số loài thuộc chi Rheum:
 Theo dƣợc điển Trung Quốc và WHO, gồm 3 loài R. palmatum L.,
R. tanguticum Max., và R. officinale Baill [43].
 Theo dƣợc điển Nhật Bản, gồm Rheum tangutium Max., R.
coreanum Nakai, R. palmatum L., và R. officinale Baill., hoặc các loài lai giữa
chúng [39].
 Theo dƣợc điển Ấn độ, gồm R. emodi (đại hoàng Ấn Độ) và R.
webbianum (đại hoàng Hymalaya)[24].
 Ngoài ra còn có R. undulatum L.và R. rhaponticum [17], [33].
1.3.1. Đặc điểm thực vật.
Đại hoàng là cây thảo mộc sống lâu năm nhờ thân rễ to, khỏe. Thân có
rãnh, giữa rỗng, có lông trắng hoặc có gai ở các mấu và phía trên. Lá mọc
thành cụm từ thân rễ, có kích thƣớc lớn, có cuống dài, có bẹ chìa, phiến lá
hình tim rộng 30-40 cm, phân thành 5 đến 7 thùy chính, các thùy này cũng có
thể phân lần thứ hai hoặc đôi khi lần thứ ba. Gân lá nổi mặt dƣới, thƣờng màu
HVTH: Bá Thị Dƣơng

13


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

GVHD: 1. PGS.TS. Vũ Đình Hoàng
2. PGS.TS. Phạm Gia Điền

đỏ nhạt. Từ năm thứ 3-4 thì xuất hiện 1 thân mọc lên cao 1-2 m mang một số
lá nhỏ. Phần ngọn thân là chùm hoa hình chùy mang nhiều hoa. Bao hoa gồm
6 bộ phận màu trắng, xanh nhạt, hoặc đỏ nhạt, 9 nhị. Quả đóng 3 góc. Ra hoa
tháng 5-6, quả tháng 9-10 [1].
Đại hoàng bao gồm rất nhiều cây khác nhau, Đại hoàng mới di thực vào

2. PGS.TS. Phạm Gia Điền

sinh ra tƣơng đối nhỏ. Hoa tự lớn hình viên chùy sinh ở đỉnh có màu xanh nhạt
hoặc vàng trắng. Quả ốm, dài, tròn, hình 3 cạnh.

Hình 1.2: Rheum palmatum L. Hình 1.3. Rheum palmatum lai tanguticum

Hình 1.4: Rheum tanguticum Maxim. Ex Balf. Hình 1.5: Rheum officinale Baill.

1.3.2. Phân bố và thu hái.
Đại hoàng là cây ƣa mọc ở khí hậu mát, ẩm, độ cao trên 1000 m ở
nhiều tỉnh của Trung Quốc, nhƣ Cam Túc, Thanh Hải, Tứ Xuyên, Tây

HVTH: Bá Thị Dƣơng

15


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

GVHD: 1. PGS.TS. Vũ Đình Hoàng
2. PGS.TS. Phạm Gia Điền

Tạng…. Ngoài ra còn đƣợc trồng ở Hàn Quốc, Ấn Độ, Pakistan, và các nƣớc
châu Âu [32].
Ngƣời ta thu hoạch thân rễ của nhữmg cây đã mọc trên 3-4 năm (ở
những vùng có cây mọc hoang thì có thể 6-10 năm) vào mùa thu, khi cây bắt
đầu lụi. Thân rễ tƣơi to có thể có chiều dài 20-30 cm, rộng 8-10 cm, có nhiều
nhánh rễ hình trụ đƣờng kính 2-3cm. Sau khi đào về thì cắt bỏ rễ, còn thân rễ
đem gọt bỏ vỏ ngoài, bổ nhỏ (dọc hoặc ngang) rồi phơi hoặc sấy khô. Cất giữ

