ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐỖ HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN Ở
CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. DON)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐỖ HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN Ở
CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. DON)
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm

THÁI NGUYÊN - 2016


LỜI CAM ĐOAN

Người thực hiện

Đỗ Huy Hoàng

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN...............................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................ii
MỤC LỤC........................................................................................................iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.........................................................................iv
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH..........................................................................................vi
MỞ ĐẦU ..........................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................3
1.1. Giới thiệu về cây dừa cạn ....................................................................... 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây dừa cạn ................................................ 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây dừa cạn ................................................. 4
1.1.3. Thành phần hóa học và một số công dụng của cây dừa cạn .............. 5
1.1.4. Alkaloid chính trong cây dừa cạn ..................................................... 6
1.2. Công nghệ chuyển gen thực vật và ứng dụng.......................................... 6
1.2.1. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật .......................................... 6
1.2.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở
cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen ............................................. 10
1.3 Một số thành tựu trong nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen gus 12
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................19
2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 19
2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................. 19
2.1.2. Chủng vi khuẩn .............................................................................. 19

Kí hiệu

Tên đầy đủ

AS

Acetosyringone

BAP

6 - Benzyl amoni purin

Cs

Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

gus

β - Glucuronidase gene

IBA

Indol - 3 - butyric acid

Km


iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A. tumefaciens đến tỉ lệ biểu
hiện gen gus tạm thời .................................................................... 25
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone đến tỉ lệ biểu hiện gen
gus tạm thời .................................................................................. 27
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỉ lệ biểu hiện gen
gus tạm thời .................................................................................. 30
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến chọn lọc mẫu không
chuyển gen.................................................................................... 32
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến chọn lọc mẫu chuyển gen ...... 34
Bảng 3.6: Kết quả biến nạp gen gus vào dừa cạn ............................................ 37

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Ba giống Catharanthus roseus .........................................................4
Hình 1.2: Sơ đồ Ti plasmid ..............................................................................9
Hình 1.3: Quá trình chuyển T-DNA từ A.tumefaciens sang tế bào thực vật..... 10
Hình 2.1: Sơ đồ vector pCB-gusplus............................................................... 19
Hình 3.1: Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của mật độ tế bào vi khuẩn A.
tumefaciens đến tỉ lệ biểu hiện gen gus tạm thời ............................... 26
Hình 3.2: Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone đến tỉ lệ
biểu hiện gen gus tạm thời ................................................................ 28
Hình 3.3: Kết quả biểu hiện gen gus tạm thời ................................................. 29
Hình 3.4: Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỉ lệ
biểu hiện gen gus tạm thời ................................................................ 31

Trong đó, deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (DAT) là một enzyme chìa
khóa xúc tác cho phản ứng cuối cùng của quá trình tổng hợp vindoline [26]. Do
vậy, nghiên cứu biện pháp

nâng cao năng suất tổng hợp vinblastine và

vincristine ở cây dừa cạn bằng công nghệ gen để phục vụ cho việc tạo thuốc
chữa bệnh ung thư là rất cần thiết.
Xuất phát từ thực tế trên, để góp phần tạo thành công cây dừa cạn
chuyển gen với mục đích nâng cao năng suất tổng hợp hai loại ankaloid nói
trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình
chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng được quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn để phục vụ chuyển
gen mục tiêu.

1


3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu xác định loại vật liệu làm thể nhận gen, mật độ tế bào vi
khuẩn A. tumefaciens, nồng độ acetosyringone (AS), thời gian nhiễm khuẩn A.
tumefaciens và nồng độ kanamycin phù hợp cho chuyển gen ở cây dừa cạn;
- Nghiên cứu chuyển gen gus vào cây dừa cạn và tạo cây dừa cạn chuyển gen;
- Đề xuất quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn.

