Header Page 1 of 116.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC

ĐẶNG THỊ NGẦN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG
CRYPTOTANSHINON TỪ CÂY ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza
Bunge.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG
DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Hà Nội – 2017

Footer Page 1 of 116.


Header Page 2 of 116.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC

ĐẶNG THỊ NGẦN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG
CRYPTOTANSHINON TỪ CÂY ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza
Bunge.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG

DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM


Đặng Thị Ngần

Footer Page 3 of 116.


Header Page 4 of 116.

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
13

C-NMR

ESI-MS

Carbon (13) Nuclear magnetic resonance
Khối phổ - ion hóa phun mù electron
(Electron Spray Ionisation – Mass Spectrometry)

EtOAc

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

1

Proton nuclear magnetic resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SKĐ

Sắc ký đồ

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

UV

Tử ngoại (Ultraviolet)

Footer Page 4 of 116.


Header Page 5 of 116.

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình

Tên hình

Trang


Hình 2.1

Một số hình ảnh cây đan sâm thu hái tại vườn dược liệu Sa Pa

19

Hình 3.1

Cấu trúc cryptotanshinon

29

Hình 3.2

Sắc ký đồ TLC của cryptotanshinon tinh chế được

30

Hình 3.3

Sắc ký đồ của cryptotanshinon và mẫu trắng

31

Hình 3.4

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ & diện tích của pic
cryptotanshinon

35


Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi định lượng
cryptotanshinon tinh chế được

33

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

34

Bảng 3.7 Kết quả phân tích độ lặp lại của phương pháp

36

Bảng 3.8 Kết quả phân tích độ đúng của phương pháp

37

Bảng 3.9 Kết quả phân tích định lượng cryptotanshinon trong đan sâm ở Sa Pa

37

Footer Page 6 of 116.


Header Page 7 of 116.

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN…………………………………………………….........2


Header Page 8 of 116.

3.1.1. Chiết xuất và tinh chế cryptotanshinon từ đan sâm ............................................. 24
3.1.2. Xác định cấu trúc của cryptotanshinon ................................................................ 27
3.1.3. Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất ........................................................ 29
3.1.4. Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPLC ................................................. 31
3.1.5. Sử dụng phương pháp phân tích HPLC đã khảo sát vào phân tích định tính, định
lượng mẫu đan sâm thu hái ở Sa Pa- Lào Cai ................................................................ 37
3.2. THẢO LUẬN ................................................................................................................... 38

3.2.1. Phân lập và xác định cấu trúc cryptotanshinon .................................................... 38
3.2.2. Xây dựng phương pháp phân tích định lượng cryptotanshinon ........................... 38
3.2.3. Phân tích cryptotanshinon trong mẫu nghiên cứu đan sâm thu hái ở Lào Cai .... 39
KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

Footer Page 8 of 116.


Header Page 9 of 116.

MỞ ĐẦU
Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge. (họ Lamiaceae), là một
cây thuốc có nguồn gốc từ Trung Quốc hiện nay được trồng nhiều và sinh trưởng tốt ở
vùng Tây Bắc nước ta. Dược liệu đan sâm (Radix Salviae miltiorrhiza) là rễ phơi khô
hoặc sấy khô của cây đan sâm, thường được dùng để chữa bệnh tim, kinh nguyệt không
đều, phong thấp, thần kinh suy nhược, mất ngủ… Trong y học cổ truyền Trung Quốc,
Việt Nam, Hàn Quốc, đan sâm là thuốc tăng cường tuần hoàn máu, chữa đau nhói ở


CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐAN SÂM
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) thuộc chi Salvia, họ Bạc hà
(Lamiaceae) còn gọi là đơn sâm, huyết sâm, xích sâm; cây cỏ sống lâu năm, cao 30-80
cm, toàn thân mang lông ngắn màu vàng trắng nhạt. Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính
0,5-1,5 cm, màu đỏ nâu. Thân vuông trên có các gân dọc. Lá kép, mọc đối 3-5 lá chét,
đặc biệt có thể có 7 lá. Lá chét mọc giữa thường lớn hơn cả. Lá kép có cuống dài,
cuống lá chét ngắn có dìa. Lá chét dài 2-7,5 cm, rộng 0,8-5 cm. Mép lá chét có răng
cưa tù. Mặt trên lá chét màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh
tro, cũng có lông nhưng dài hơn. Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá thành nhiều múi
nhỏ. Cụm hoa mọc thành chùm ở đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm. Hoa
mọc vòng, mỗi vòng 3-10 hoa, thường là 5 hoa. Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, 2
môi, môi trên trông nghiêng hình lưỡi liềm, môi dưới xẻ 3 thùy, thùy giữa có răng cưa
tròn. Hai nhị ở môi dưới, bầu có vòi dài lòi ra ở môi trên. Quả nhỏ, dài 3 mm, rộng 1,5
mm [1,14].
Salvia miltiorrhiza Bunge. được phân bố rộng rãi ở miền Bắc Trung Quốc. Nó
cũng có mặt tại Nhật Bản [33]. Cây đan sâm Việt Nam có nguồn gốc Trung Quốc thích
hợp với đất cát ẩm, được trồng bằng rễ vào mùa xuân [1,6]. Cây trồng ở trại thuốc Sa
Pa (Viện Dược liệu) thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao. Cây sinh
trưởng phát triển tương đối tốt, ra hoa quả hàng năm. Một số cây đưa xuống trại thuốc
Tam Đảo (Viện Dược liệu) sinh trưởng kém hơn. Cây trồng tốt nhất vào tháng 2-3 để
đến tháng 11-12 thu hoạch [1]. Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo), mùa quả tháng 6-9
[14]. Thu hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [6].
1.1.2. Thành phần hóa học của cây đan sâm
Thành phần hóa học chính trong cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) là
acid phenolic, diterpenoid, flavonoid và một số thành phần khác. Bộ phận trên mặt đất
của loài này có chứa flavonoid, triterpenoid và monoterpenoid đặc biệt là trong hoa và
lá. Trong khi đó, diterpenoid và acid phenolic lại được tìm thấy chủ yếu ở rễ [31].


25

R = R1 = H, Δ5(10),6(7)

22

23 Δ15(16)
24

19-21.Tanshinon I, II, III

24. Isocryptotanshinon

22-23. Isotanshinon I, II

25. Cryptotanshinon

Hình 1.1. Cấu trúc một số abietane diterpenoid
b. Các dẫn xuất của acid phenolic
Các acid phenolic là thành phần chính trong nhóm chất tan được trong nước của
rễ cây đan sâm. Thành phần chính của nhóm này là acid rosmarinic và các acid
salvianolic từ A- K [30].

3
Footer Page 11 of 116.


Header Page 12 of 116.



3 OH OH H Me Me

2 R=R1=H, R2=R3=Me

5 OH H

4

H Me Me

1.Acid ursolic 2. Acid oleanolic 3. Anagadiol 4. Taraxerol 5.Germanicol
Hình 1.3. Cấu trúc một số triterpen oid có trong chi Salvia L.
1.1.3. Tác dụng sinh học của cây đan sâm
Hiện nay có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của loài Salvia miltiorrhiza
Bunge. Các tác dụng đã được chứng minh bao gồm:
- Làm giãn mạch vành, chống huyết khối, chống thiếu máu cục bộ. Các tác dụng này
do các thành phần tanshinon IIA, acid rosmarinic, danshensuan B, acid salvinolic B,
militron và salvinon. Ngoài ra, đan sâm còn được chứng minh có tác dụng chống đau
thắt ngực [12,26,35].
- Tác dụng làm hạ đường huyết do có chứa thành phần là acid polyphenolic [34].
- Rễ đan sâm có tác dụng hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở tế bào [11,
28].
- Tác dụng an thần do thành phần miltiron, do đó được sử dụng điều trị chứng mất ngủ
[5,28].

5
Footer Page 13 of 116.



6
Footer Page 14 of 116.


Header Page 15 of 116.

