BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUYỀN
TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ
BÀO UNG THƢ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT
2- ARYL-4-QUINAZOLINON
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM
VÀ BÀO CHẾ THUỐC
MÃ SỐ: 60720402
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Văn Thị Mỹ Huệ
TS. Lê Nguyễn Thành
HÀ NỘI 2014
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: TS. Văn Thị
Mỹ Huệ và TS. Lê Nguyễn Thành là những ngƣời cô, ngƣời thầy đã tận tình hƣớng
dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và động viên em trong suốt quá trình thực hiện luận
văn này.
Em cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của: TS. Nguyễn Minh Hằng, TS.
Cao Bích Huệ, ThS. Đào Đình Cƣờng, cử nhân Trần Hữu Giáp, cử nhân Nguyễn Anh
Dũng, cử nhân Hà Thị Thoa, cử nhân Nguyễn Thị Tú Oanh (Trung tâm nghiên cứu và
phát triển thuốc - Viện hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam), các thầy cô giáo Bộ môn Hóa hữu cơ cùng các thầy cô giáo trong các Bộ môn,
phòng ban, thƣ viện - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhƣng do hạn chế về thời gian, kiến thức cũng nhƣ
tài liệu tham khảo nên luận văn của em không thể tránh khỏi những sai sót trong nội
dung và hình thức, em rất mong nhận đƣợc sự góp ý của các thầy cô để luận văn của
1.2.4. Phản ứng ngƣng tụ anthranilamid và aldehyd 13
CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 15
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI 15
2.2. THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM 16
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.3.1. Phƣơng pháp tổng hợp 2- aryl-4-quinazolinon 16
2.3.2. Phƣơng pháp tinh chế và xác định cấu trúc 16
2.3.3. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng tế bào ung thƣ 17
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19
3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC 19
3.1.1. Tổng hợp dẫn chất trung gian 2-amino benzamid 21
3.1.2. Tổng hợp dẫn chất trung gian aldehyd thơm 24
3.1.3. Tổng hợp dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon (14a-k; 15a-c) 25
3.2. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT, KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 35
3.2.1. Kiểm tra độ tinh khiết 35
3.2.2. Khẳng định cấu trúc 37
3.3. THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ 44
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 46
4.1. VỀ TỔNG HỢP HÓA HỌC 46
4.1.1. Tổng hợp dẫn chất trung gian 2-amino benzamid và khẳng định cấu
trúc 46
4.1.2. Tổng hợp dẫn chất trung gian aldehyd thơm và khẳng định cấu trúc 48
4.1.3. Tổng hợp dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon (14a-k; 15a-c) 48
4.2. VỀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 50
4.2.1. Phổ hồng ngoại( IR) 50
4.2.2. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ATCC
Tiêu chuẩn Mỹ (the American Type Culture Collection )
13
C-NMR
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
1
H-NMR
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton
CTCT
Công thức cấu tạo
CTPT
Công thức phân tử
ppm
Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu)
DCM
Dicloromethan
DMAC
N,N-dimethylacetamid
DMEM
Human breast carcinoma - tế bào ung thƣ vú
MIC
Nồng độ ức chế tối thiểu
MOM
Methoxy methyl
MS
Phổ khối lƣợng (Mass Spectrometry)
MTT
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid
PMB
p-Methoxylbenzyl
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
TLC
Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography)
T
nc
Nhiệt độ nóng chảy
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
TT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 3.1
Kết quả tổng hợp các dẫn chất 14a-k và 15a-c
35
2
Bảng 3.2
trên 4 dòng tế bào ung thƣ ngƣời.