1

Chrysophanol

Nguồn
thực vật
a,b,c,d,e

2

Physcion

a,b,c,d,e

3

Emodin

a,b,c,d,e

4

Aloe-emodin

a,b,c,e

5

Rhein


a,b,c,d,e

11

Chrysophanol-8-O-β-D-(6’-O-galloyl)-glucopyranoside

e

12

Chrysophanol-8-O-β-D-(6’-O-acetyl)-glucopyranoside

d

13

Emodin-1-O-β-D-glucopyranoside

c,e

14

Emodin-6-O-β-D-glucopyranoside

a

15

Emodin-8-O-β-D-glucopyranoside


a

21

6-methyl-rhein

d

22

Rhein-8-O-β-D-glucopyranoside

a

23

Physcion-1-O-β-D-glucopyranoside

d

24

Physcion-8-O-β-D-glucopyranoside

a,c,d,e

HVTH: Bá Thị Dƣơng

17


Hình 1.6: Cấu trúc hóa học anthraquinon và các dẫn xuất đã
đƣợc phân lập từ cây Đại hoàng
1.3.3.2. Anthrone
Anthrone là các hợp chất có ba vòng thơm xeton, đƣợc tạo thành bằng
cách oxy hóa anthraquinon. Cho đến nay có khoảng 26 anthrone đã đƣợc

HVTH: Bá Thị Dƣơng

18


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

GVHD: 1. PGS.TS. Vũ Đình Hoàng
2. PGS.TS. Phạm Gia Điền

phân lập từ R. palmatum L. và R. emodi (Hình 1.7) nhƣ rheinoside A-D (3437), sennoside A-F (38-43), rendin A-C (47-49)...[50].

Hình 1.7 : Cấu trúc hóa học các anthrone đã đƣợc phân lập từ cây Đại hoàng
1.3.3.3. Stilben
Stilben đƣợc coi là thành phần quan trọng trong phƣơng pháp phân loại
sinh học. Đại hoàng chất lƣợng cao và chất lƣợng thấp có thể phân biệt căn cứ
vào sự hiện diện hay vắng mặt của stilben glucoside, rhaponticin - đƣợc tin là
chỉ có ở Đại hoàng chất lƣợng thấp [27].
Các stilben đã đƣợc phân lập từ cây Đại hoàng: rhapontigenin (54),
piceatannol (55), desoxyrhapontigenin (56), resveratrol (57), isorhapontin
(63),…(Hình1.8)[19].

HVTH: Bá Thị Dƣơng



đƣợc:

(+)-catechin

(84),

(−)epicatechin-3-O-gallate

(85),

(−)epigallocatechin-3-O-gallate (86), gallic acid (87), rutin (88),… [50].

Hình 1.10: Các hợp chất Flavonoid đã phân lập đƣợc từ cây Đại hoàng

HVTH: Bá Thị Dƣơng

21


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

GVHD: 1. PGS.TS. Vũ Đình Hoàng
2. PGS.TS. Phạm Gia Điền

1.3.3.6. Các hợp chất khác.
Ngoài các thành phần kể trên, trong cây Đại hoàng còn có dầu dễ bay
hơi (chứa 108 hợp chất với 27,3% là tecpen), tinh dầu với mùi đặc trƣng, một
số pyrone, các loại axit hữu cơ, anthocianin và dẫn xuất của chúng, các
vitamin (B, C, D), một lƣợng lớn các hợp chất polyphenol và nhiều loại hợp