2


Chương 1


C. roseus var. roseus

C. roseus var. ocellatus

C. roseus var. albus

Hình 1.1: Ba giống Catharanthus roseus [30]
1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây dừa cạn
Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 - 60cm, phân nhiều
cành, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Thân hình trụ có 4 khía dọc, có
lông ngắn, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang màu hồng tím. Cây có
bộ rễ phát triển và mọc thành bụi dày.
Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, hình trứng, đầu hơi nhọn, dài 4 7cm, rộng 2 - 3cm, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt, có lông. Cuống lá ngắn, dài 3 5cm. Gân lá hình lông chim lồi mặt dưới, 12 - 14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới,
cong hướng lên trên.
Hoa trắng hoặc đỏ tím, có mùi thơm. Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn.
Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5. Cuống hoa dài 4 - 5mm. Lá đài 5, hơi dính nhau ở
dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp, có lông ở mặt ngoài, dài 3 4mm. Cánh hoa 5, dính. Ống tràng màu xanh, cao 2 - 4cm, hơi phình ở gần
họng, mặt ngoài có 5 chấm lồi; 5 thùy có màu đỏ hây hồng tím, trắng, ... ở mặt
trên, mặt dưới màu trắng, dài 1,5 - 1,7cm; miệng ống tràng có nhiều lông và có
màu khác phiến (màu vàng hay đỏ nếu hoa trắng, màu đỏ sẫm hay vàng nếu
hoa màu hồng tím). Tiền khai hoa vặn cùng chiều kim đồng hồ. Nhị rời đính ở
phần phình của ống tràng, xen kẽ cánh hoa, chỉ nhị ngắn. Bao phấn hình mũi
tên, hướng trong, khai dọc, đính đáy. Các bao phấn chụm trên đầu nhụy. Hạt
phấn rời, hình chữ nhật, có rãnh dọc. Lá noãn rời ở bầu nhưng dính ở vòi và

4


đầu nhụy, mặt ngoài có nhiều lông, mỗi lá noãn mang nhiều noãn, đính noãn


cấp tính), sarcom Ewing và sarcom cơ vân. Ngoài ra, ở dạng dùng phối hợp,
vincristine sulfat còn được dùng cho ung thư biểu mô vú, ung thư cổ tử cung, u
nguyên bào thần kinh và bệnh bạch cầu lympho mạn tính. Nhân dân ta đã có
bài thuốc chữa bạch cầu cấp (bệnh máu trắng) bằng cách sắc uống thân và lá
cây dừa cạn (khoảng 15 gam thân lá khô/ngày) [27].
Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng
thân và lá phơi khô, sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, làm
thuốc điều kinh, tẩy giun, chữa sốt, chữa bệnh ngoài da [17].
1.1.4. Alkaloid chính trong cây dừa cạn
Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, và có tính base.
Alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể con người và động vật, nhất
là đối với hệ thần kinh. Với chỉ một lượng nhỏ alkaloid là chất độc gây chết
người nhưng lại có khi nó là thần dược trị bệnh đặc hiệu [19].
Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37 - 1,15%, ở thân
0,40%, rễ chính 0,7 - 2,4%, rễ phụ 0,9 - 3,7%, hoa 0,14 - 0,84%, vỏ quả 1,14%,
hạt 0,18%. Có khoảng 150 loại alkaloid đã được chiết từ Catharanthus roseus.
Trong số đó đặc biệt chú ý là nhóm 20 alkaloid dimeric, là những nhóm có hoạt
tính chống ung thư bao gồm vinblastine và vincristine. Vinblastine có ở lá với
hàm lượng 0,013 - 0,063%, ở bộ phận trên mặt đất 0,0015%, ở rễ 0,23% (cây bị
bệnh asteryllow-virus thì không có vinblastine). Vincristine với hàm lượng thấp
hơn 0,0003 - 0,0015% [23].
1.2. Công nghệ chuyển gen thực vật và ứng dụng
1.2.1. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết
kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các
sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật, …) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở
dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ các
gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện



7


Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do phụ thuộc vào hệ thống protein Vir;
(iv) Tránh được sự hình thành các cây chuyển gen khảm; (v) Kỹ thuật đơn giản,
dễ thực hiện và không đòi hỏi thiết bị đắt tiền. Mặc dù vậy, phương pháp này
mới chỉ được sử dụng thành công ở nhiều cây hai lá mầm, nhưng hiệu quả với
cây một lá mầm còn thấp (do ở cây một lá mầm các tế bào khi bị thương có xu
hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiếp hợp chất phenol
như cây hai lá mầm). Khi nhược điểm này được khắc phục thì phương pháp
chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium sẽ ngày càng được quan tâm và dẫn
trở thành một phương pháp chuyển gen được các nhà nghiên cứu ưu tiên lựa
chọn vì lúa, ngô, lúa mì, … là những cây lương thực thiết yếu [28].
* Vi khuẩn A. tumefaciens và hiện tượng khối u ở thực vật
Agobacterium là vi khuẩn gram âm, gây ra các triệu chứng bệnh ở cây
khi xâm nhiễm qua vết thương. Trong chi Agrobacterium thì A. tumefaciens
được sử dụng nhiều nhất trong chuyển gen. Vi khuẩn A. tumefaciens không tự
sản xuất được một số amino acid như octopin, nopaline. Để tồn tại nó chuyển
gen của nó vào thực vật, thực vật sản xuất các chất cần thiết, vi khuẩn phân hủy
các chất này để lấy năng lượng. Trong quá trình cộng sinh này, vi khuẩn cũng
chuyển các gen kích thích sinh trưởng làm các tế bào nhiễm vi khuẩn phân chia
vô tổ chức, gây phát sinh khối u ở thực vật. Ti plasmid - một loại plasmid đặc
hiệu được vi khuẩn chuyển nạp vào tế bào thực vật - là tác nhân gây nên tình
trạng khối u [29].
Ti plasmid là một phân tử DNA kép, gồm 150.000 – 200.000 cặp
nucleotit. Tuy nhiên chỉ có một đoạn gồm 20.000 – 30.000 cặp nucleotit có khả
năng thâm nhập vào genome của tế bào chủ, đó là đoạn T-DNA. T-DNA có
chứa các đoạn gen gây ra sự sinh trưởng không kiểm soát của tế bào thực vật,
đó là các gen mã hóa auxin và cytokynin. Trên Ti plasmid còn có vùng vir chứa

Hình 1.3: Quá trình chuyển T-DNA từ A. tumefaciens sang tế bào thực vật
1.2.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở
cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen
Nghiên cứu nuôi cấy rễ tơ, loại rễ hình thành do sự xâm nhiễm của vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào mô thực vật tổn thương từ lâu đã được
ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như phân tích chức năng
của gen, biểu hiện protein ngoại lai, sản xuất các hợp chất thứ cấp hay biến đổi
thành phần các chất chuyển hóa ở thực vật. Nguyên nhân của sự phát triển rễ tơ
đã được xác định liên quan đến vùng TL-DNA nằm trên plasmid Ri của các
chủng Agrobacterium rhizogenes, trong đó giữ vai trò quan trọng là 4 locus gen
rolA, rolB, rolC và rolD. Các nghiên cứu về hàm lượng alkaloid, vincristine và
vinblastine ở cây dừa cạn cho thấy, các chất này có hàm lượng cao ở rễ. Vì vậy,
nghiên cứu sự phát triển rễ tơ ở cây dừa cạn đã được một số nghiên cứu đề cập.
Javier và cs (1998), thu được các dòng rễ Catharanthus roseus chuyển gen phát
triển rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes chủng A4 trên môi trường muối B5
1/2, không bổ sung chất kích thích sinh trưởng. Hàm lượng indole alkaloid
trong rễ nuôi cấy đã được xác định. Kết quả cho thấy, tất cả các dòng rễ dừa