45, 57
8
Bảng 4.1
Phổ
1
H-NMR của các dẫn chất trung gian 4, 6, 11
48
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
HÌNH VẼ
TT
Tên hình
Trang
1
Hình 1.1
Cấu trúc hợp chất 7,8-dimethoxy-2-methyl-3-(4,5-
7
8
Hình 1.8
Cấu trúc hợp chất 2- (naphtalen-1-yl)-6-pyrrolidinyl-4-
quinazolinon
8
9
Hình 1.9
Cấu trúc hợp chất 2- aryl-6-substituted quinazolinon
8
10
Hình 1.10
Cấu trúc của dẫn chất Ratitrexed
9
11
Hình 1.11
Cấu trúc của hợp chất Methaqualon
9
12
Hình 4.1
Phổ hồng ngoại của chất 15c
51
13
Hình 4.2
a)Phổ
1
H-NMR; b) Phổ
1
H-NMR giãn rộng của chất 15c
52, 53
3
Sơ đồ 1.3
Phản ứng tổng hợp Niementowski V cải tiến
11
4
Sơ đồ 1.4
Phản ứng tổng hợp của Patel V.S và Patel S.R
11
5
Sơ đồ 1.5
Phản ứng tổng hợp của Shishoo C.J và cộng sự
12
6
Sơ đồ 1.6
Phản ứng tổng hợp của Hour M. J. và cộng sự
12
7
Sơ đồ 1.7
Phản ứng ngƣng tụ anthranilamid và benzoyl clorid cải
tiến
13
8
Sơ đồ 1.8
Phản ứng tổng hợp của Hour M. J. và cộng sự
13
9
Sơ đồ 1.9
Phản ứng tổng hợp của Na Yeun Kim và Cheol-Hong
Cheon
14
Sơ đồ 4.1
Cơ chế tổng hợp các chất 2-aryl-4-quinazolinon
49
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay tỷ lệ mắc các bệnh ung thư có xu hướng gia tăng ở hầu hết các quốc
gia trên thế giới, đứng thứ hai sau bệnh tim mạch ở các nước phát triển [4]. Theo tổ
chức Y tế Thế giới ước tính trên toàn cầu có khoảng 20 triệu người đang mắc ung thư,
trong đó có khoảng 6 triệu người chết hàng năm. Tỷ lệ chết do ung thư chiếm 12%
trong các nguyên nhân gây tử vong ở người. Cùng xu hướng trên thế giới thì tại Việt
Nam theo ước tính có đến 150.000 ca mới mắc và khoảng 75.000 người chết vì ung
thư hàng năm [3].
Trong quá trình tìm kiếm các thuốc chống ung thư mới, nhiều nghiên cứu hiện
nay tập trung vào việc tìm kiếm các chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư [24]. Một
trong những dãy hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào được chú ý hiện nay là dãy hợp
chất 3-arylisoquinolinon được phát hiện vào những năm cuối thế kỷ 19 [9]. Dựa trên
CO
OCH
3
O
O
(IC
50
= 0,2 nM, SKMEL-2)
Hình 1.1: Cấu trúc hợp chất 7,8-dimethoxy-2-methyl-3-(4,5-methylendioxy-2-
vinylphenyl)isoquinolin-1(2H)-on.
Trong quá trình tìm kiếm chất chống ung thư mới, Cho và cộng sự đã sử dụng
hợp chất 7,8-dimethoxy-2-methyl-3-(4,5-methylendioxy-2-vinylphenyl)-isoquinolin-
1(2H)-on làm chất dẫn đường để tổng hợp các dẫn chất 3-arylisoquinolinon. Trong
nghiên cứu này, Cho và cộng sự đã tổng hợp được 12 dẫn chất 3-arylisoquinolinon,
trong đó có 6 hợp chất có tác dụng sinh học trên cả 5 dòng tế bào ung thư thử nghiệm
gồm: ung thư phổi, ung thư buồng trứng, khối u ác tính, ung thư đại tràng, khối u thần
kinh trung ương [10].(Hình 1.2) 3
NH
O
R
1
R
2
R
R
2
= R
3
= R
4
= H; R
5
= PMB (p-
methylbenzyl); và hợp chất có nhóm thế R
2
= CH
3;
R
1
= R
3
= R
4
= H; R
5
= PMB là 2
hợp chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư cao trên cả 3 dòng tế bào ung thư với IC
50
từ 2,37μg/ml đến 13,27μg/ml [8].
NH
O
R
1
Trên thế giới cũng có rất nhiều nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế
bào ung thư của các dẫn chất 3-arylisoquinolinon. Trong một thử nghiệm in vitro trên
5 dòng tế bào ung thư người (phổi, buồng trứng, khối u ác tính, đại tràng và thần kinh
trung ương), các dẫn chất 3-arylisoquinolinon có tác dụng kháng tế bào ung thư tốt
[10, 11]. Một trong những dẫn chất của 3-arylisoquinolinon có hoạt tính sinh học cao
đó là dẫn chất 3-napthalenylisoquinolinon [6]. Một số dẫn xuất 3-arylisoquinolinon có
tác dụng chống khối u rất tốt tương tự như các thuốc chống lại sự tăng sinh của khối u
4
ác tính [17,18]. Bên cạnh dẫn chất chứa vòng thơm ở vị trí số 3 của vòng quinazolinon
các dị vòng khác có đặc tính thơm như: thiophen, pyridin, furan cũng có hoạt tính
kháng tế bào ung thư [18].(Hình 1.4)
NH
O
Y
1
Y
2
R
5
R
4
R
3
R
2
R
1
NH
,
Ar: Thiophenyl;
pyridinyl; furanyl
Hình 1.4: Cấu trúc một số dẫn chất 3-arylisoquinolinon có hoạt tính chống ung
thƣ cao
Đặc biệt tác giả Kazuo Hatturi và cộng sự ở công ty dược phẩm Chugai, Nhật
Bản cũng đã tổng hợp và đăng ký bản quyền về dãy hợp chất 3-arylisoquinolinon với
hoạt tính chống ung thư. Nhóm hợp chất tổng hợp được thử tác dụng sinh học trên tế
bào ung thư trực tràng và thể hiện tác dụng rất cao ở nồng độ IC
50
khoảng 1 nanomol
(Hình 1.5) [15,16].NH
O
(H
3
C)
2
N
NH
O
(H
3
C)
2
N
NH
Hình 1.5: Cấu trúc nhóm hợp chất 3-arylisoquinolinon có tác dụng trên
dòng tế bào ung thƣ trực tràng HCT 116
Như vậy, dãy các hợp chất 3-arylisoquinolinon đã và đang được nhiều nhà khoa
học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu nhằm tìm ra các hợp chất có hoạt tính kháng
tế bào ung thư mới để ứng dụng trong điều trị.
5
1.1.2. Phát triển khung 3-arylisoquinolinon thành 2-aryl-4-quinazolinon
Với mục tiêu tìm kiếm các chất có hoạt tính chống ung thư, luận văn sử dụng
phương pháp nhóm thế đẳng cấu sinh học trong thiết kế thuốc để phát triển cấu trúc
hóa học của dẫn chất 3-arylisoquinolinon. Phương pháp nhóm thế đẳng cấu sinh học là
một phương pháp tiếp cận thay đổi chất dẫn đường, hoặc thay đổi trong quá trình
chuyển hóa thuốc mà không làm thay đổi nhiều về mặt cấu trúc hóa học [2,20]. Trong
lĩnh vực nghiên cứu và phát triển thuốc, nhóm thế đẳng cấu sinh học đã trở thành một
trong các công cụ được ứng dụng rất có hiệu quả để thiết kế cấu trúc. Sở dĩ như vậy là
vì sự thay thế bằng các nhóm đẳng cấu sinh học thường đem lại các chất có hoạt tính
sinh học khá tương tự nhau nhưng lại có sự khác nhau rõ rệt về các tính chất lí hóa học
khác như độ phân cực, độ bền hóa học, v.v… Cho đến nay nhóm đẳng cấu sinh học
thường được coi là những nhóm hoặc chất có tính chất lý hóa học tương tự nhau và có
một loại hoạt tính sinh học tương tự nhau [2].
Hiện nay có 6 kiểu thay thế hay được áp dụng trong phương pháp sử dụng
nhóm đẳng cấu sinh học cho thiết kế cấu trúc, bao gồm: thay thế nguyên tử hoặc nhóm
có hóa trị 1, thay thế nguyên tử hoặc nhóm có hóa trị 2, thay thế nguyên tử hoặc nhóm
có hóa trị 3, thay thế bằng các vòng tương đương, thay thế bằng các nhóm có độ phân
cực tương tự nhau, và thay thế bằng các nhóm chức có cấu trúc đảo ngược [2].
Phương pháp thay thế bằng vòng tương đương được coi là các nhóm đẳng cấu
sinh học của nhau (các vòng đẳng cấu sinh học), là một trong các kỹ thuật thiết kế cấu
trúc được sử dụng phổ biến nhất đặc biệt hiệu quả. Có thể tìm thấy rất nhiều nghiên
cứu khoa học sử dụng kỹ thuật thay thế bằng các vòng đẳng cấu sinh học đã được công
nhóm thế đẳng cấu sinh học
1.1.3. Một số tác dụng sinh học của dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính sinh
học cho thấy các dẫn chất được tổng hợp từ quinazolinon có nhóm thế ở vị trí số 2 có
tác dụng sinh học phong phú như: chống ung thư, an thần, kháng khuẩn, kháng nấm,
v.v … Đặc biệt, các dẫn chất có nhóm thế ở vị trí số 6 hay vị trí số 7 ở vòng
quinazolinon và các nhóm thế (CH
3
, OCH
3
, OCF
3
, …) ở vị tri 2’,3’, của vòng thơm ở
vị trí số 2 của vòng quianzolinon cho thấy hoạt tính sinh học của các dẫn chất tăng lên
đáng kể.
1.1.3.1. Tác dụng chống ung thư
Về tác dụng chống ung thư, trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu
khoa học của các dẫn chất 2- aryl - 4- quinazolinon.
Tác giả Mann-Jen Hour và các cộng sự đã công bố kết quả về tổng hợp và thử
tác dụng gây độc tế bào của 6-alkylamino- và 2,3-dihydro-3’-methoxy-2-phenyl-4-
quinazolinon và các hợp chất liên quan. Dựa trên cấu trúc khung các tác giả đã tổng
hợp đươc 18 dẫn chất. Trong đó các hợp chất có R
6
là các nhóm thế dị vòng chứa N;
R
7
= R
2
' = R
4
'
R
6
= H; OCH
3
; OCH
2
O; N(CH
3
)
2
;
R
7
= R
2
' = R
4
' = R
5
' = H; OCH
3
R
3
' = OCH
3
N N N CH
3
O
N
3
)
2
R
Hình 1.7: Cấu trúc nhóm hợp chất 6-pyrrolidinyl-2-(2-subtituted phenyl)-
4-quinazolinon
Năm 2011, tác giả Yang C. Wu và cộng sự tiến hành thử hoạt tính chống khối u
của 2- (naphtalen-1-yl)-6-pyrrolidinyl-4-quinazolinon trên các dòng tế bào ung thư
người. Kết quả cho thấy hợp chất này có hoạt tính sinh học cao trên 3 dòng tế bào ung
thư với các giá trị IC
50
như sau: tế bào ung thư phổi (IC
50
= 0,053 ± 0,006 µM), tế bào
ung thư vòm họng (IC
50
= 0,041 ± 0,003 µM), tế bào ung thư biểu bì (IC
50
= 0,083 ±
0,01 µM) [33].
8
NH
N
O
N
Hình 1.8: Cấu trúc hợp chất 2- (naphtalen-1-yl)-6-pyrolidinyl-4-quinazolinon
Gần đây nhất năm 2013, tác giả Mann-Jen Hour và các cộng sự tiếp tục công bố
=
R
6
= OCH
3
R
6
= N(CH
3
)
2
N
R
2
=
R
2
=
R
2
=
N
S
NH
N
R
6
R
2
O
Như vậy, tác dụng chống ung thư hay hoạt tính độc tế bào trên tế bào ung thư
của các dẫn chất quinazolinon là tác dụng sinh học được các nhà khoa học quan tâm
nhất. Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung nghiên cứu hoạt tính kháng các
tế bào ung thư. Ngoài ra, dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon còn nhiều tác dụng sinh học
phong phú khác như: an thần, gây ngủ, kháng khuẩn, kháng nấm…
1.1.3.2. Một số tác dụng khác
Tác dụng an thần, gây ngủ
Methaqualon là thuốc an thần được nhà khoa học người Ấn Độ Gujiral M.L.
phát minh vào năm 1955 trong chương trình nghiên cứu thuốc phòng chống sốt rét và
được đưa ra thị trường như là một thuốc an thần không gây nghiện vào năm 1966 dưới
tên biệt dược: Renonal
®
, Melsed
®
, hay Mandrax
®
[30].
Mặc dù, Methaqualon có nhiều tác dụng phụ, nhưng vẫn có nhiều nghiên cứu
tiếp theo để tìm kiếm thuốc có tác dụng an thần, gây ngủ tương tự như Methaqualon
nhưng độc tính thấp hơn, chủ yếu là các nghiên cứu tổng hợp và thử sàng lọc tác dụng
an thần, gây ngủ của các hợp chất 2-alkyl-3-aryl-4-quinazolinon [12].
N
N
O
Hình 1.11: Cấu trúc của hợp chất Methaqualon
Ngoài ra còn có một số hoạt chất phát triển về sau này như mecloqualon,
còn được sử dụng làm nguyên liệu trong tổng hợp hóa học, trong hóa phân tích và
nhiều ứng dụng khác. Do tiềm năng ứng dụng đa dạng của các dẫn chất quinazolinon,
nên từ cuối thế kỉ 19 đến nay đã có nhiều phương pháp tổng hợp quinazolinon và dẫn
chất được công bố trong nhiều tài liệu khác nhau.
11
1.2.1. Phản ứng Niementowski V. và phản ứng Niementowski V. mở rộng.
Phương pháp tổng hợp dẫn chất quinazolin-4-on phổ biến nhất là phản ứng lần
đầu tiên đươc Niementowski V. mô tả năm 1885 và ngày nay phản ứng mang tên ông
[28]. Khi đun nóng acid anthranilic với một lượng dư formamid ở 120
o
C, nước được
giải phóng và hầu như acid anthranilic được chuyển hoàn toàn thành quinazolin-4-on.
Có nhiều cải tiến đối với phản ứng Niementowski V., phản ứng có thể tiến hành với
các dẫn chất của acid anthranilic thế cho các dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon. Tuy
nhiên, theo quy luật cần tiến hành phản ứng ở nhiệt độ cao hơn và thời gian phản ứng
kéo dài hơn.
H
N
COOH
R
1
HCONH
2
R
O
N
R
1
NH
2
Sơ đồ 1.3: Phản ứng tổng hợp Niementowski V cải tiến.
Patel V.S và Patel S.R. đã cải tiến phản ứng Niementowski V. bằng phản ứng
đóng vòng giữa các acid N-acylantharanilic thế với formamid ở nhiệt độ từ 100
o
C đến
180
o
C trong khoảng 3 giờ thu được dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon với hiệu suất từ
60% đến 83% [29].
H
N
COOH
R
1
HCONH
2
R
O
N
R
1
NH
O
R
Sơ đồ 1.4: Phản ứng tổng hợp của Patel V.S và Patel S.R .
12
C trong khoảng 2 giờ, sau đó đổ hỗn hợp phản ứng vào
nước đá (Sơ đồ 1.6). Hiệu suất phản ứng là 25,0% [23].
NH
2
NH
2
O
N
NH
O
NaHSO
3
, DMAC
150
o
C
N
(H
3
C)
2
N
Cl
O
N
N(CH
3
)
2
OH/DMF, 130
o
C
Cl
O
R
R
R = 3-Cl; 4-Cl; 2,4-(Cl)
2
; 2-CH
3
Sơ đồ 1.7: Phản ứng ngƣng tụ anthranilamid và benzoyl clorid cải tiến
1.2.4. Phản ứng ngưng tụ anthranilamid và aldehyd
Cũng theo Hour M. J. và cộng sự thì các dẫn chất 2-aryl-4(3H)-quinazolinon
được tổng hợp bằng cách ngưng tụ dẫn chất của anthranilamid và benzaldehyd. Tương
tự phản ứng ngưng tụ anthranilamid và benzoyl clorid, phản ứng này sử dụng NaHSO
3
làm chất xúc tác phản ứng ngưng tụ và DMAC làm dung môi phản ứng. Phản ứng
được đun hồi lưu trong 2 giờ ở nhiệt độ 150
o
C. Hiệu suất phản ứng là 75 - 95%.
NH
2
R
NH
2
O
o
C trong 12-36 giờ, và
cho hiệu suất phản ứng 38 - 98% [27].
NH
2
NH
2
O
H
O
R
NH
N
O
R
DMSO, 100
o
C
12-36h
Sơ đồ 1.9: Phản ứng tổng hợp của Na Yeun Kim và Cheol-Hong Cheon
15
CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI
Các hóa chất, dung môi dùng trong quá trình tổng hợp có xuất xứ từ các công ty
Arcros
19
DMSO-d6
Merk
5
2-
Trifloromethoxybenzaldehyd
Arcros
20
Dimethylformamid
Merck
6
3-
Trifloromethoxybenzaldehyd
Arcros
21
Khí H
2
Việt
Nam
7
2- Florobenzaldehyd
Merk
22
Acid 5-cloro-2-nitrobenzoic
Merk
8
3- Florobenzaldehyd
Merk
23
Merk
13
n-N-hexan
Malaysia
28
Dimethylamin 40%
Fischer
14
Aceton
Trung
Quốc
29
Thionylclorid
Merk
15
KOH
Trung
Quốc
30
10% Pd/C
Merk
Copyright: Tài liệu đại học ©