rất giống nhau, physcion và chrysophanol cho thấy không có ảnh hƣởng đáng
kể đến ức chế sự phát triển tế bào ung thƣ [23], [50].
1.3.4.3. Tác dụng kháng viêm và giảm đau
Khả năng chống viêm của dịch chiết metanol từ thân và rễ Đại hoàng
(500 mg/kg) đƣợc đánh giá bằng cách dùng carrageenan gây ra bệnh phù
chân. Mức độ ức chế phù nề tăng theo thời gian, đạt tối đa sau 5h và hoạt
động ức chế này đƣợc so sánh với thuốc Ibuprofen (50 mg/kg thể trọng) [31].
1.3.4.4. Tác dụng bảo vệ gan.
Dịch chiết etanol của Đại hoàng có thể ngăn chặn và điều trị tăng lipid
máu và gan nhiễm mỡ ở thỏ qua giảm lipid máu [48]. Ngoài ra, dịch chiết
etanol và nƣớc của thân và rễ Đại hoàng giúp gan chống lại tổn thƣơng gây
bởi CCl4 và paracetamol ở chuột Witer và chuột bạch tạng [9], [47]. Đại
hoàng đƣợc báo cáo rằng, với liều cao (40 g/kg) có tác dụng đáng kể trên gan
tổn thƣơng bởi CCl4 bằng cách đảo ngƣợc các thông số sinh hóa và thay đổi
mô bệnh học. Tuy nhiên, tác dụng này sẽ bị suy yếu, thậm chí chuyển thành
độc tính nếu gia tăng liều và thời gian sử dụng [47].
1.3.4.5. Điều trị bệnh tiểu đƣờng.
Bệnh thận tiểu đƣờng là một trong những biến chứng chính ở bệnh
nhân tiểu đƣờng. Thử nghiệm lâm sàng cho thấy dịch chiết etanol 70-80% của
Đại hoàng đã có tác động tích cực trong điều trị bệnh [15].
1.4. Một số kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học của anthraquinon
và stilben trong câ Đại hoàng – Rheum sp.
1.4.1. Các hợp chất anthraquinon.
1.4.1.1. Khái niệm chung [1].
Anthraquinon là những hợp chất có màu vàng, vàng cam đến đỏ mà
trong phân tử có chứa 2 vòng thơm đính thêm vào nhân quinon (Hình 1.11).
Những hợp chất này đƣợc tìm thấy chủ yếu trong ngành nấm, địa y, thực vật
HVTH: Bá Thị Dƣơng


xuất phần aglycon, thủy phân bằng acid sau đó chiết bằng eter hoặc
chloroform.
1.4.1.2. Hoạt tính sinh học của anthraquinon.
 Hoạt tính kháng nấm: Rhein, physcion, aloe-emodin và chrysophanol
phân lập từ thân và rễ cây Đại hoàng thể hiện hoạt tính kháng nấm Candida
albicans, Cryptococcus neoformans, Trichophyton mentagrophytes và
Aspergillus fumigatus (MIC 25-250 μg/ml) [8].
Trong một thí nghiệm khác, ba hợp chất anthraquinon khác phân lập đƣợc từ
thân và rễ Đại hoàng (revandchinone -1, 3 và 4) thể hiện hoạt tính kháng nấm

HVTH: Bá Thị Dƣơng

24


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

GVHD: 1. PGS.TS. Vũ Đình Hoàng
2. PGS.TS. Phạm Gia Điền

Aspergillus niger và Rhizopus oryzae, với đƣờng kính vùng ức chế 8 - 9 và 9 11 mm với nồng độ thử tƣơng ứng là 100 và 150 g/ml [11]. Trong một thí
nghiệm khác của Hanwen và Cs, đã chỉ ra rằng physcion là một thành phần
rất quan trọng từ dịch chiết etanol đƣợc chiết từ rễ của cây Đại hoàng (Rheum
officinale Baill.) có tác dụng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm Blumeria
graminis đến quá trình lây bệnh phấn trắng của lúa mì [44], một thí nghiệm
nữa của Hanwen và Cs, physcion chiết từ rễ Đại hoàng (Rheum officinale
Baill.) pha ở dạng lỏng ở nồng 5g/l, trong hầu hết các thử nghiệm hiệu quả đạt
trên 80% ở tỷ lệ 10 – 50 mg a.i/l hiệu quả kiểm soát bệnh nấm phấn trắng
trên dƣa chuột [45].
 Hoạt tính kích thích tăng trƣởng: Các nghiên cứu hiện nay cho