ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

HOÀNG NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA
ENZYME PEROXIDASE LIÊN QUAN ĐẾN SỰ
TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN
(Catharanthus roseus (L.) G. Don.)
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm

THÁI NGUYÊN – 2017

ii


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã
tận tình hướng dẫn và chỉ bảo trong suốt quá trình tôi nghiên cứu và thực
hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn, phòng Công nghệ ADN ứng
dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt
Nam đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện
các thí nghiệm nghiên cứu trong đề tài luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo và cán bộ
Khoa Khoa học sự sống trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành

1.1.3. Tác dụng của cây dừa cạn ............................................................... 5
1.2. Hợp chất alkaloid và tác dụng ................................................................ 6
1.2.1. Alkaloid ........................................................................................... 6
1.2.2. Alkaloid trong cây dừa cạn ............................................................. 8
1.3. Quá trình sinh tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn ....... 10
1.4. Enzyme peroxidase (Prx) và gen mã hóa Prx ...................................... 12
1.4.1 Enzyme peroxidase Prx .................................................................. 12
1.4.2. Gen mã hóa peroxidase (Prx) ....................................................... 13
1.5. Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ................ 14
1.6. Các nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine
ở cây dừa cạn ............................................................................................... 16
1.6.1. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở
cây dừa cạn bằng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật...................... 16
1.6.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine
ở cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen ............................................ 17
1.7. Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR ..................................... 18
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 20
2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 20
2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................ 20
v


2.1.2. Vật liệu di truyền ........................................................................... 20
2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu............................................ 20
2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu ........................................................ 20
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 21
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 21
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro ...................................................... 21
2.3.2. Phương pháp chuyển gen vào cây dừa cạn ................................... 22
2.3.3. Phân tích cây chuyển gen .............................................................. 26

tóc, đau nhức.
Trong bối cảnh như vậy cùng với sự phát triển của Công nghệ Sinh
học, các nhà khoa học không ngừng quan tâm nghiên cứu để tìm ra các hợp
chất thứ cấp có giá trị đóng vai trò quan trọng đối với ngành công nghệ dược
phẩm trong việc sản xuất ra các loại thuốc mới, có giá trị, trong số đó quan
trọng nhất là nhóm dược phẩm điều trị ung thư. Một số hợp chất thuộc các
nhóm alkaloid, terpenoid, phenolic, saponin được chiết xuất từ một số thực
vật tiêu biểu như thông đỏ, dừa cạn, trinh nữ hoàng cung, nấm linh chi, giảo
cổ lam được biết đến như là các hợp chất có khả năng trị bệnh ung thư.

1


Dừa cạn là một trong những cây có khả năng sản xuất các indol
alkaloid có dược tính quan trọng trong chế tạo các loại thuốc chống ung
thư, đặc biệt là các loại ung thư máu. Trong các indol alkaloid có mặt trong
cây dừa cạn, hai loại alkaloid là vinblastine và vincristine được sử dụng
nhiều nhất. Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ trong cây dừa cạn,
khoảng nửa tấn lá khô mới chiết xuất được 1g vinblastine cho sản xuất
dược phẩm, các chất này không thể tổng hợp bằng con đường hóa học do
có cấu trúc rất phức tạp. Trong cây dừa cạn, vinblastine và vincristine được
tạo ra từ sự kết hợp của catharanthine và vindoline. Gen mã hóa enzyme
peroxidase có chức năng xúc tác cho phản ứng tạo tiền chất cho sự tổng
hợp vinblastine và vincristine. Các nghiên cứu đã cho thấy trong các giống
dừa cạn hiện có thì giống dừa cạn hoa hồng nhụy tím có hàm lượng
alkaloid toàn phần và các chất là vinblastine và vincristine đạt cao nhất.
Nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa
cạn phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thư là rất cần thiết. Vì những
lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chuyển gen
mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây

Cây dừa cạn là nguồn giàu alkaloid thuộc alkaloid terpenoid indole
được phân lập từ 3 giống cây khác nhau: (1) Catharanthus roseus “Roseus”
có hoa màu hồng tím; (2) Catharanthus roseus “Albus” có hoa màu trắng.
Trong đó, hoa màu hồng tím có hàm lượng vincristien và vinblastine cao
nhất [24].