10


cạn chuyển gen được phân tích đều có mặt của vindoline và catharanthine, hai
tiền chất tổng hợp vinblastine và vincristine. Trong điều kiện nuôi cấy của thí
nghiệm, rễ với hình thái mỏng cho lượng sản phẩm gen rolC cao nhất. Như
vậy, các rễ nuôi cấy có tốc độ tăng trưởng thấp thì có khả năng sản xuất
alkaloid cao. Ngược lại, những rễ mập là những rễ có khả năng tăng trưởng
nhanh hơn thì lại cho hàm lượng alkaloid thấp hơn [21]. Cũng bằng nghiên cứu
chuyển các gen mã hóa các enzyme chìa khóa của con đường tổng hợp TIAs
vào rễ tơ C.roseus qua Agrobacterium rhizogenes, sau đó tiến hành phân tích
các dòng rễ chuyển gen bằng RT-PCR và HPLC, Goklany và cs (2009), đã

chuyển gen thành công, hiệu suất chuyển gen là 11%. Kết quả phân tích bằng

11


HPLC cho thấy, có sự tăng hàm lượng của vindoline trong cây chuyển gen.
Đây là báo cáo đầu tiên tính đến thời điểm công bố chuyển gen qua A.
tumefaciens ở cây dừa cạn. Quan trọng hơn, việc chuyển thành công gen DAT
vào cây dừa cạn sử đã khẳng định kĩ thuật chuyển gen cây dừa cạn được phát
triển hoàn thiện, nâng cao tích lũy vindoline trong cây chuyển gen [26].
Các nghiên cứu chuyển gen ở cây dừa cạn hiện nay trên thế giới mới chỉ
công bố thành công ở mức độ mô nuôi cấy và cây trong phòng thí nghiệm.
Song các kết quả nghiên cứu này đã khẳng định tính khả thi của hướng nghiên
cứu tạo cây dừa cạn chuyển gen nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và
vincristine phục vụ điều chế thuốc chữa trị ung thư hiệu quả.
1.3 Một số thành tựu trong nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen gus
Gen β-glucuronidase (gus) được phân lập từ chủng E. Coli RA201. Gen
gus là gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase, đây là một
hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có
màu xanh lam đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronidase thường dùng nhất trong
phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus là X-gluc (5-bromo-4-chloro-3indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-gluc không màu dưới tác động của
enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh lam. Nhờ khả năng này mà
các nhà khoa học đã thiết kế gen gus vào các vector chuyển gen để làm chỉ thị
dễ nhận biết ở mô, tế bào thực vật mang gen chuyển [22].
Có nhiều vector chuyển gen vào thực vật được thiết kế có mang gen gus
như pB1121, pCAM301,… nhưng nhược điểm của các vector này là không
được thiết kế đoạn intron ở đầu 5’ trước gen gus. Vì vậy khi nhuộm X-gluc gen
gus biểu hiện trong cả tế bào vi khuẩn và trong cả tế bào thực vật, điều này gây
khó khăn cho việc nhận biết chính xác sự có mặt của gen gus trong mô tế bào
thực vật. Để khắc phục nhược điểm này, vector pPTN289 đã được thiết kế

LBA4404 mang plasmid pTOK233 trong 3 ngày và cấy chuyển sang môi
trường tái sinh chọn lọc MSRe có carbenicillin 250 mg/l và cefotaxim 100

