BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN DUY
TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ MỘT SỐ
ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG
BENZIMIDAZOL/INDOLIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI 2014 BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN DUY
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo, cô giáo, các anh chị kỹ
thuật viên Bộ môn Hóa Dƣợc - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã nhiệt tình
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trƣờng, các phòng
ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trƣờng Đại học Dƣợc Hà nội -
những ngƣời đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt năm năm học tập tại trƣờng.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh
chị em đã dành cho tôi sự giúp đỡ và động viên quý báu trong suốt thời gian
qua.

Hà Nội, ngày 4 tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Nguyễn Duy

Mục Lục

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chƣơng 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Histon deacetylase (HDAC) 2
1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase 2
1.1.2. Mối liên quan giữa HDAC và ung thư 3
1.1.3. Phân loại các HDAC 5
1.1.4. Cấu trúc trung tâm hoạt động của các HDAC kinh điển 6

3.2.3. Khẳng định cấu trúc 32
3.3. Thử tác dụng sinh học 36
3.4. Bàn luận 36
3.4.1. Tổng hợp hóa học 36
3.4.2. Tác dụng sinh học 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40
I. Kết luận 40
II. Kiến nghị 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
13
C- NMR
:
: Cộng hƣởng từ hạt nhân
13
C
1
H- NMR
:
: Cộng hƣởng từ hạt nhân
1
H
AsPC-1:
:


: Tế bào ung thƣ vú
MeOH
:
: Methanol
MS
:
: Phổ khối lƣợng
MTT

: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromid
NCI-H460

: Tế bào ung thƣ phổi
PC3

: Tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt
SAHA

: Acid suberoylanilid hydroxamic
SW620

: Tế bào ung thƣ đại tràng
TLC

: Sắc kí lớp mỏng
TMS

: Tetramethylsilan

5
Bảng 1.5: Tác dụng sinh học của một số chất ức chế HDAC
được thiết kế, tổng hợp tại Việt Nam
15
6
Bảng 3.1: Sơ bộ đánh giá tính giống thuốc của các chất dự
kiến tổng hợp
22
7
Bảng 3.2: Một số đặc điểm lý hóa và hiệu suất tạo hydroxamic
từ ester của các chất I-IV
30
8
Bảng 3.3: Giá trị nhiệt độ nóng chảy (t
o
nc
) và R
f
với pha động
DCM/MeOH/AcOH = 90/10/1 của các chất I-IV
31
9
Bảng 3.4: Kết quả phân tích phổ khối lượng của các chất I-IV
32
10
Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các chất I-IV
33
11
Bảng 3.6: Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân
1

3
3
Hình 1.3: Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế
bào ung thư
4
4
Hình 1.4: Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC
7
5
Hình 1.5: Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC tương
tự SAHA
8
6
Hình 1.6: Ảnh hưởng của cấu trúc cầu nối tới hoạt tính ức
chế HDAC
13
7
Hình 1.7: Chất ức chế có cầu nối là 1,4-cyclohexelen và 1,4-
phenylen
13
8
Hình 1.8: Acid hydroxamic có nhóm nhận diện bề mặt là
succinimid
14
9
Hình 1.9: Cấu trúc chung của một số dãy chất đã được
nghiên cứu trong nước
15
10
Hình 1.10: Acid hydroxamic mang khung benzothiazol

và thúc đẩy phát triển ung thƣ. Từ đó, việc tìm kiếm hoạt chất ức chế HDAC trở
thành một hƣớng nghiên cứu trong tìm kiếm các chất điều trị ung thƣ.
Năm 1976, hoạt chất chống nấm TSA đƣợc phân lập từ Streptomyces
hygrocopicus bởi Tsuji và cộng sự 28. Nhƣng mãi tới năm 1990, tác dụng ức
chế HDAC của TSA mới đƣợc phát hiện bởi Yoshida và đồng nghiệp 33. Từ đó
dựa trên cấu trúc và tƣơng tác của nó với HDAC, một loạt các chất đƣợc thiết kế
và tổng hợp. Năm 2006 SAHA (Zolinza®) đã trở thành chất ức chế HDAC đầu
tiên đƣợc Cục quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Mỹ (US-FDA) cấp phép điều trị
u limpho tế bào T dƣới da, đánh dấu sự thành công của hƣớng nghiên cứu [4].
Theo định hƣớng nghiên cứu đó, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dƣợc
- Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã và đang thiết kế, tổng hợp, khảo sát tác dụng
sinh học của các acid hydroxamic mới với sự thay đổi nhóm nhận diện bề mặt và
cầu nối dựa trên cấu trúc của SAHA. Khóa luận: “Tổng hợp và thử tác dụng
sinh học một số acid hydroxamic mang khung benzimidazol/indolin hƣớng
ức chế histon deacetylase” đƣợc thực hiện với hai mục tiêu:
1. Tổng hợp acid hydroxamic mang khung benzimidazol và các acid
hydroxamic mang khung indolin.
2. Thử độc tính trên dòng tế bào ung thƣ đại tràng SW620 của các chất
tổng hợp đƣợc.
2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Histon deacetylase (HDAC)
Ở gen ngƣời, chuỗi ADN đƣợc gói gọn thành các nucleosom bằng cách
quấn quanh protein histon. Mỗi nucleosom gồm một đoạn ADN chứa 146 cặp
nucleotid kèm theo một octamer histon (hình 1.1). Giữa hai nucleosom liên
tiếp là một đoạn ADN cầu nối (linker ADN).

Hình 1.1: Cấu trúc của nucleosom
1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase

mức là cơ chế chính tạo ra các protein ung thƣ (oncoprotein). Sự biến đổi
4

trong cấu trúc nhiễm sắc thể tác động lên quá trình biệt hóa của các tế bào
bình thƣờng, kết quả dẫn tới hình thành các khối u. Vai trò chức năng của các
HDAC trong quá trình sinh học của tế bào ung thƣ đƣợc minh họa trong hình
1.3 16,17,24.

Hình 1.3: Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thư
Cụ thể ngƣời ta thấy sự gia tăng của HDAC1 trong bệnh ung thƣ dạ dày
[6], ung thƣ tuyến tiền liệt [14], ung thƣ đại tràng [31], ung thƣ vú [34] hay
ung thƣ da. Một ví dụ khác, sự gia tăng mạnh HDAC2 đƣợc tìm thấy trong
ung thƣ cổ tử cung [15] và ung thƣ dạ dày [25]. Một số nghiên cứu khác cũng
đã báo cáo về sự gia tăng không kiểm soát của HDAC3 và HDAC6 trong các
mẫu xét nghiệm ở ung thƣ đại tràng và ung thƣ vú [31,35].
Do sự liên quan giữa ung thƣ và hoạt động của các HDAC, thuốc ức
chế enzym này đƣợc kì vọng là sẽ đảo ngƣợc lại quá trình qua các cơ chế
24:
5

- Ức chế chu trình tế bào, hoạt hóa các chƣơng trình biệt hóa.
- Ức chế sự tạo mạch.
- Thúc đẩy sự chết theo chu trình của tế bào.
1.1.3. Phân loại các HDAC
Histon deacetylase (HDAC) là nhóm gồm có 18 enzym, đƣợc phân thành 4
nhóm dựa vào sự tƣơng đồng về cấu trúc với các enzym Rpd3, HdaI và Sir2 của
nấm men 9 (bảng 1.1):
Bảng 1.1: Đặc điểm 11 HDAC “kinh điển”
Nhóm
Loại

17q21
Nhân/tế bào chất
7
912
12q13.1
Nhân/tế bào chất
9
1069
7p12.1
Nhân/tế bào chất
IIb
6
1215
Xp11.22
Tế bào chất
10
669
22q13.3
Tế bào chất
IV
11
347
3p25.2
Nhân/tế bào chất
- Nhóm I: HDAC1, -2, -5, -8, cấu trúc của chúng tƣơng đồng với enzym
Rdp3.
- Nhóm II: HDAC4, -5, -6, -7, -9, -10, cấu trúc của chúng tƣơng đồng
với enzym HdaI và đƣợc chia thành 2 phân nhóm. Phân nhóm IIa: HDAC4, -5,
-7, -9 và phân nhóm IIb: HDAC6, -10.
6

der Waals với cơ chất. Túi đƣợc cấu tạo bởi các acid amin thân dầu, đặc biệt là
các acid amin có nhân thơm nhƣ: Phenylalanin, Tyrosin, Prolin, Histidin. Cấu
trúc túi khá linh động, có thể thay đổi kích thƣớc để phù hợp với cơ chất trong
phản ứng deacetyl. Ở HDAC nhóm I và II kênh này có chiều sâu khoảng 11Å,
ở gần cuối túi đƣờng kính của nó khoảng 7Å và đƣợc hạn chế bởi hai acid amin
Phenylalanin nằm song song với nhau (hình 1.4).
7

- Ở đáy túi là ion Zn
2+
, chính là coenzym của các HDAC. Đây là phần
tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi lysin bằng các liên kết phối trí.
Thông thƣờng các chất ức chế liên kết càng mạnh với ion Zn
2+
thì hoạt tính
sinh học càng mạnh.

Hình 1.4: Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC
1.1.5. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC
Tƣơng ứng với ba phần cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym, cấu
trúc các chất ức chế HDAC cũng gồm 3 phần A-B-C (hình 1.5):
- Phần A là nhóm khóa hoạt động (capping group): thƣờng có cấu
trúc vòng thơm hoặc các peptid vòng.
- Phần B là vùng cầu nối: là cầu nối hydrocarbon thân dầu mạch thẳng
hay vòng, có thể no hoặc không no để tạo các liên kết Van der Waals với túi
enzym.
8

- Phần C là nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group): là các
nhóm có khả năng tƣơng tác với ion Zn

Chất ức chế
HDAC
Công thức cấu tạo
Đích
tác
dụng
(nhóm
HDAC)
Nồng
độ
tác
dụng
Pha
lâm
sàng
Acid Hydroxamic
Trichostatin
A (TSA)
N
CH
3
CH
3
O
NH
OH
CH
3
CH
3

OH

I,II
nM
Pha I,
II
Abexinostat
(PCI-24781)
O
N
CH
3
CH
3
NH
O
O
NH
OHO

I, II, IV
nM
Pha I,
II
10

Belinostat
(PXD101)
NH
S

2
OH
S
O
O
N CH
3
CH
3

I, II, IV
μM
Pha I,
II
Quisinostat
(JNJ-
26481585)
NH
OH
O
N
N N
NH
N
CH
3

I,II,IV
μM
Pha I

Benzamid
Entinostat
(MS-275)
NH
2
NH
NH O
O
N
O

I
μM
Pha II
11

Mocetinostat
(MGCD0103)
N N
N
O
NH
NH
2

I
μM
Pha I,
II
Acid béo

nối (bảng 1.3). Kết quả thử tác dụng cho thấy các hợp chất này ức chế cả
histon deacetylase ngô (HD-2) và HDAC của tế bào gan chuột. Nghiên cứu
này chỉ ra rằng các chất có chiều dài cầu nối từ năm tới sáu nhóm methylen có
tác dụng mạnh nhất (chất 1c và 1d).
Bảng 1.3: Hoạt tính của các chất tương tự TSA
R
O
N
NH
CH
3
OH
n
1 (a-e)

Hợp chất
R
N
HD-2 IC
50

(nM)
HDAC IC
50

(nM)
12

TSA
3

Me
2
N
7
300
145
- Trong một nghiên cứu khác, dựa trên cấu trúc của oxamflatin, Delorme
và đồng nghiệp 29 đã phát triển các chất ức chế HDAC trên cơ sở acid
hydroxamic sulfonamid (bảng 1.4).
Bảng 1.4: Hoạt tính của các dẫn chất sulfonamid hydroxamic acid
S
O
O
NH
NH
O
OH
Oxamflatin
S
O
O
NH
R NH
OH
O
2 (a-d)

Hợp chất
R
HDAC IC

b. Ảnh hưởng của cấu trúc cầu nối
- Để hiểu đƣợc vai trò của nhóm thế methyl và liên kết olefin, dựa trên
13

cấu trúc của TSA các hợp chất 3a, 3b và 3c (hình 1.6) đƣợc Van OK 30 tổng
hợp và đánh giá khả năng ức chế HDAC. Việc bổ sung một nhóm methyl (3b)
và hai liên kết đôi cùng một nhóm methyl (3c) đã làm giảm hoạt tính tƣơng
ứng là 2,3 và 33 lần (so với 3a).
N
CH
3
CH
3
O
NH
NH
CH
3
O
OH
N
CH
3
CH
3
O
NH
NH
CH
3

HDAC IC
50
= 152 nM
3b
HDAC IC
50
= 359 nM
3c
HDAC IC
50
= 12187 nM

Hình 1.6: Ảnh hưởng của cấu trúc cầu nối tới hoạt tính ức chế HDAC
- Với cầu nối là 1,4-cyclohexylen hoặc 1,4-phenylen và nhóm nhận
diện bề mặt là một nhóm thế 2 vòng thơm của 2 dẫn chất 4a và 4b, Uesato và
đồng nghiệp đã báo cáo kết quả thử hoạt tính HDAC 29. Họ nhận thấy rằng
chất chứa vòng phenylen (4a) có tác dụng ức chế mạnh hơn nhiều so với chất
chứa vòng cyclohexylen (4b) (hình 1.7).
NH
O
O
NH
OH
NH
O
CH
2
NH
OH
4a

N
H
N
O
H
NH
OH
O
O
5
5a
HDAC IC
50
= 2100 nM
O
N
N
O
H
NH
OH
O
O
O
CH
3
CH
3
5
5b

O
N
O
NH
OH
O
OH
R
N
S
R
NH
NH
OH
O
O
4
6
6 (a-c)
8
9
7 (a-b)

Hình 1.9: Cấu trúc chung của một số
dãy chất đã được nghiên cứu và công bố
Nghiên cứu đã mang lại kết quả khả quan, nhiều chất tổng hợp đƣợc có
tác dụng rất tốt khi thử khả năng ức chế HDAC, độc tính tế bào in vitro trên
một số dòng tế bào ung thƣ [3,8,22] (bảng 1.5).
Bảng 1.5: Tác dụng sinh học của một số chất ức chế
HDAC đã được thiết kế, tổng hợp tại Việt Nam

1,94
6c
4-OCH
3
1.46
2,46
1,63
0,80
1,97
7a
5-F
0,11
1,55
2.73
1,72
1,50
7b
5-Br
0,29
1,77
2,21
0,08
0,97
1.5. Thiết kế cấu trúc các chất dự kiến tổng hợp
9a (hình 1.10) là một trong số các chất đã đƣợc thiết kế, tổng hợp bởi
nhóm thực nghiệm tại bộ môn Hóa Dƣợc. Cấu trúc của 9a đƣợc thiết kế dựa
trên cấu trúc của SAHA, bằng cách giữ nguyên cấu trúc cầu nối và thay
khung benzen ở phần nhận diện bề mặt bằng khung benzothiazol.
16


OH
O
O
N
H
N
NH
NH
O
O
OH
I

Hình 1.11: Cấu trúc hóa học của các chất dự kiến tổng hợp
Tiếp đến, để hiểu hơn về vai trò của nhóm C=O trong cầu nối của
SAHA acid hydroxamic III đƣợc thiết kế tổng hợp. Cấu trúc của chất III chỉ
khác cấu trúc của chất II ở chổ không có nhóm C=O trong cầu nối.
Chất IV vẫn mang khung nhận diện là indolin và sử dụng cầu nối
cinnamat của Panobinostat (hoạt chất đang đƣợc mở rộng thử nghiệm lâm
sàng bởi hãng dƣợc phẩm Novartis). Chất IV đƣợc thiết kế tổng hợp nhằm
khảo sát hoạt tính của cầu nối cinnamat này.

17 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU

 Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, sinh
hàn hồi lƣu, pipet, bình chiết, phễu thủy tinh, bình chạy sắc kí lớp mỏng.
 Máy khuấy từ gia nhiệt.
 Máy cất quay chân không Buchi R-210.
 Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu.

Trích đoạn Khẳng định cấu trúc

---