+ Bổ huyết: có thể dùng đối với các bệnh thiếu máu, đặc biệt đối với các bệnh mặt
nhợt nhạt, xanh xao của phụ nữ chưa có chồng. Khi dùng với tính chất bổ huyết thì
dùng đan sâm dạng không qua chế biến.
+ Bổ can tỳ: dùng trong các trường hợp gan và lá lách bị sưng to, trị bệnh huyết hấp
trùng đều có hiệu quả [4,6].
+ Giải độc: dùng trong các trường hợp sang lở, mụn nhọt [6].
+ Đây còn được xem là thuốc dùng tốt cho trường hợp đau dạ dày hay viêm vú [14,30].
+ Đan sâm còn được dùng để điều trị các bệnh viêm gan, xơ gan, suy thận mạn tính,
tiểu đường và các biến chứng của tiểu đường [34].
- Liều dùng: 8- 20 g [6].
Chú ý: không dùng chung với Lê lô [23].

7
Footer Page 15 of 116.


Header Page 16 of 116.

1.2. TỔNG QUAN VỀ CRYPTOTANSHINON
Cryptotanshinon còn được gọi là cryptotanshinone hoặc tanshinon C, là một
diterpene quinon có nguồn gốc từ rễ của cây Salvia miltiorrhiza Bunge.,
O
12


5

6

6
18

18

hinone IIA (1)

15

9

10

3

7

5

4

6

14
8


16
8

12

O

15

O

17

19

Cryptotanshinone (3)

Hình 1.4. Cấu trúc cryptotanshinon

+ Tên IUPAC: 1,2,6,7,8,9-hexahydro-1,6,6-trimethyl-(R)-phenanthro(1,2-b)furan10,11-dione.
+ Công thức phân tử: C19H20O3.
+ Khối lượng phân tử: 296,36 g/mol.
+ Màu sắc: bột màu cam nâu.
+ Điểm nóng chảy: 183°C.
+ Độ tan: cryptotanshinon không hòa tan trong nước, nhưng tan trong dimethyl
sulfoxide, methanol, ethanol, cloroform và ether, và chuyển sang màu đỏ khi tương tác
với acid sulfuric đậm đặc. Cryptotanshinon thuộc dẫn xuất phenanthraquinon, khi tiếp
xúc với ánh sáng sẽ xảy ra phản ứng quang hóa. Ngoài ra, độ hòa tan của
cryptotanshinon thay đổi chút ít giữa pH từ 2 đến pH 8.
+ Độ ổn định : cryptotanshinon cần được bảo vệ tránh ánh sáng và dưới điều kiện khô

mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phái trên cao. Dung môi
giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn
ra của cột. Phương pháp này thường làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so
với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột cũng có ưu điểm là pha tĩnh và các
dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng mẫu tương đối lớn. ¾ Các
bước thực hiện sắc ký cột gồm:
- Lựa chọn chất hấp phụ: pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân cực
được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau. Với 2 phân tử không
phân cực, phân tử nào có trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân
tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các
phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu hơn trong cột so với phân tử tuy có tính phân
cực.

9
Footer Page 17 of 116.


Header Page 18 of 116.

- Lựa chọn dung môi: Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp
với nồng độ 10 mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A). Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5x10
cm. Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5 µl dung dịch (A). Mỗi bản
mỏng được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó phát hiện bằng
đèn UV hay thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào phù hợp.
Từ kết quả đó, tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi phân cực và một
dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa (etyl acetat).
- Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho
dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Cho chất hấp thu dạng
khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa gõ nhẹ vào
thành cột. Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2 cm trong cột, thì mở nhẹ

+ Hệ số lưu giữ Rf
Đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu
giữ Rf. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân
tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

R

f

=

d
d

(1)

R
M

Trong đó: dR là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)
dM là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động
(đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)
Rf có giá trị dao động giữa 0 và 1
+ Hệ số lưu giữ tương đối Rr:

R=
r

Trong đó:


làm sạch dịch chiết, định lượng chất phân tích bằng một kỹ thuật thích hợp như phổ
hấp thụ, huỳnh quang, cực phổ... Phương pháp này hiện nay ít dùng vì có nhiều trở
ngại lại mất nhiều thời gian.
Cách 2: Định lượng trực tiếp trên bản mỏng, đo diện tích hay cường độ màu của vết
sắc ký. Hiện nay dùng 2 kỹ thuật:
Densitometer: Chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ huỳnh quang.
Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số: Quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh,
nhất là camera kỹ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký. Xử
lý dữ liệu bằng máy tính [3,9,21,22].
1.3.2. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
a. Nguyên tắc
Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong một từ trường, khi hay đổi từ
trường sẽ dẫn đến hấp thụ năng lượng của sóng vô tuyến và xuất hiện phổ cộng hưởng
từ hạt nhân.
Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân nguyên tử có
khối lượng là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và cho tín
hiệu NMR. Các hạt nhân nguyên tử có khối lượng và số thứ tự nguyên tử là những số
chẵn thì không có momen từ và không cho tín hiệu NMR. Vị trí của tín hiệu cộng
hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện tử ở vùng lân cận quanh
proton đó.

12
Footer Page 20 of 116.


Header Page 21 of 116.

b. Các đại lƣợng đặc trƣng
- Độ chuyển dịch hoá học
Sự khác nhau về vị trí hấp thụ giữa proton của mẫu phân tích và của chất chuẩn

quan không gian và mật độ điện tử ở vùng lân cận của 2 proton tương tác.
- Diện tích dưới tín hiệu
Diện tích dưới tín hiệu tỷ lệ với số lượng proton cho tín hiệu đó. Đường cong
tích phân diện tích dưới tín hiệu cho biết số lượng tương đối của proton cho tín hiệu.
- Ứng dụng của phổ NMR
Bằng cách xác định độ dịch chuyển hoá học , hằng số tương tác J và diện tích
dưới tín hiệu người ta có thể biện giải phổ và kết hợp với các thông tin của các loại
phổ khác như IR, MS từ đó xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [2,3,22].
1.3.3. Phƣơng pháp phân tích khối phổ (MS)
a. Nguyên tắc
Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50 – 100 eV) để bắn phá phân tử
hữu cơ ở môi trường chân không cao (10-3 - 10-6 mmHg). Trong quá trình đó, chất hữu
cơ bị ion hoá và bị phá vỡ thành mảnh. Các ion được tạo thành trong buồng ion hoá,
13
Footer Page 21 of 116.


Header Page 22 of 116.

được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương
ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập
hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối.
b. Ứng dụng của MS
- Xác định các đồng vị: Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số điện
tích hạt nhân chỉ khác nhau về số neutron trong nhân đó nên khối lượng nguyên tử
khác nhau. Có thể dùng MS để xác định thành phần các đồng vị của các nguyên tố
trong mẫu.
- Định tính
+ Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử M+, (M+1)+,
(M+2)+, đây là các đặc trưng quan trọng của hợp chất hoá học. Bên cạnh đó xem xét

đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký
tR’(Thời gian lưu thực):

tR’= tR – t0

(Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất nhất định khi
tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định).
W : là chiều rộng đáy pic.
W1/2 : là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic.
- Hệ số dung lượng k’:
Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ được tính theo công thức:

k'=

t 'R t R -t 0 t R
=
= -1
t0
t0
t0

(4)

Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là tỷ
lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời điểm cân
bằng. Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm mẫu do đó làm

15
Footer Page 23 of 116.


hay

 t 
N=5,54

W 

R

(6)
2

(7)

1/2

Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính bằng:
H=

L
N

(8)

- Hệ số bất đối AF (tailing factor):
AF =

W1/20
2a

4  α   1+k 'B 
W B+ W A
W1/2B+ W1/2A

Độ phân giải cơ bản đạt được khi RS = 1,5 khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ ràng, chỉ xen
phủ nhau ~ 0,3 %.
Rs = 1,0 : Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4%
RS = 0,75: Hai pic chưa tách nhau
c. Ứng dụng của phƣơng pháp HPLC
- Định tính
Dựa vào thời gian lưu, hình dáng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hoặc chồng
phổ của pic thử và pic chuẩn để định tính chất thử.
- Xác định tạp chất
Dùng để kiểm tra tạp chất trong mẫu, trên sắc ký đồ không có pic tại thời gian
lưu của tạp chất (dùng chất đối chiếu) khi chạy sắc ký trong cùng điều kiện.
- Định lượng
Dựa trên nguyên tắc nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic
của nó. Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng:
+ Phương pháp chuẩn ngoại: Đây là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả hai
mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó đem so
sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu được từ mẫu thử với pic của mẫu chuẩn đã biết
nồng độ sẽ tính ra nồng độ các chất có trong mẫu thử.

17
Footer Page 25 of 116.