13


mg/l. Các mô sẹo phát triển sau 3 tuần lần lượt được chuyển sang môi trường
chọn lọc MSSe có bổ sung hygromycin 30 mg/l trong 3 tuần và hygromycin 50
mg/l. Các dòng kháng hygromycin được chuyển sang môi trường tăng sinh
N6P trong 2 tuần trước khi chuyển sang môi trường tái sinh. Hiệu suất chuyển
gen nhìn chung còn thấp, đạt 6 - 12,5% [1]. Mới đây, Hoàng Thị Giang và cs
(2015), đã cải tiến thành công quy trình chuyển gen vào giống lúa Taichung 65
thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với hiệu suất chuyển gen cao,
thao tác đơn giản, giảm thiểu khối lượng công việc phải làm. Trong quy trình
đưa ra, tác giả đã tối ưu hóa các bước tiến hành, chuẩn hóa thành phần môi
trường nuôi cấy và đưa ra một số nhân tố quan trọng trong thao tác. Kết quả thí
nghiệm cho thấy sử dụng đĩa petri có gờ cao 15mm và phơi mẫu không chỉ làm
tăng tỷ lệ tạo mô sẹo từ phôi mà còn tăng kích thước và chất lượng mô sẹo
dùng cho quá trình chuyển gen. Dịch khuẩn với mật độ OD600nm = 0,1 là tối ưu
với tần số biểu hiện gen gus ở mô sẹo cao (81,25%) và tỷ lệ mẫu nhiễm thấp. Ở
giai đoạn chọn lọc sau lây nhiễm, mô sẹo phát triển tốt hơn khi tiến hành phơi
mẫu và sử dụng đĩa petri có gờ cao 15mm. Phân tích sự có mặt của promoter
R4 cho thấy tỷ lệ cây tái sinh mang cấu trúc gen biến nạp cao (90,24%). Đánh
giá sự biểu hiện của gen gus ở cây lúa chuyển gen đã chứng tỏ sự hoạt động
mạnh của promoter R4, điều khiển quá trình phiên mã, dẫn tới tổng hợp enzym
gus. Kết quả phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T1 đã chứng minh sự di truyền
ổn định của gen biến nạp sang thế hệ sau [3].
Sau lúa và ngô, đậu tương là cây trồng truyền thống cũng rất được coi
trọng. Năm 2007, Đinh Thị Phòng và cs, đã tiến hành chuyển gen gus vào đỉnh
phôi hạt chín giống đậu tương DT12 thông qua Agrobacteria tumefaciens.

có bổ sung kháng sinh kanamycin 50mg/l cho thấy cây sống sót có bộ rễ sinh
trưởng và phát triển bình thường sau chọn lọc là 13,6% so với mẫu ban đầu [2].
Năm 2012, Nguyễn Thị Thanh Nga và cs, đã nghiên cứu quy trình chuyển gen
vào cây dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb). Tác giả sử dụng chủng vi khuẩn
CV58 mang vector nhị phân pCB-gusplus chứa gen chọn lọc kháng kanamycin

15


nptII và gen chỉ thị gus-intron được dùng để chuẩn hóa. Vật liệu chuyển gen
là các mảnh lá mầm 5 đến 7 ngày tuổi được nhiễm với vi khuẩn ở nồng độ
OD600nm = 0,7 trong 30 phút. Sau 3 ngày đồng nuôi cấy các mảnh lá mầm
được tái sinh trên môi trường chọn lọc MS có bổ sung BAP 1,5 mg/l, IBA
0,5 mg/l, kanamycin 200 mg/l và cefotaxim 500 mg/l. Các chồi chuyển gen
ra rễ trên môi trường MS có bổ sung IBA 0,2 mg/l, kanamycin 100 mg/l,
cefotaxim 250 mg/l. Có sự khác nhau đáng kể về sự khác nhau đáng kể về
hiệu quả chuyển gen giữa các dòng dưa hấu khác nhau. Dòng L2 (F1
TG939) cho hiệu quả chuyển gen là 1,87%, tiếp đến là dòng D2 (F9 Tiểu
Long - Thăng Long) 1,85%, các dòng dưa hấu L1 (F1 kingkong) và D1 (có
nguồn gốc Bình Thuận) cho hiệu quả là 0%. Kết quả phân tích cây chuyển
gen thông qua biểu hiện gen gus đã khẳng định sự có mặt ổn định của gen
được chuyển trong cây chuyển gen [9].
Các cây lâm nghiệp cũng được các nhà nghiên cứu quan tâm. Năm 2012,
Vương Đình Tuấn và cs, đã nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến chuyển
gen gus vào phôi trưởng thành 6 gia đình Thông nhựa bằng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens. Kết quả nghiên cứu bước đầu khẳng định việc
chuyển gen gus vào phôi trưởng thành và cung cấp một số thông số phục vụ
chuyển gen vào Thông nhựa bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Một số
yếu tố ảnh hưởng đến chuyển gen gus vào phôi trưởng thành Thông nhựa bằng
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy