BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ MỪNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ
BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT
4- AMINO-2-ARYLQUINAZOLIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ MỪNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ
BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT
4- AMINO-2-ARYLQUINAZOLIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
1.1. DẪN CHẤT 3-ARYLISOQUINOLINAMIN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN
CẤU TRÚC .............................................................................................................

2

1.1.1. Dẫn chất 3-arylisoquinolinamin .................................................................

2

1.1.2. Phát triển khung 3-arylisoquinolinamin thành 4-amino-2-arylquinazolin ..

4

1.1.3. Tác dụng chống ung thư của dẫn chất 4-amino-2-arylquinazolin ............... 5
1.2.

PHƯƠNG

PHÁP

TỔNG


2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................... 11
2.3.1. Phương pháp tổng hợp 4-amino-2-arylquinazolin

11

2.3.2. Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc .................................................. 12
2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng tế bào ung thư ................................

12

Chương 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ................................................

15

3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC................................................................................... 15
3.1.1. Tổng hợp dẫn chất trung gian 4-cloro-2-arylquinazolin (2a-g) .................... 15
3.1.2. Tổng hợp 4-azid-2-arylquinazolin (3a-g) ..................................................... 20
3.1.3. Tổng hợp 4-amino-2-arylquinazolin (4a-g) .................................................

i

25


3.2. THÔNG SỐ HÓA LÝ VÀ DỮ LIỆU PHỔ....................................................

30

3.2.1. Thông số hóa lý ............................................................................................


43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN.........................................................................................................

47

2. KIẾN NGHỊ......................................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

ii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
A549

: Tế bào ung thư phổi

13

: Carbon nuclear magnetic resonance (phổ cộng hưởng từ Hạt

C- NMR

nhân 13C)
CTPT

: Công thức phân tử


Hep-2

: Tế bào ung thư gan người

IR

: Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

PTL

: Phân tử lượng

LU

: Tế bào ung thư phổi người

MeOH

: Methanol

MIC

: Minimal Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế tối thiểu)

MS

: Mass spectrometry (Phổ khối lượng)

OVCAR-8


18

2

Bảng 2

Số liệu phổ 1H-NMR của các dẫn chất 2a-g

19

3

Bảng 3

Kết quả tổng hợp các dẫn chất 3a-g

23

4

Bảng 4

Số liệu phổ 1H-NMR của các dẫn chất 3a-g

24

5

Bảng 5


Bảng 9

Số liệu phổ 13C-NMR của các dẫn chất 4a-g

33

10

Bảng 10

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 4a-g trên 4

34

dòng tế bào ung thư người
11

Bảng 11

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của dẫn chất trên 4
dòng tế bào ung thư người

iv

44


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

TT

Hình 4

Cấu trúc hóa học của các thuốc có chứa nhân quinazolin

5

5

Hình 5

Hợp chất 7-cloro-2-(4’-methylphenyl)-quinazolin-4-amin

6

(IV)
6

Hình 6

Dẫn chất 6,7-dimethoxyquinazolin (V) trong nghiên cứu của

6

Mange R.Yadav
7

Hình 7

Dẫn chất polyhalogen 4-amino-2-arylquinazolin (VI) trong



Phổ khối lượng (MS) của chất 4c

43

v


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

TT

Tên sơ đồ

Trang

1

Sơ đồ 1

Tổng hợp các dẫn chất 3-arylisoquinolinamin

2

2

Sơ đồ 2

Thiết kế các dẫn chất 4-amino-2-aryl-quinazolin dựa trên


6

Sơ đồ 6

Sơ đồ tổng hợp 4-amino-2-arylquinazolin của M. R Yadav

7

Sơ đồ 7

Quy trình tổng hợp hợp chất 4-amino-2-arylquinazolin

8

Sơ đồ 8

Tổng hợp các hợp chất imin clorid 2a-g

15

9

Sơ đồ 9

Tổng hợp các hợp chất 3a-g

20

10


kháng tế bào ung thư tốt [25]. Hội nhập với xu hướng nghiên cứu của thế giới trong
việc tìm kiếm các dẫn chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt, đề tài: “Tổng hợp
và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất 4-amino-2arylquinazolin” được tiến hành với hai mục tiêu :
1- Tổng hợp được một số dẫn chất của 4-amino-2-arylquinazolin.
2- Thử hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất tổng hợp được trên một số dòng
tế bào ung thư.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

DẪN CHẤT 3-ARYLISOQUINOLINAMIN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN
CẤU TRÚC

1.1.1. Dẫn chất 3-Arylisoquinolinamin
Các dẫn chất khung 3-arylisoquinolin đã được quan tâm nghiên cứu trong
những năm gần đây [19-20]. Từ khi phát hiện ra hợp chất dẫn đường 3arylisoquinolinon với hoạt tính chống ung thư cao với nồng độ nano mol, nhóm nghiên
cứu của Cho đã tiến hành nhiều nghiên cứu về mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng
của dãy 3-arylisoquinolinon. Dựa trên phát hiện này, Cho đã tiến hành nghiên cứu về
cấu trúc-tác dụng bằng cách thay đổi các nhóm chức và nhóm thế và đã phát hiện dãy
hợp chất 3-arylisoquinolinamine có hoạt tính chống ung thư. Cho đã tổng hợp nhiều
dẫn chất khác nhau có chứa khung 3-arylisoquinolin [9-14] Trong một số các nghiên
cứu gần đây về dãy hợp chất 3-arylisoquinolinamin với hoạt tính chống ung thư tốt
[14, 29, 30], Cho đã báo cáo các dãy hợp chất với nhóm thế ở các vị trí 5, 6, 7 của
vòng isoquinolin. Các hợp chất này được tổng hợp từ các dẫn chất 3-arylisoquinolinon
tương ứng (Sơ đồ 1).

Sơ đồ 1: Tổng hợp các dẫn chất 3-arylisoquinolinamin

1'
2'
(I)

NH2

R1= N(CH3)2, R2= 3’-CH3, HCT-116, IC50= 0,023 μM
R1= CH3, R2= 2’-OCH3, MDA-MB-231, IC50= 0,32 μM
R1= CH3, R2= 2’-F, MDA-MB-231, IC50= 0,72 μM
R1= CH3, R2= 3’-CH3, MDA-MB-231, IC50= 0,21 μM

Hình 1: Một số hợp chất 3-arylisoquinolinamin (I) có hoạt tính chống ung thư
tốt trong nghiên cứu của Cho và cộng sự
Bên cạnh nghiên cứu của Cho, Carl H. Behren và cộng sự có đăng kí bản quyền
về dãy hợp chất 3-(1-naphthyl)isoquinolinamin là các chất điều trị ung thư. Trong đó,
hợp chất (II) với nhóm thế methyl ở vị trí C-7 của vòng isoquinolin có hoạt tính gây
độc tế bào rất tốt ở nồng độ 5 nM với dòng tế bào ung thư da RPMI-7272 [15].

N

Me

NH 2

.HCl

(II)

RPMI-7272 Melanoma
IC50 = 5,0 nM

dụng kháng tế bào ung thư trên 4 dòng tế bào A549 (ung thư phổi), SKOV-3 (ung thư
buồng trứng), SK-MEL-2 (ung thư tế bào hắc tố), và HCT-15 (ung thư đại tràng). Một
số hợp chất mới IIIa-c có kết quả gây độc tế bào trên 4 dòng ung thư trên với IC50 nồng
độ μM (4-65μM) [25].
N

N

N
N

N

N

NH

HN

NH
( IIIa)

(IIIb)

(IIIc )

Hình 3: Một số hợp chất thế 4-amino-2-phenylquinazolin (III)
Có tác dụng chống ung thư
Trên cơ sở đó, trong nghiên cứu này, các dẫn chất 4-amino-2-aryl-quinazolin là
hợp chất tương đương sinh học với dẫn chất chống ung thư 3-arylisoquinolinamin ở


R3

N 3 R2

NH 2

3-arylisoquinolinamin

4-amino-2-arylquinazolin

Sơ đồ 2. Thiết kế các dẫn chất 4-amino-2-arylquinazolin dựa trên phương pháp
nhóm thế đẳng cấu sinh học
1.1.3. Tác dụng chống ung thư của dẫn chất 4-amino-2-arylquinazolin
Cấu trúc dị vòng quinazolin được phát hiện nhiều trong hợp chất tự nhiên và
được nghiên cứu nhiều trong hóa dược. Các dẫn chất quinazolin thể hiện nhiều tác
dụng sinh dược học quan trọng như tác dụng lên hệ thần kinh trung ương, tác dụng lên
hệ tim mạch, tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư, vv. Dị
vòng quinazolin được coi là một cấu trúc đáng quan tâm trong việc phát triển thuốc.
Một số thuốc sử dụng trên thị trường mang khung quinazolin amin như Doxazocin là
thuốc chữa bệnh cao huyết áp do Pfizer nghiên cứu và phát triển. Thuốc chống ung thư
nhóm ức chế enzyme EGFR tyrosin kinase như Gefetinib.
O
N
MeO
MeO

N

N

5


trúc hóa học của các thuốc ức chế enzyme EGFR tyrosin kinase như Erlotinib,
Gefetinib, Vandetanib. Trong số các hợp chất quinazolin tổng hợp, có dẫn chất 7cloro-2-(4’-methylphenyl)-quinazolin-4-amin có tác dụng khá tốt trên ba dòng tế bào
MCF-7 (ung thư vú), HELA (ung thư cổ tử cung), Hep-G2 dòng (ung thư gan) với
nồng độ IC50 tương ứng là 3.76; 3,56 và 14,5 μg/mL [16].
Me
N
N

Cl

NHR

(IV)

Hình 5. Hợp chất 7-cloro-2-(4’-methylphenyl)-quinazolin-4-amin (IV)
Năm 2012, Mange R. Yadav và cộng sự đã báo cáo về việc tổng hợp và thử hoạt
tính chống ung thư của các dẫn chất 6,7-dimethoxyquinazolin-4-amin trên 2 dòng tế
bào HCT116 (ung thư đại tràng) và HEY (ung thư buồng trứng) [28]. Kết quả thu
được một số chất sau:
MeO
MeO

X

N

X=2’-Cl, 3’-OMe, 4’-OMe, 3’-Me, 4’-Me

X

NH2

CF3

F
N
N

NC

( VI)

F

NH2

(VIa)

Hình 7. Dẫn chất polyhalogen 4-amino-2-arylquinazolin (VI) trong nghiên cứu của
Sheng J. Yan
Như vậy, các nghiên cứu về dẫn chất 4-amino-2-arylquinazolin còn chưa nhiều
trên thế giới các hợp chất này đều khác so với cấu trúc mà chúng tôi dự định nghiên
cứu. Chúng tôi hy vọng sẽ nghiên cứu và đóng góp thêm vào việc tìm ra các hợp chất
mới 4-amino-2-arylquinazoline có hoạt tính chống ung thư.

1.2.

PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP DẪN CHẤT 4-AMINO-2ARYLQUINAZOLIN

C

NH 2

R1

R2

Br
R1 = H, 3'

CH3 , 4'

N

CuI, DMEDA,
K 2CO3, DMF, 80oC

R2
N

NH 2

NO 2

R2 = NH 2 , CH3, CH 2CH 2CH3 ,

,

Sơ đồ 3: Phản ứng tổng hợp dãy 4-aminoquinazolin (Xiaobo Yang và cộng sự)

liệu 2-amino-benzonitril, acylchlorid, và ammonium acetat, đặc biệt với sự xúc tác của
HPA (acid heteropoly (H14 [NaP5W30O110]) dưới dạng hạt nano, điều kiện đun hồi lưu
trong thời gian 1h, kết quả cho hiệu suất cao >90% [17].

8


CN

O
+

NH2

HPA
+

C
R

H2N

OOCCH 3

Cl

N

R
N

đơn giản, sử dụng các hóa chất sẵn có, rẻ tiền, cho hiệu suất cao, tổng hợp được nhiều
dẫn chất khác nhau. Do vậy phương pháp này được chúng tôi sử dụng để tiến hành
tổng hợp các dẫn chất 4-amino-2-arylquinazolin.

10


CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI
Các hóa chất, dung môi dùng trong quá trình tổng hợp có xuất xứ từ các công ty

như: Merk, Trung Quốc, Việt Nam. Hợp chất 2-arylquinazolinon được tổng hợp trong
nghiên cứu trước đây [5]. Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế
thêm. Các hóa chất được trình bày ở bảng dưới đây:
TT
1

Nguyên liệu

Xuất xứ

TT

Nguyên liệu

Xuất xứ



n-hexan

Trung Quốc

4

Methanol

Merk

11

Aceton

Trung Quốc

5

10% Pd/C

Merck

12

Dimethylformamid

6

Dicloromethan

Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật Bản).

-

Bơm hút chân không DIVAC1.21 (Mỹ).

-

Máy cất quay Buchi R – 210 (Thụy Sỹ).

-

Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital EZ.Melt 3.0

-

Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC (Đức).

-

Tủ sấy Memmert (Đức).

2.3.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phương pháp tổng hợp 4-amino-2-arylquinazolin
-

Sử dụng các phương pháp tổng hợp hữu cơ thông thường để tổng hợp các dẫn

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được theo
phương pháp MTT là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất
có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
2.3.3.1.

Nguyên tắc:

Đây là phương pháp thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót của tế
bào ung thư được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng.
Hợp chất MTT có tên khoa học là 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5diphenyltetrazolium bormid, có màu vàng được thêm vào mỗi giếng và tế bào được ủ
ở 37oC, 5% CO2. Màu vàng biến đổi thành formazan tím trong ty thể của tế bào sống.
Khả năng hấp thụ của dung dịch có màu này có thể được định lượng bằng máy quang
phổ kế ở bước sóng 540 – 600nm. Sự biến đổi màu chỉ xảy ra khi enzym reductase
trong ty thể hoạt động, và như vậy sự chuyển đổi liên quan trực tiếp đến số lượng tế
bào sống sót. Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu độc tính của
các dẫn chất tổng hợp được trên bốn dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư biểu
mô - KB, tế bào ung thư gan - Hep – G2, tế bào ung thư phổi - LU, tế bào ung thư vú -

12


MCE – 7. Phương pháp này hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc
gia Mỹ (NCI).
2.3.3.2.

Dòng tế bào thử nghiệm:

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm:
-


-

Pha 200l dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa
96 giếng) trong môi trường DMEM cho các dòng tế bào HepG2, MCF7, KB, LU.

-

Mẫu thử được pha loãng sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128g/ml; 32g/ml;
8g/ml; 2g/ml; 0,5 g/ml. Ủ ở 37oC, 5% trong 3 ngày.

-

Giếng điều khiển (đối chứng dương) chỉ gồm 200 l dung dịch tế bào 3 x 104 tế
bào/ml.

-

Sau 3 ngày nuôi cấy; ủ tiếp với MTT 0,2mg/ml ở 37oC trong 4 giờ.

-

Loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO lắc đều để formazan có thể hòa tan hoàn
toàn.

-

Đọc mật độ quang ở bước sóng 540 nm trên máy Spectrophotometer Genios
TECAN. Mật độ quang phản ánh số lượng tế bào còn sống sót.

c. Tính kết quả:

1e: R1 = CH3; R2= F; R3 = H

1c: R1=CH3; R2= H; R3= OCH3

1f: R1= CH3 R2+ R3= -CH=CH-CH=CH1g: R1 = N(CH3)2 , R2+R3= CH=CH-CH=CH

3.1.1. Tổng hợp dẫn chất trung gian 4-cloro-2-aryl-quinazolin (2a-g)

Sơ đồ 8: Tổng hợp các hợp chất imin clorid 2a-g
Quy trình chung để tổng hợp các dẫn chất 4-cloro-2-aryl-quinazolin (2a-g)
Hỗn hợp quinazolinon 1a-g và phosphoryl oxytriclorid (2-3 ml) được đun nóng ở
50oC trong vòng 7-8h. Sau khi phản ứng kết thúc, cất loại bỏ POCl3 dư bằng áp suất
giảm, hỗn hợp phản ứng được đổ vào nước đá và được chiết với ethyl acetat. Dịch

15


ethyl acetat được làm khan bằng natri sulfat khan, lọc và cất loại dưới áp suất giảm.
Cắn thu được được tinh chế bằng sắc kí cột trên silica gel với dung môi n-hexan-ethyl
acetat (9/1) để thu được sản phẩm imin clorid 2a-g.
4-Cloro-6-methyl-2-(m-tolyl)quinazolin (2a)
N

CH3
N

H3C
Cl

CTPT: C16H13ClN2; KLPT: 268,74

OCH3
N

H3C
Cl

CTPT: C16H13ClN2O; KLPT: 284,74
Tiến hành:

16