BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THU HƢƠNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA MỘT SỐ
DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC
MANG KHUNG INDOL HƢỚNG ỨC CHẾ
ENZYM HISTON DEACETYLASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THU HƢƠNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA MỘT SỐ
DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC
MANG KHUNG INDOL HƢỚNG ỨC CHẾ

Hà Nội, ngày 31 tháng 03 năm 2017
Học viên

Phạm Thu Hương


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3
1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) .............................................................. 3
1.1.1. Cấu trúc nhiễm sắc thể và histon ................................................................ 3
1.1.2. Khái niệm về Histon Deacetylase .............................................................. 3
1.1.3. Phân loại HDAC......................................................................................... 4
1.1.4. Cấu trúc của HDAC ................................................................................... 5
1.1.5. Mối quan hệ giữa HDAC và ung thƣ ......................................................... 6
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDIs) .............................................................. 8
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC ............................................................... 8
1.2.2. Cơ chế tác dụng của các HDIs ................................................................... 9
1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC ........................................................ 10
1.3. MỘT SỐ THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP ACID
HYDROXAMIC MANG KHUNG INDOL TRÊN THẾ GIỚI ............................ 12
1.3.1. Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC ..... 12
1.3.2. Một số thiết kế nghiên cứu và tổng hợp acid hydroxamic mang khung
indol trên thế giới ............................................................................................... 12
1.4. CÁC PHẢN ỨNG DÙNG TRONG TỔNG HỢP CÁC DẪN CHẤT ACID
HYDROXAMIC MANG KHUNG INDOL.......................................................... 20

4.2.1. Phổ hồng ngoại (IR) ................................................................................. 51
4.2.2. Phổ khối (MS) .......................................................................................... 53
4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR)................................. 53
4.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC ............................................................................... 57
4.3.1. Tác dụng ức chế HDAC2 ......................................................................... 57
4.3.2. Tác dụng thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ ........................................ 59
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AsPC-1

: Tế bào ung thƣ tuyến tụy

Boc

: tert-butyloxycarbonyl

13

: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C

DCM

: Dicloromethan

DMF


HDI, HDIs

: Histon deacetylase Inhibitor(s)

Hep G2

: Tế bào ung thƣ gan

HT1080

: Tế bào u sợi

IR

: Phổ hồng ngoại

K562

: Tế bào ung thƣ máu

Lovo

: Tế bào ung thƣ đại tràng

MCF-7

: Tế bào ung thƣ vú

MDA435



SAHA

: Acid suberoylanilid

SW620

: Tế bào ung thƣ đại tràng

TSA

: Trichostatin A

TCA

: Tricloroacetic

U266

: Tế bào đa u tủy


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại các chất ức chế HDAC ............................................................... 8
Bảng 1.2: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC và kháng tế bào ung thƣ
in vitro của N-hydroxycinnamamid có vòng indol. .................................................. 13
Bảng 1.3: Kết quả đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro của Nhydroxybenzamid có vòng indol. .............................................................................. 14
Bảng 1.4: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC và kháng tế bào ung thƣ
in vitro của dẫn chất 3. .............................................................................................. 16
Bảng 1.5: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC

của các dẫn chất VIIa-c với SAHA .......................................................................... 57
Hình 4.5 : Biểu đồ so sánh hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất Vb-c
và VIIa-c với SAHA trên 4 dòng tế bào thử nghiệm ............................................... 60


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Cơ chế phản ứng thế ái nhân SN2 ............................................................ 20
Sơ đồ 2.1: Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất
acid hydroxamic mang khung indol. ......................................................................... 24
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất IIIa ......................................................... 28
Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp chất IIa ..................................................................... 28
Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp chất IIIa ................................................................... 29
Sơ đồ 3.4: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất IIIb ......................................................... 31
Sơ đồ 3.5: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất IIIc.......................................................... 32
Sơ đồ 3.6: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Va ........................................................... 33
Sơ đồ 3.7: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Vb ........................................................... 34
Sơ đồ 3.8: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Vc ........................................................... 35
Sơ đồ 3.9: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất VIIa ........................................................ 36
Sơ đồ 3.10: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất VIIb ...................................................... 37
Sơ đồ 3.11: Sơ đồ tổng hợp chất VIIc ...................................................................... 38
Sơ đồ 4.1: Cơ chế phản ứng thế ái nhân alkyl tạo IIa-c, IVa-c và VIa-c. ............... 50
Sơ đồ 4.2: Cơ chế phản ứng tạo thành IIIa-c, Va-c và VIIa-c ................................ 51


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thƣ đang trở thành một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong
trên toàn cầu cũng nhƣ tại châu Á và Việt Nam. Theo thống kê của Tổ chức nghiên
cứu ung thƣ thế giới IARC, trong năm 2012, có khoảng 14 triệu trƣờng hợp ung
thƣ đƣợc phát hiện mới và có đến 8,2 triệu ca tử vong liên quan đến ung thƣ. Dự
tính từ nay đến năm 2030, mỗi năm sẽ có thêm 22 triệu trƣờng hợp mới mắc bệnh

của các dẫn chất tổng hợp đƣợc trên một số dòng tế bào ung thƣ ngƣời.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC)
1.1.1. Cấu trúc nhiễm sắc thể và histon
Nhiễm sắc thể là một phức hợp đại phân tử protein-ADN đƣợc tổ chức cao,
có cấu trúc động, bao gồm ADN, các protein histon và protein không phải histon.
Histon là các protein cơ bản giàu acid amin nhƣ lysin, arginin, đƣợc chia thành
5 nhóm chính (H1, H2A, H2B, H3, H4). Từng cặp của H2A, H2B và H3, H4 cùng
nhau tạo nên lõi protein octomer hình đĩa. Lõi protein này đƣợc quấn quanh bởi
146 cặp ADN tạo nên nucleosom (hình 1.1). Các nucleosom nối với nhau nhờ
phần amino tận của các histon. Bốn cặp histon lõi có 2 phần quan trọng: phần đuôi
C nằm bên trong lõi của nucleosome và phần đầu N với acid amin kết thúc là lysine
nằm bên ngoài nucleosome [30]. Đầu amin này mang nhiều điện tích dƣơng nên
tƣơng tác mạnh với phần phosphate mang điện âm trên phân tử ADN tạo nên cấu
trúc nucleosome và các cấu trúc bậc cao hơn của nhiễm sắc thể.
Việc tích điện dƣơng của chiston mạnh hay yếu thông qua quá trình acetyl
hóa đầu amin ở phần đuôi của histon. Ở dạng deacetyl hóa, histon tích điện dƣơng
lớn, tƣơng tác điện tích với ADN mạnh làm đóng xoắn nhiễm sắc thể gây ức chế
quá trình dịch mã và tổng hợp protein, ức chế biểu hiện gen. Ngƣợc lại, khi bị
acetyl hóa, điện tích dƣơng bị trung hòa, nhiễm sắc thể đƣợc tháo xoắn, quá trình
tổng hợp protein diễn ra và đặc tính của gen đƣợc biều hiện. Trong tế bào, quá trình
acetyl hóa này đƣợc điều hòa bởi 2 enzym: histon acetyltransferase (HAT) và
histon deacetylase (HDAC) [1,22,40,43].
1.1.2. Khái niệm về Histon Deacetylase
Histon Deacetylase là một nhóm các enzym xúc tác quá trình loại bỏ nhóm
acetyl từ ε-N-acetyl lysine amino acid của histon. HDAC có tác dụng đối lập với