3


A

B

C

Hình 1.1. Hoa của ba giống Catharanthus roseus (L.) G. Don [24]

A: Catharanthus roseus var. roseus
B: Catharanthus roseus var. ocellatus
C: Catharanthus roseus var. albus

Cây dừa cạn có nguồn gốc ở Madagasca (Châu Phi), mọc hoang và
được trồng ở nhiều nước nhiệt đới và ôn đới như Việt Nam, Ấn Độ,
Indonesia… Cây dừa cạn được người Pháp dưa vào trồng ở Việt Nam để
làm cây cảnh. Cây dễ trồng, phát triển nhanh chịu nắng, chịu hạn tốt, không
kén đất và ít phải chăm sóc, cách chăm sóc không quá đặc biệt nên ít lâu
sau nó đã lan ra ở nhiều địa phương, nhất là ở các tỉnh đồng bằng và ven
biển nước ta [7].
Ở Việt Nam, dừa cạn có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng
từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng biển, tương đối tập

ung thư hệ bạch huyết), bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính, một số ung
thư. Ở Trung Quốc, cây dừa cạn dùng trị cao huyết áp, bệnh bạch cầu
lymphoblastic cấp tính và ung thư, mụn nhọt độc. Còn ở Nouvelle-Calédonie
(châu Đại Dương), dừa cạn cũng là vị thuốc chống ung thư. Ở Australia, nước
hãm rễ cây dừa cạn là loại thuốc dân gian chống tiểu đường [24].
Trong tất cả các bộ phận của cây dừa cạn đều chứa alkaloid. Người ta đã
chiết, phân lập ra trên 150 alkaloid khác nhau, chủ yếu là vinblastine, vincritine,
tetrahydroalstonine, pirinine, vindoline, catharanthine, ajmalicin… Trong đó,
ajmalicin có hiệu quả tốt trong điều trị rối loạn thần kinh tim. Còn vinblastine
và vincristine có tác dụng làm ngừng sự phân chia tế bào ở pha giữa. Vì thế,
chúng được sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị ung thư [7].
5


Hoạt chất trong dừa cạn phụ thuộc vào nơi trồng và thu hái. Giống
trồng ở Việt Nam được đánh giá là thảo dược tốt tương đương dừa cạn ở
Madagascar, chứa khoảng 0,1 – 0,2% alkaloid toàn phần. Tỉ lệ alkaloid
trong rễ (0,7 – 2,4%) cao hơn trong thân (0,46%) và lá (0,37 – 1,15%). Các
nước Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc… cũng đang ra sức bào chế thuốc
từ loại cây này [19].
Hiện nay, y khoa vẫn chưa tìm ra phương pháp nào điều trị bệnh
bạch cầu tốt hơn nên chiết xuất dừa cạn càng trở nên quý với bệnh nhân
ung thư máu. Tuy nhiên, không phải chỉ cần dùng cây dừa cạn sắc lấy
thuốc uống là khỏi bệnh. Vì để chữa được bệnh ung thư cần một liều
vincristine, vinblastine có hàm lượng rất cao. Nhưng dùng các thành phần
này cũng dễ bị ngộ độc nên cần có sự hướng dẫn của bác sỹ điều trị.
Một số bài thuốc dân gian chữa bệnh ung thư của cây dừa cạn:
Chữa ung thư máu, viêm đại tràng: lấy từ 15 – 20 g thân lá dừa cạn
khô sao vàng, sắc, chia từ 2 – 3 lần uống trong ngày.
Chữa bạch cầu cấp (bệnh máu trắng) bằng cách sắc uống thân và lá

thực vật mà từ đó người ta chiết xuất ra các alkaloid, ví dụ như các alkaloid
chiết từ cây dừa cạn vinca thì được gọi chung là các vinca alkaloid.
Khi người ta biết nhiều hơn về một alkaloid cụ thể nào đó, thì việc
gộp nhóm thường lấy theo tên gọi của amin quan trọng về mặt sinh học và
nổi bật nhất trong tiến trình tổng hợp.
Các nhóm alkaloid hiện nay gồm có:
• Nhóm pyridin: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin,
pilocarpin, cytisin, nicotin, spartein, pelletierin.
• Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohtgrin, nicotin.
• Nhóm tropan: atropin, cocain, ecgonin, scopolamin.

7


• Nhóm quinolin: quinin, quinidin, dihydroquinin, dihydroquinidin,
strychnin, brucin, cevadin.
• Nhóm isoquinolin: các alkaloid gốc thuốc phiện như: morphin,
codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, berberin.
• Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrin, dopamin, amphetamin.
• Nhóm indol:
- Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin.
- Các ergolin: Các alkaloid từ ngũ cốc/ cỏ như ergin, ergotamin, acid
lysergic.
- Các beta-cacbolin: Harmin, harmalin, yohimbin, reserpin, emetin.
- Các alkaloid từ chi Ba gạc (Rauwolfia): reserpin
• Nhóm purin: Các xanthin (caffein, theobromin, theophyllin).
• Nhóm terpenoit:
- Các alkaloid aconit: aconitin.
- Các steroit: solanin, samandari (các hợp chất amoni bậc bốn):
muscarin, cholin, neurin.

1.2.2.2. Tác dụng của alkaloid trong cây dừa cạn
Các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất từ cây dừa cạn hai
alkaloid vinblastine và vincristine là những chất ức chế mạnh sự phân bào.
Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với Tubulin, là protein ống vi thể ở thoi
phân bào, phong bế sự tạo thành các vi ống này và gây ngừng phân chia tế
bào ở pha giữa. Cho nên chúng hạn chế được việc hình thành bạch cầu thừa
ở bệnh nhân ung thư máu. Ở nồng độ cao, thuốc diệt được tế bào, còn ở
nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào. Ngoài ra, cây dừa cạn còn có tác
dụng hạ huyết áp và kháng một số chủng nấm gây bệnh. Nhưng ở giai đoạn

9


mang thai lại ngăn cản sự phát triển của thai trên động vật gây độc cho thai
nhi, thuốc chỉ dùng ở thời kì mang thai khi bệnh đe dọa đến tính mạng hoặc
các thuốc khác không thể sử dụng được [20].
Hiện nay, vinblastine được ứng dụng rộng rãi vào điều trị bệnh ung
thư ở người và được hấp thu nhanh chóng theo đường tiêm tĩnh mạch,
thuốc phân bố nhanh vào các mô của cơ thể, liên kết nhiều với protein
huyết tương. Vinblastine được chuyển hóa nhiều, chủ yếu ở gan để thánh
desacetyl vinblastine – là chất có hoạt tính mạnh hơn vincristine, thuốc thải
trừ qua mật vào phân và nước tiểu, một số đào thải dưới dạng thuốc không
biến đổi [11].
Hiệu quả chống ung thư vincristine hơn vinblastine cao hơn khoàng
10 lần để điều trị bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính, tác dụng tốt hơn
trên bệnh bạch cầu cấp tính khác, bệnh Hodgkin, lymphosarcoma, sarcom
tế bào lưới và ung thư vú có hiệu lực [11].
1.3. Quá trình sinh tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn
Quá trình sinh tổng hợp vinblastine và cincristine được tạo thành từ
sự ghép nối của hai monomer alkaloid: catharanthine (indole) và vindoline

vindoline [8], [10].
1.4. Enzyme peroxidase (Prx) và gen mã hóa Prx
1.4.1 Enzyme peroxidase Prx
Peroxidase là một họ các peroxidase cysteine phụ thuộc vào phản
ứng với hydrogen peroxide, axit béo và nhiều chất hydroperoxide thơm,
peroxynitrite. Những enzyme chống oxy hóa phổ biến và cao, biểu hiện ở
nhiều sinh vật bao gồm cả thực vật, vi khuẩn và động vật có thể có tối đa
1% hoặc nhiều hơn các protein tế bào [1].
Peroxidase là enzyme thực vật có khả năng sử dụng H2O2 để oxi hóa
một số chất cho quá trình chuyển hóa trung gian, đặc biệt là hợp chất phenol.
Những enzyme này được định vị trên thành tế bào và không bào [12].
Peroxidase là các enzyme đa chức năng, điển hình của thực vật, xúc
tác quá trình oxy hóa của các phân tử nhỏ. Peroxidase thành tế bào chủ yếu
liên quan đến sự quyết định tính chất cấu trúc và bảo vệ thành tế bào thực
vật, như sinh tổng hợp ligin và suberin. Nó cũng liên qua đến dị hóa auxin,
trong sự trao đổi chất thứ cấp.

12


1.4.2. Gen mã hóa peroxidase (Prx)
Prx gồm các gen mã hóa enzyme peroxidase đã được công bố trên
ngân hàng gen quốc tế, bao gồm: Prx, Prx1, Prx2, Prx3, Prx4…
Theo Kumar và cộng sự (2007) gen mã hóa Prx đã được phân lập từ
cây dừa cạn có 1357 nucleotide, trong đó vùng mã hóa dài 1033 nucleotide.
Vùng mã hóa gồm 993 nucleotide mã hóa một polypeptide gồm 330 amino
acid với 21 amino acid của peptide tín hiệu. Khối lượng phân tử của protein
suy diễn này được tính là 37,43kDa [1], [16].
Để có được một cái nhìn sâu sắc về trình tự hoàn chỉnh của CrPrx,
Kumar và cộng sự (2007) đã thực hiện PCR bằng cách sử dụng cặp mồi

của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật, …) làm cho gen lạ có thể
tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế
bào chủ các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới
việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen. Gen chuyển phải
được di truyền cho thế hệ sau và ở mỗi thế hệ sản phẩm biểu hiện của gen
phải thể hiện được chức năng sinh học [6].
Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, khẳng định
tính khách quan tự nhiên của vật chất di truyền, khả năng mã hóa cho các
tính trạng nhất định, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền.
Thông qua chuyển gen các nhà sinh lý, hóa sinh và di truyền học có thể

14


nghiên cứu các quá trình điều khiển, thể hiện và ảnh hưởng của các yếu tố
di truyền và ngoại cảnh lên hoạt động của gen.
Có nhiều phương pháp chuyển gen ở thực vật nhưng có thể phân loại
thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen trực tiếp và
phương pháp chuyển gen gián tiếp.
Phương pháp chuyển gen trực tiếp thường được sử dụng là chuyển
gen bằng súng bắn gen (gene gun). Với ưu điểm là thao tác dễ dàng, bắn
một lần được nhiều tế bào và nguyên liệu để bắn đa dạng, trong những năm
gần đây phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen đã được áp dụng
thành công trên lúa, mía, đu đủ, bông. Nhưng phương pháp này đòi hỏi chi
phí thiết bị đắt tiền và có nhiều bản sao trong gen biến nạp được chuyển
vào tế bào cùng lúc gây khó khăn trong việc phân tích biểu hiện gen, dẫn
đến sự biểu hiện của các gen không bền vững.
Phương pháp chuyển gen gián tiếp được sử dụng phổ biến là chuyển
gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
được nghiên cứu từ những năm 1960 – 1970. Việc phát hiện ra

vincristine ở cây dừa cạn
1.6.1. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine
ở cây dừa cạn bằng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật
Marfori và Alejar (1993) đã nghiên cứu khả năng sản xuất alkaloid
của những mô sẹo có nguồn gốc từ rễ, thân, lá và hoa của hai giống
C.roseus, trắng và hồng tím. Nghiên cứu chỉ ra rằng, sự thay đổi hàm lượng
alkaloid trong mô sẹo có nguồn gốc từ lá, rễ và hoa của giống dừa cạn hoa
hồng tím và giống hoa trắng phụ thuộc vào nguồn gốc mô sẹo từ lá, rễ hay
hoa và hàm lượng alkaloid ở mô sẹo có nguồn gốc từ rễ của giống dừa cạn
Hoa hồng tím cao hơn ở giống hoa trắng [18].
Zhao và cs (2001) đã thử nghiệm nhiều chất cảm ứng của nấm nhận
được từ 12 loại nấm và ảnh hưởng của chúng lên việc cải thiện sản xuất

16


indole alkaloid ở huyền phù tế bào cây dừa cạn. Kết quả cho thấy, các chất
cảm ứng khác nhau thì kích thích sự tổng hợp khác nhau của các indole
alkaloid (ajmalicine, catharanthine và serpentine), cao hơn từ 2 đến 5 lần so
với đối chứng [23].
Ở Việt Nam, nghiên cứu về cây dừa cạn bắt đầu được công bố vào
năm 2006 với công trình của Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng: “Ảnh hưởng
của chất điều hòa tăng trưởng thực vật và đường saccharose lên dịch nuôi
cấy huyền phù tế bào dừa cạn Catharanthus roseus” [3]. Năm 2011, Đào
Hùng Cường, Lê Xuân Văn đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của
cây dừa cạn bằng phương pháp tách chiết Alkaloid. Bằng việc sử dụng
phương pháp sắc kí lỏng khối phổ (LC – MS) đã xác định được 2 alkaloid
quan trọng là vinblastine và vincristine từ rễ cây dừa cạn hoa hồng [4].
1.6.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và
vincristine ở cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen

mẫu phân tích được coi là dương tính. Tuy nhiên, PCR dương tính không
đồng nghĩa với chuyển gen thành công, vì có nhiều cách để giải thích sự có
mặt của DNA trong mẫu phân tích: (1) Vi khuẩn A. tumefaciens mang gen
chuyển có thể còn tồn tại trong khối mô hay trong các gian bào của mẫu
phân tích. Hiện tượng này xuất hiện ở nhiều loại đối tượng và được gọi là
dương tính giả. Nếu mẫu phân tích của thực vật đã qua nhân giống hữu tính
tức đã qua một vài thế hệ thì hiện tượng này được loại trừ. (2) Gen chuyển
tồn tại tự do trong tế bào chất (có thể biến mất qua sinh sản hữu tính). (3)
Gen chuyển không hoạt động, tức không được phiên mã và biểu hiện ra
protein có chức năng sinh học. Chính vì những lý do trên mà kết quả PCR
mới chỉ có giá trị định hướng ban đầu khi phân tích cây chuyển gen.
Tuy nhiên, kỹ thuật PCR lại tỏ ra hữu dụng đối với việc phân tích
phát hiện các mẫu lương thực thực phẩm biến đổi gen (genetic modify
origanism-GMO). Để phục vụ việc xác định GMO, PCR còn được phát
triển thành kỹ thuật multiplex PCR (MPCR). Với việc sử dụng đồng thời

18


nhiều cặp mồi nhận biết các gen khác nhau (promoter, teminator, gen chọn
lọc, gen đích… ) trong một phản ứng, MPCR cho phép phát hiện đồng thời
nhiều trình tự đích nếu mẫu có mang các gen đó. Thông thường các cặp
mồi được sử dụng trong multiplex PCR là mồi P35S, TNOS, NPT-II, GUS,
EPSPS. Nếu kết quả dương tính với bất cứ cặp mồi nào thì mẫu cần xác
định rất có thể đã được chuyển gen.

19


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex
(Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, máy PCR System 9700
(Appied Biosystem, Mỹ) và một số thiết bị khác tại Phòng công nghệ
DNA ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 09 năm 2015, chuyển gen ở cây
dừa cạn được tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ tế bào, khoa Sinh
học, Trường Đại học Sư phạm, đại học Thái Nguyên.
Thí nghiệm phân tích cây chuyển gen được tiến hành tại phòng Công
nghệ ADN ứng dụng, phòng Công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện Công
nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Đề tài nghiên cứu được hoàn thành tại Khoa Công nghệ Sinh học,
trường Đại học Khoa Học, Đại học Thái Nguyên.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nuôi cấy in vitro và chuyển gen vào cây dừa cạn dựa
trên “Nghiên cứu quy trình chuyển gen Gus ở cây dừa cạn” của Bùi Thị Hà
và cộng sự (2016).[9]
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro
Thu mẫu và xử lí mẫu: Quả sau khi thu về được phơi khô 2 – 3 ngày,
sau đó tách lấy hạt. Cho hạt vào ống falcon 50ml lắc nhiều lần để rửa sạch
hạt trước khi tiến hành vào mẫu.
Khử trùng hạt: Hạt dừa cạn được khử trùng bằng cồn 70% trong 1
phút, javen 60% lắc đều trong 15 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất khử
trùng 3 đến 4 lần. Hạt dừa cạn sau khi khử trùng được cấy vào môi trường
dinh dưỡng MS cơ bản, bổ sung thêm sucrose 30 g/ l và agar 8 g/ l.

21