ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐINH ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ TRÌNH TỰ GEN
rpoC1 CỦA CÂY DỪA CẠN [Catharanthus roseus (L.) G. Don]

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2016
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐINH ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ TRÌNH TỰ GEN
rpoC1 CỦA CÂY DỪA CẠN [Catharanthus roseus (L.) G. Don]

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu


tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công
trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô, cán bộ Phòng thí nghiệm Công
nghệ gen và phòng thí nghiệm Thiết bị chung, Khoa Sinh học, Trường Đại
học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi tiế n hành các
thí nghiệm của đề tài.
Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình và bạn bè trong suốt
thời gian ho ̣c tâ ̣p và thực hiện đề tài luận văn.

Tác giả

Đinh Anh Tuấn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




iii

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Đă ̣t vấ n đề ........................................................................................................ 1
2. Mu ̣c tiêu nghiên cứu........................................................................................ 3
3. Nô ̣i dung nghiên cứu ....................................................................................... 3
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4
1.1. CÂY DỪA CẠN .......................................................................................... 4
1.1.1. Hệ thống phân loại cây Dừa cạn ............................................................... 4
1.1.2. Giá trị sử dụng của cây dừa cạn ............................................................... 6

3.1.2. Đặc điểm khác biêṭ về hình thái giữa ba giố ng dừa ca ̣n ........................... 26
3.2. PHÂN LẬP GEN rpoC1 TỪ CÁC MẪU DỪA CẠN ................................ 28
3.2.1. Tách DNA tổng số từ các mẫu dừa cạn .................................................... 28
3.2.2. Khuếch đại đoạn gen rpoC1 bằng PCR .................................................... 28
3.2.3. Kết quả xác định trình tự đoạn gen rpoC1 phân lập từ các mẫu dừa ca ̣n 29
3.3. PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG CỦA CÁC MẪU DỪA CẠN DỰA TRÊN
TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN CỦA
ĐOẠN GEN rpoC1 ............................................................................................. 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 37
1. Kế t luâ ̣n ........................................................................................................... 37
2. Đề nghi ............................................................................................................
37
̣
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ........................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 39
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




v

DANH MỤC BẢNG

Trang
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR nhân gen rpoC1 ................................. 19
Bảng 3.1. Các vị trí sai khác giữa các trình tự nucleotide của đoạn gen
rpoC1 ............................................................................................................... 32
Bảng 3. 2. Các vị trí sai khác giữa các trình tự amino acid suy diễn của gen
rpoC1 ............................................................................................................... 33


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




vii

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DNA

Deoxyribonucleic acid

PCR

Polymerase chain reaction

rpoC1

RNA polymerase beta' chain

CTAB

Cetyl trimethylammonium Bromide

TIM_HG

Giống dừa cạn hoa hồng tím thu tại Hà Giang


thực vật ở nước ta đã có nhiều công trình thống kê, phân loại nhiều loài cây,
có thể kể đến một số tác giả như: Tuệ Tĩnh đã mô tả tới 579 loài cây làm
thuốc trong cuốn Nam dược thần hiệu, Lê Quí Ðôn với bộ Vân đài loại ngữ đã
phân chia thực vật thành nhiều loại: cây cho hoa, cho quả, ngũ cốc, rau, cây
loại mộc, loại thảo. Lý Thời Chân cho xuất bản cuốn Bản thảo cương mục
trong đó có đề cập tới trên 1000 vị thuốc thảo mộc...[1].
Trong thời kỳ Pháp thuộc, do tài nguyên thực vật ở nước ta rất phong phú
đã gây được sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu phương Tây. Công trình lớn
nhất là bộ Thực vật chí tổng quát Ðông Dương do Lecomte và một số nhà thực
vật học người Pháp đã biên soạn, phân loại, mô tả và thống kê các cây từ Dương
xỉ tới thực vật Hạt kín của toàn Ðông Dương. Công trình nghiên cứu các cây
thuốc ở Campuchia, Lào và Việt Nam của Pételot... Phần lớn các nghiên cứu đều
tập trung vào thực vật bậc cao, đặc biệt đối với cây thuốc [1], [17].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




2

Dừa cạn (Catharanthus roseus. G. Don) là loại cây cảnh phổ biến vì
dáng cây đẹp, mềm mại, lá xanh mướt, hoa rực sáng, là những nét đặc trưng
tạo được sự hấp dẫn của loài cây này. Dừa cạn cũng là một loại thảo dược dân
gian vì có chứa nhiều loại alkaloid. Từ dừa cạn có thể chiết được một số chất
điều trị ung thư như vinblastine, vincristine. Trên thế giới dừa cạn gồm 8 loài,
có ba giố ng dừa ca ̣n trồ ng phổ biế n ở Viê ̣t Nam phân biê ̣t nhau về màu sắ c
hoa: hoa màu hồ ng tím, hoa màu trắng vàng và hoa màu trắng đỏ.
Đến nay, các mẫu thực vật vẫn thường được nhận diện bằng các đặc
điểm hình thái, giải phẫu hoặc các đặc tính sinh lý, hóa sinh, di truyề n nhờ
vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp,

2) Nghiên cứu thông tin về trình tự gen rpoC1 và khuế ch đa ̣i đoa ̣n gen rpoC1
từ DNA hệ gen lục la ̣p của cây dừa cạn. Giải trình tự nucleotide của đoa ̣n gen
rpoC1 phân lâ ̣p từ bố n mẫu dừa ca ̣n thu từ hai tỉnh Hà Giang và Thái Nguyên.
3) Phân tích sự đa dạng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn
của gen rpoC1 của các mẫu nghiên cứu và của gen rpoC1 trên Ngân hàng gen
quốc tế.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY DỪA CẠN

1.1.1. Hệ thống phân loại cây Dừa cạn
Giống Catharanthus (thuộc họ trúc đào Apocynaceae) gồm có 8 loài,
hầu hết là cây thân thảo lâu năm. Trong đó, chỉ có loài Catharanthus pusillus
có nguồn gốc từ Ấn Độ, còn tất cả các loài còn lại có nguồn gốc từ
Madagasca, số lượng nhiễm sắc thể cho tất cả các loài Catharanthus đều là
2n=16 [1], [22]. Tám loài thuộc giống này đó là:
 Catharanthus coriaceus Markgr. Madagascar;
 Catharanthus lanceus (Bojer ex A.D.C.) Pichon. Madagascar;
 Catharanthus longifolius (Pichon) Phichon. Madagascar;
 Catharanthus ovalis Markgr. Madagasca;
 Catharanthus pusillus (Murray) G.Don India subcontinent;
 Catharanthus roseus (L) G. Don. Madagascar;


C

Hình 2.1. Hoa của ba giống Catharanthus
A: Catharanthus roseus var. roseus
B: Catharanthus roseus var. ocellatus
C: Catharanthus roseus var. albus
1.1.2. Giá trị sử dụng của cây dừa cạn
Trong dừa cạn có trên 10 alkaloid, rất phức tạp, người ta đã phát hiện
có hơn 60 chất khác nhau như: ajmalicin, tetrahydroalstonin, serpentin,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




6

lochnerin, akuammin, reserpin... Trong tất cả các alkaloid, có loại vinblastin
và vincritin là hai chất có tác dụng tốt trong chữa các ung thư về máu,
ajmalicin là thuốc điều trị tim mạch rất tốt cho rối loạn thần kinh tim. Nhưng
chỉ mới phát hiện ra những dược tính của dừa cạn trong việc áp dụng chữa
bệnh vì trong tài liệu cổ của y học cổ truyền không thấy đề cập đến cây này.
Tuy vậy, y học cổ truyền một số nước cũng có ghi lại một vài kinh nghiệm sử
dụng dừa cạn để chữa bệnh. Ví dụ, ở Ấn Độ, châu Úc, nam châu Phi, quần
đảo Antilles, người ta dùng dừa cạn sắc uống để chữa bệnh tiểu đường cho
thấy kết quả rất khả quan. Ngoài ra, rễ dừa cạn còn được dùng để tẩy giun,
chữa sốt, làm thuốc thông tiểu, điều kinh, trị tăng huyết áp, chữa sốt rét, kiết
lị, tiêu hóa kém...[1], [23]. Bộ phận dùng để làm thuốc của dừa cạn là rễ, lá
hoặc cả cây. Thông thường, người ta thường nhổ nguyên cả bụi cây dừa cạn
về rửa sạch, cắt nhỏ, phơi khô để cất dùng dần. Trước khi sử dụng có thể sao