1.1.4. Cấu trúc của HDAC
Việc xác định cấu trúc của HDAC là rất cần thiết kế công thức cho các chất
ức chế HDAC. Về cơ bản, cấu trúc của các HDAC khá giống nhau đều có trung
tâm hoạt động gồm 2 phần chính: ion Zn2+, kênh enzym dạng túi hình ống.
- Ion Zn2+ là coenzym của HDAC nằm ở trung tâm xúc tác của chúng. Đây là
thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với đuôi histon bằng liên kết phối trí. Thông
thƣờng các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức chế
HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [21,26,49].
- Kênh enzym là nơi chứa đựng cơ chất và tạo nhiều liên kết Van der Waals
với cơ chất. Kênh có dạng túi hình ống hẹp, đƣợc cấu tạo từ các acid amin thân dầu:
Phe, Tyr, Pro, His. Cấu trúc túi rất linh động, có thể biến đổi để phù hợp với chiều
dài của các cơ chất khác nhau. Trên miệng túi có 1 vành nhỏ đƣợc tạo nên từ 1 vài
vòng xoắn protein (phần vành sẽ tƣơng tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC).
Đối với các hợp chất acid hydroxamic chiều dài của kênh này là tối ƣu với khoảng
5


5-6 liên kết carbon [21,26,40].
1.1.5. Mối quan hệ giữa HDAC và ung thƣ
HAT acetyl hóa histon làm trung hòa cực dƣơng trên lysin và giúp tháo
xoắn cấu trúc của nucleosom, do đó giúp cho các nhân tố sao mã dễ dàng tiếp cận
ADN. Ngƣợc lại, các HDAC xúc tác loại bỏ nhóm acetyl từ histon và protein
không phải histon, làm tăng sự tích điện dƣơng trên đầu N của histon và đóng xoắn
nhiễm sắc thể, kết quả là ức chế quá trình phiên mã do ngăn cản các nhân tố sao mã
tiến đến đích của chúng trên ADN. Nhƣ vậy, sự acetyl hóa và deacetyl hóa nhiễm
sắc thể đóng vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình biểu hiện gen. Việc mất
cân bằng hoạt động giữa HAT và HDAC có thể dẫn đến những bất thƣờng biểu
hiện gen và do đó dẫn đến ung thƣ [11,22,23,27,30].
Hoạt động của HAT liên quan đến sự di chuyển, xâm lấn, sự biểu thị quá
mức hoặc sự đột biến trong rất nhiều loại ung thƣ kể cả ung thƣ máu và ung thƣ


Hình 1.3: Vai trò sinh học của các HDAC trong hoạt động tế bào ung thư
Có thể thấy rằng việc ức chế phiên mã bị ảnh hƣởng bởi sự gia tăng hoạt
động của HDAC và có thể kiểm soát ung thƣ bằng cách ức chế HDAC. Nhiều công
trình nghiên cứu trên thế giới đã và đang đƣợc triển khai nhằm tìm kiếm các chất
ức chế HDAC - một mục tiêu phân tử rất hấp dẫn trong điều trị ung thƣ.

7


1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDIs)
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC
Các chất ức chế HDAC đang đƣợc nghiên cứu rộng rãi, cho đến nay, chúng
đƣợc biết đến với bốn nhóm chính sau: [2]
- Các benzamid: MS-275, CI-994.
- Các tetrapeptid vòng: trapoxin, apicidin và depsipeptid.
- Các acid béo chuỗi ngắn: 4-phenylbutyrat, acid valproic.
- Các acid hydroxamic: SAHA, pyroxamid, TSA, oxamflatin và các CHAP
(acid hydroxamic mang peptid vòng).
Bảng 1.1: Phân loại các chất ức chế HDAC
Chất

Cấu trúc

Chất

Cấu t r ú c

Các acid hydroxamic
TSA (Trichostatin A)


Depsipeptid
HN
O

(FK-228)

CH3
O

H
N

NH

S
S

Acipidin
CH3
CH3

H3C

O
HN

O

CH3

butyrat

Mỗi nhóm có những hạn chế riêng: các acid hydroxamic là những chất bị
chuyển hóa nhanh và ức chế không chọn lọc các HDAC; các benzamid và các acid
béo có hiệu lực hạn chế, trong khi các peptid vòng gây ra sự chảy máu khó chữa
[20].
1.2.2. Cơ chế tác dụng của các HDIs
Các chất ức chế HDAC tác động lên tế bào ung thƣ theo ba cơ chế chủ yếu:
[2]
- Các chất ức chế HDAC tác động lên những tế bào bình thƣờng và tế bào
ung thƣ với cùng mức độ gây ra G2 checkpoint (vị trí mà tại đó chu trình tế bào
tạm thời dừng lại, chờ đến khi các điều kiện trở nên phù hợp thì chu trình lại tiếp
tuc). Những tế bào bình thƣờng trải qua G2 checkpoint và tiếp tục phát triển, trong
khi đó những tế bào ung thƣ tái tạo ADN tạo thành dạng 4nADN và chuyển sang
giai đoạn gây chết tế bào theo chƣơng trình.
- Các chất ức chế HDAC tác động lên các tế bào ung thƣ gây ra sự ngừng tế
bào ở pha G1, kết quả là gây ra sự biệt hóa tế bào ung thƣ.
- Các chất ức chế HDAC tác động lên các tế bào ung thƣ làm tăng tính sinh
miễn dịch của tế bào ung thƣ và ức chế sự tạo mạch.

9


Hình 1.4: Các chất ức chế HDAC điều hòa sự phát triển tế bào theo 3 cơ chế.
Nhƣ vậy, các chất ức chế HDAC có tác dụng chống ung thƣ do tác động lên
nhiều giai đoạn quan trọng của chu trình tế bào làm mất sự điều hòa trong tế bào ác
tính. Trong đó, yếu tố then chốt quyết định hoạt tính chống ung thƣ của HDIs là
thúc đẩy sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào. Ngoài
tác dụng trực tiếp lên sự phát triển và sống sót của tế bào ung thƣ, các chất ức
chế HDAC còn tác dụng gián tiếp đến sự phát triển khối u. Các chất ức chế HDAC

11


1.3. MỘT SỐ THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP ACID
HYDROXAMIC MANG KHUNG INDOL TRÊN THẾ GIỚI
1.3.1. Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC
Acid hydroxamic là nhóm chất ức chế HDAC đƣợc nghiên cứu rộng rãi
nhất, với nồng độ ức chế nằm trong khoảng micromol đến nanomol.Các chất ức chế
HDAC dựa trên cấu trúc amid-alkyl- acid hydroxamic đã đƣợc biết đến nhiều (ví dụ
SAHA). Cấu trúc của nhóm chất này gồm 3 phần chính nhƣ sau [29]:
- Nhóm khóa hoạt động liên quan đến tính đặc hiệu và hiệu lực ức chế
enzyme HDAC, thƣờng là các aryl, các nghiên cứu về các chất tổng hợp đƣợc cho
thấy kích thƣớc vòng nhân thơm lớn sẽ cho tác dụng tốt hơn vòng nhỏ.
- Cầu nối sơ nƣớc: liên quan đến khả năng ức chế enzym, quyết định sự phù
hợp về cấu trúc của các chất với chiều dài của kênh enzyme. Phần này thƣờng có
cấu trúc amid-alkyl, là các hydrocarbon mạch hở hoặc các vòng thơm có kích thƣớc
nhỏ. Trong cầu nối liên kết amid là quan trọng nhƣng không phải là then chốt, độ
dài mạch carbon tối ƣu là 5 - 6C.
- Nhóm gắn kết với Zn2+: acid hydroxamic, là phần không thể thiếu để có tác
dụng ức chế HDAC.
1.3.2. Một số thiết kế nghiên cứu và tổng hợp acid hydroxamic mang khung
indol trên thế giới
Nhƣ trên đã đề cập đến, các acid hydroxamic có hiệu lực ức chế HDAC
tốt song chúng có nhƣợc điểm là ức chế không chọn lọc và nửa đời in vivo ngắn.
Chính vì vậy, rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đang nỗ lực tìm kiếm các
dẫn chất mới dựa trên phiên mẫu của TSA, SAHA và các chất đã tìm đƣợc. Dựa
trên đặc điểm cấu trúc của các chất ức chế HDAC dẫn chất hydroxamic, các
nghiên cứu có thể tiến hành thay đổi một trong 2 phần cấu trúc: nhóm khóa
hoạt động hoặc cầu nối.
Trong khi đó dị vòng indol giữ vai trò quan trọng không chỉ trong hóa học

R

IC50

IC50

(μM)

(μM)

HDAC U937
Chất

R

IC50

IC50

(μM)

(μM)

1a

1,08

1,8

1h


0,19

2,3

Năm 2015, các nhà khoa học này cũng đã tiếp tục thiết kế và tổng hợp các
acid hydroxamic chứa nhóm khóa hoạt động indol. Tuy nhiên, trong cấu trúc
thay N-hydroxycinnamamid bằng N-hydroxybenzamid và thu đƣợc kết quả rất
khả quan. Trong dãy chất tổng hợp đƣợc, chất 2r và 2l có hoạt tính kháng ung
thƣ in vitro tƣơng đƣơng hoặc tốt hơn SAHA, đặc biệt là dẫn chất 2r [24].
Bảng 1.3: Kết quả đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro
của N-hydroxybenzamid có vòng indol.

14


Chất

IC50 (μM)

R

U937

U266

HCT116

PC3


Cùng mục tiêu tìm ra cầu nối và nhóm khóa hoạt động thích hợp, các nhà
khoa học thuộc viện dƣợc phẩm và hiệp hội hóa học Trung Quốc đã nhận thấy trong
những năm gần đây, rất nhiều các hợp chất đƣợc tổng hợp mang vòng indol có hoạt
tính chống tăng sinh đối với các tế bào ung thƣ. Ngoài ra, một số chất ức chế
HDAC chứa vòng indol có vai trò nhƣ một nhóm khóa hoạt động cũng cho thấy
tiềm năng trong điều trị ung thƣ. Đồng thời, sự có mặt của vòng triazol làm tăng sự
tƣơng tác của hợp chất với HDAC. Từ những ý tƣởng đó, các dẫn chất acid
hydroxamic có vòng indol đƣợc nối với N-hydroxyarylamid bằng vòng triazol đƣợc
thiết kế và tổng hợp. Đánh giá in vitro hoạt tính sinh học, hầu hết các hợp chất tổng
hợp đều cho thấy tác dụng chống ung thƣ đầy hứa hẹn. Trong đó dẫn chất 3 có hoạt
tính ức chế HDAC và chống tăng sinh tế bào ung thƣ mạnh hơn so với SAHA. Dẫn
chất này thể hiện chống tăng sinh tế bào ung thƣ mạnh với giá trị IC50 từ 3,57-6,21
mmol/L đối với mỗi thử nghiệm tế bào ung thƣ, trong khi giá trị này ở SAHA là
4,95-7,11 mmol/L. Ngoài ra, kết quả còn cho thấy khi có mặt nhóm thế 5-OCH3
trên vòng indol sẽ làm tăng hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ. Tiếp tục, hầu hết các
dẫn chất tổng hợp đƣợc đánh giá invitro hoạt tính ức chế HDAC1, HDAC6 và
HDAC8 đều đem lại kết quả rất khả quan, đặc biệt là tác dụng đối với HDAC1.
Trong đó dẫn chất 3 có IC50 /HDAC1 là 0,078 mmol/L, nhỏ hơn 4 và 5 lần so với
15