hoa trắng vì hoạt chất của chúng cao hơn cây hoa đỏ, hồng. Thành phần
vincristin có tác dụng với bệnh nhân ung thư nhưng chúng lại là thành phần
gây hại cho thai nhi, ức chế hệ thần kinh. Vì vậy dừa cạn là cây dược liệu có
độc, tránh dùng cho phụ nữ có thai, người huyết áp thấp. Dừa cạn được xem
là đặc hữu của vùng đất Madagascar với giá trị dược tính cao nhất thế giới.
Hiện nay hàng năm người dân Madagascar xuất khẩu đến ngàn tấn dừa cạn
phơi khô ra nước ngoài để làm dược liệu. Công ty Dược liệu Trung ương Việt
Nam II cũng đã xuất khẩu cây này từ thập niên 1990. Thị trường dược phẩm
Mỹ, Pháp, Nhật, Việt Nam… có nhiều loại thuốc được bào chế từ dừa cạn
như thuốc trị cao huyết áp, ung thư (máu, tinh hoàn, dạ con)…Kết quả phân
tích của bác sĩ Clark, chiết xuất dừa cạn giàu alkaloid (gồm các loại:
vinblastin, vincristin, tetrahydroalstonin, pirinin, vindolin, catharanthin,
vindolinin, ajmalicin….) [9]. Trong đó thành phần vincristin, vinblastin khi
tách chiết thành dạng thuốc tiêm sẽ có tác dụng lớn trong ức chế tế bào hoặc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




8

sự phân bào. Cho nên chúng hạn chế được việc hình thành bạch cầu thừa ở
bệnh nhân ung thư máu. Đặc biệt đến nay, y khoa vẫn chưa tìm ra phương pháp
gì điều trị bệnh bạch cầu tốt hơn nên chiết xuất dừa cạn càng trở nên quý với
bệnh nhân ung thư máu. Tuy nhiên không phải cứ dùng trà dừa cạn thì chữa
được ung thư, bởi một liều tiêm vincristin, vinblastin có hàm lượng rất cao,
việc dùng các thành phần này cũng dễ bị ngộ độc nên cần có sự hướng dẫn của
bác sỹ điều trị. Hoạt chất trong dừa cạn phụ thuộc vào nơi trồng và thu hái.
Giống trồng ở Việt Nam được đánh giá là thảo dược tốt tương đương dừa cạn ở
Madagascar, chứa khoảng 0,1- 0,2% alkaloid toàn phần. Tỷ lệ alkaloid trong rễ

hiện tác dụng làm giảm bạch cầu của một số chất tách được từ dừa cạn và dẫn
đến sự phát hiện ra chất vincaleucoblastin và 3 alkaloid khác cũng có tác dụng
chống u là leurosin, leurocristin và leurosidin. Ngoài ra người ta còn phát hiện
tác dụng tẩy giun khá mạnh, tác dụng lợi tiểu của catharanthin, vindolinin và
vindolidin. Những thí nghiệm dùng trên người bệnh được bắt đầu vào những
năm 1960 ở Mỹ, Pháp và một số nước khác [1], [22].
Ở nước ta, nhân dân dùng dừa cạn dưới dạng thuốc sắc để làm thuốc lợi
tiểu, chữa huyết áp, tiểu đường, ngày dùng 10-16g. Các bệnh về nội tiết như
đái tháo đường, thông tiểu, viêm đường tiết niệu, tiểu tiện có máu, ít nước tiểu
và trong bế kinh. Rễ và lá dùng rất tốt trong hạ huyết áp, nếu cần ta cho thêm
cây hoa đại (bông sứ), cỏ mần trầu và lá lạc tiên mỗi thứ khoản 20g sắc nước
uống liên tục trong nhiều tháng liền đối với huyết áp cao ở giai đoạn đầu dù
có nguyên nhân hay không có nguyên nhân vẫn rất tốt. Có nơi dùng cây dừa
cạn khô 20g dạng sắc nước uống để chữa những khối u nhỏ trong cơ thể, thời
gian qua ở nhiều cơ sở điều trị đã chiết xuất vinblastin và vincristin là thuốc
lựa chọn thứ nhất trong điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn, là thuốc chọn thứ
hai trong điều trị bệnh Hodgkin, ung thư nhau, ung thư biểu mô tế bào, có vảy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




10

ở đầu và cổ, ung thư biểu mô tế bào thận và còn là một trong những thuốc lựa
chọn thứ ba để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư vòm họng
và ung thư dạng nấm da [23], [36].
Dừa cạn còn dùng để điều trị bệnh sarcoma lympho, sarcoma bạch huyết
bào, bệnh sarcoma chảy máu Kaposi, sarcoma tế bào lưỡi. Đặc biệt dừa cạn
không có sự kháng chéo giữa vinblastin với các loại thuốc chống ung thư

học phân tử. Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (DNA)
trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein). Tùy mục đích
hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen (đoạn DNA)
khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen [5]. Phân loại học phân tử
(Molecular taxonomy) đã cho những kết quả khá chính xác, giúp cho việc
phát hiện loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá
đầy đủ về tính đa dạng di truyền, chủng loại phát sinh và sự tiến hóa của
nhiều loài động vật, thực vật và vi sinh vật. So với chỉ thị hình thái, chỉ thị
DNA cho độ chính xác cao mà không lệ thuộc vào các yếu tố môi trường. Đối
với thực vật, hệ gen lục lạp (cpDNA) là những gen rất bảo thủ trong tiến hóa.
Trong đó rpoC1 là một gen lu ̣c la ̣p, cấ u trúc vòng kép, bề n vững, chiều dài
dao động từ 409- 545 bp [17]. Chức năng của rpoC1 mã hóa cho tiểu đơn vị β
- RNA polymerase. Căn cứ mức đô ̣ đô ̣t biế n trong triǹ h tự nucleotide của gen
mà có thể phân biệt hai loài hay xác đinh
̣ đươ ̣c quan hê ̣ ho ̣ hàng giữa các đố i
tươ ̣ng nghiên cứu. Kế t quả nghiên cứu sẽ góp phầ n cho viêc̣ thiế t lâ ̣p mã va ̣ch
DNA (DNA barcoding) cho cây dừa ca ̣n.
Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario,
Canada, đề xuất thuâ ̣t ngữ "mã vạch DNA" (DNA Barcode) như là một cách
để xác định loài [6]. Mã vạch được sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ một
phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét ở siêu thị phân
biệt được các sản phẩm bằng cách nhận diện được các sọc màu đen đặc chưng
của từng sản phẩm. Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




12


13

người và động vật. Và để hiểu biết thêm những bệnh truyền nhiễm cũng như
phương pháp điều trị đạt được hiệu quả nhanh chóng. Mã vạch DNA cho những
vật chủ gây bệnh đang được xây dựng và bước đầu đưa vào sử dụng, điều này
cung cấp cho các tổ chức và các cơ quan y tế cộng đồng các công cụ và phương
pháp hiệu quả để ngăn cản và hạn chế sự phát triển của ruồi và diệt côn trùng.
Mã vạch DNA cũng được ứng dụng tại hải quan nhằm hỗ trợ việc xác
định nguồn gốc của sinh vật sống hoặc hàng nhập khẩu, để ngăn cản sự vận
chuyển trái phép các loài thực vật và động vật quý hiếm qua biên giới. Một
thực tế đáng báo động, đa dạng sinh học trên thế giới đang liên tục giảm sút,
trong đó nhiều loài có nguy cơ tuyệt chủng. Không thể kiểm soát được săn
bắn ở một số vùng Châu Phi điều đó đã làm cho loài linh trưởng giảm 90% .
Rất khó để phân biệt có phải thịt của những loài động vật hoang giã quý hiếm
hay không. Vì vậy, mã vạch DNA có thể giúp những cơ quan có thẩm quyền
chỉ ra thịt có nguồn gốc từ những loài nguy cấp, ngăn chặn săn bắn bất hợp
pháp và giúp bảo tồn sự đa dạng sinh học. Một dự án chiến lược trên toàn thế
giới của mã vạch DNA đã được công bố gần đây nhằm xây dựng một thư viện
mã vạch của các loài đang bị đe dọa. Mã vạch DNA ngoài việc giúp ngăn
ngừa bệnh, kiểm soát hành vi săn bắn trái phép những loài nguy cấp mà nó
còn được ứng dụng trong nông nghiệp và khai thác lâm nghiệp. Một số quốc
gia có nền kinh tế phụ thuộc vào nguồn tài nguyên đã phải đối mặt với việc
khai thác quá mức nguồn tài nguyên nông nghiệp, biển và lâm nghiệp gây ra
sự suy giảm hoặc thậm chí tuyệt chủng của nhiều loài. Để kiểm soát khai thác,
nhà chức trách cần phải thiết lập hệ thống quản lý một cách hiệu quả để kiểm
soát kinh doanh các sản phẩm nông nghiệp, biển và lâm nghiệp. Có ít nhất hai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN







15

phương pháp sử dụng các dấu chuẩn phân tử rõ ràng là chính xác và phổ biến
hơn. Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dược sử dụng phương pháp mã vạch
DNA có thể bảo vệ người dùng tránh khỏi tác dụng độc hại của các loại thuốc
giả mạo, đặc biệt trong nhiều trường hợp có thể nguy hiểm đến tính mạng [5].
Trước đây người ta phân chia dừa cạn thành 2 giống là
Catharanthusroseus var. roseus và Catharanthusroseus var. angustus, đến
2004, dừa cạn có khoảng 100 giống khác nhau. Đã có nhiều nghiên cứu về
dừa cạn như chọn giống dựa vào hình thái hoặc dựa trên hàm lượng alkaloid,
nghiên cứu con đường sinh tổ ng hơ ̣p alkaloid, so sánh hàm lươ ̣ng alkaloid
giữa lá, rễ, sử du ̣ng dừa ca ̣n điề u chế thuố c chữa bênh,
̣ sử dụng các kỹ thuật
AFLP, RAPD và sử dụng hóa phân loại để nhận dạng dừa ca ̣n [5], [11], [22].
1.3. GEN LỤC LẠP

Tế bào thực vật bậc cao chứa 3 cơ quan di truyền đó là: nhân, ty thể và lạp
thể. Mỗi cơ quan tử chứa bộ gen riêng của nó. Di truyền gen ty thể và lục lạp
không tuân theo quy luật Menden và thường di truyền theo kiểu đơn bố mẹ
cho thế hệ sau. Hiện tại các nhà khoa học tập trung nghiên cứu lạp thể nhất là
lục lạp. Ris và Plaut (1962) là những người đầu tiên khám phá ra sự có mặt
của DNA trong lục lạp bằng cách quan sát tảo xanh Chlamydomonas
moewusii dưới kính hiển vi. DNA lục lạp có dạng vòng kép, thường có
khoảng 120-170 nghìn bp, chiều dài khoảng 30-60µm, khối lượng khoảng 80130000000 dalton [7].
Hầu hết gen lục lạp của thực vật thường tồn tại ở dạng vòng, kép lớn. Nhưng
ở một số loài như tảo dinophyte, hệ gen lục lạp lại được chia thành nhiều

[8], [11].
Tuy nhiên qua nhiều nghiên cứu, các nhà khoa học đã thấy rằng trong số
các gen mã vạch, rpoC1 là một ứng cử viên hứa hẹn cho mã vạch DNA thực
vật. Căn cứ mức đô ̣ đô ̣t biế n trong triǹ h tự nucleotide của gen mà có thể xác
định đươ ̣c quan hê ̣ ho ̣ hàng giữa các đố i tươ ̣ng nghiên cứu [4], [8], [11].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN