BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LAN PHƯƠNG TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID
HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-
OXIM-ISATIN HƯỚNG ỨC CHẾ
HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI-2013


LỜI CẢM ƠN
Những dòng đầu tiên của khóa luận, tôi xin được dành để gửi lời cảm ơn tới thầy cô
và các bạn, những người đã đồng hành và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình hoàn thành
khóa luận.
Trước hết, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc và chân thành tới những người thầy,
người cô đáng kính của tôi tại bộ môn Hóa Dược, trường Đại Học Dược Hà Nội: PGS. TS.
Nguyễn Hải Nam, TS. Phan Thị Phương Dung và DS. Nguyễn Thị Mơ. Các thầy cô đã
luôn ở bên cạnh chỉ bảo, hướng dẫn tận tình, giúp tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp.
Bên cạnh đó, tôi cũng mong được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo cũng như các
anh chị kỹ thuật viên tại bộ môn Hóa Dược, trường đại học Dược Hà Nội. Mọi người thật
sự đã giúp đỡ rất nhiều, tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi cùng nhóm thực nghiệm trong
quá trình nghiên cứu khoa học và thực hiện đề tài tốt nghiệp tại bộ môn.
Ngoài ra không thể không kể tới sự đồng hành của các anh chị và các bạn trong
nhóm thực nghiệm. Sự chia sẻ và động viên của mọi người là nguồn động lực rất lớn của
tôi trong suốt thời gian thực nghiệm khoa học.
Và cuối cùng tôi muốn gửi sự biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè và người thân
của tôi, những người đã luôn ở bên giúp đỡ tôi trong mọi hoàn cảnh.
Hà Nội, ngày 15 tháng 04 năm 2013
Sinh viên
Trần Thị Lan Phương


1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC
6
1.2.2. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC
10
1.2.3. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế HDAC
12
Chương 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
17
2.1. NGUYÊN LIỆU
17
2.2. TRANG THIẾT BỊ
17
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
18
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
19
2.4.1. Nghiên cứu docking các chất
19
2.4.2. Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết
20
2.4.3. Khẳng định cấu trúc
20
2.4.4. Thử hoạt tính sinh học
20 Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
23
3.1. SƠ BỘ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ DOCKING

47
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AML
Acute myeloid leukemia (bệnh bạch cầu cấp dòng tủy)
AML-ETO
Protein gây tăng sinh
APL
Acute promyelocytic leukemia (ung thư bạch cầu)
APAF1
Apoptoic protease activating factor (yếu tố hoạt hóa protease)
CHAP
Cyclic hydroxamic-containing peptid (các dẫn xuất của acid tetrapeptid
hydroxamic vòng)
CD
Receptor gây chết nội tại
CBHA
m-carboxycinnamic acid bis-hydroxamid

3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid
NMR
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân
PLRF
The Promyelocytic leukemia zinc finger (bệnh lơ-xê-mi cấp tiền tủy
bào)
RA
Retinoic acid
RAR
Retinoic acid receptor alpha (receptor của acid retinoic)
ROS
Reactive oxygen species (gốc oxy tự do hoạt động) SAHA
Acid suberoylanilid hydroxamic
TLC
Phương pháp sắc ký lớp mỏng
TSA
Trichostatin
VEGF
Vascular endothelial growth factor (yếu tố gây phát triển màng
trong mao mạch)


3.4
Số liệu phân tích phổ
1
H-NMR của các acid hydroxamic
31
3.5
Số liệu phân tích phổ
13
C-NMR của các acid hydroxamic
32
3.6
Kết quả thử hoạt tính sinh học
34
9
1.9 Công thức cấu tạo của MS275
9
1.10 Cấu trúc chung của một số dãy chất nghiên cứu đã công bố
13
1.11
Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC dẫn chất
acid hydroxamic
14
1.12
Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC dẫn chất
acid hydroxamic
16
3.1
Kết quả docking và dự đoán năng lượng liên kết của chất 5d với
HDAC 8
22
3.2
Công thức tổng quát N
1
-hydroxy-N
8
-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-
yl)octandiamid và dẫn chất
38
3.3
Công thức tổng quát chất dãy chất acid hydroxamic mang khung
benzothiazol
38


Một trong những ví dụ điển hình là việc tìm ra vai trò của enzym histon
deacetylase trong sinh lý bệnh ung thư. Quá trình phiên mã hoặc biểu hiện bất
thường do những gen mã hóa histon deacetylase hay những phần gắn chúng
bị đột biến là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến quá trình tấn công
và phát triển của ung thư. Các chất ức chế histon deacetylase có thể phục hồi
lại sự biểu hiện gen, ức chế sự phát triển và sống sót của tế bào ung thư. Một
loạt các chất ức chế histon deacetylase đã được nghiên cứu phát triển. Trong
đó acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) là một ví dụ điển hình. Với tên
thương mại là Vorinostat (Zolinza
®
) loại thuốc này đã được Cục quản lý dược
phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T
dưới da. Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược cũng đã tham gia nghiên
cứu thiết kế và công bố nhiều dãy chất với định hướng ức chế histon
deacetylase và cho những kết quả bước đầu khả quan. Tiếp tục hướng đi đó,
chúng tôi đã thực hiện đề tài “Tổng hợp một số acid hydroxamic mang
khung 3-oxim isatin hướng ức chế histon deacetylase” với 2 mục tiêu sau
đây:
* Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)
heptanamid và một số dẫn chất.
* Bước đầu thử tác dụng ức chế HDAC và đánh giá độc tính trên tế
bào ung thư đại tràng SW620 của các dẫn chất tổng hợp được.

2

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. ENZYM HISTON DEACETYLASE
1.1.1. ĐỊNH NGHĨA VÀ VAI TRÒ CỦA HISTON DEACETYLASE
TRONG CƠ THỂ

HDAC6 chỉ có ở tế bào chất.
* Nhóm III: các protein điều hòa chuỗi thông tin 2 (sir2 hay sirtuins) [14]
- Chất đồng đẳng của Sir2 trong Saccharomyces cerevisiae.
- Sirtuins trong động vật có vú (sirt1, sirt2, sirt3, sirt4, sirt5, sirt6, sirt7)
* Nhóm IV: HDAC 11, có ở trong nhân của nhiều tế bào, tuy nhiên
phức hợp HDAC11 với HDAC6 lại nằm trong bào tương, chủ yếu có ở tim,
cơ trơn, thận, não.

4

Nhóm I, II và IV được coi như những HDAC “cổ điển”. Các HDAC
này và các sirtuins có cơ chế xúc tác khác nhau. Các HDAC “cổ điển” là các
enzym phụ thuộc Zn
2+
, chúng có chứa một túi xúc tác với một ion Zn
2+
ở đáy
túi và có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn
2+
như các acid
hydroxamic, thiol Những hợp chất này không có tác dụng chống sirtuins vì
sirtuins có cơ chế hoạt động phụ thuộc NAD
+
như một cofactor thiết yếu [7].
Thuật ngữ “các chất ức chế HDAC” thường được sử dụng cho những chất có
mục tiêu phân tử là các HDAC “cổ điển”.
1.1.3. CẤU TẠO CỦA HDAC
Cho tới nay, bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X
người ta xác định được cấu trúc 3D của hầu hết các HDAC và các trung tâm
xúc tác phản ứng deacetyl của chúng [25]. Theo đó, cấu trúc HDAC gồm các Hình1.3: Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC8
1.1.4. HDAC VÀ UNG THƯ
Những nghiên cứu trên phạm vi rộng đã chỉ ra rằng sự ức chế phiên mã
không thích hợp của HDAC là cơ chế phổ biến tạo ra các protein gây ung thư
[19, 22]. Cụ thể, mối tương quan giữa hoạt động của HDAC và sự tạo thành
khối u thể hiện rõ nhất trong bệnh ung thư bạch cầu tiền tủy bào cấp tính
(APL). Sự biến đổi trong cấu trúc chất nhiễm sắc có thể tác động lên quá trình
biệt hóa các tế bào bình thường, kết quả dẫn tới sự hình thành khối u. Ngoài
ra trong các tế bào ung thư người ta còn thấy sự hoạt động quá mức của
HDAC như ung thư cổ tử cung (HDAC2) [16], ung thư dạ dày (HDAC1, 2)
[10, 23,24]]; ung thư phổi (HDAC1, 3) [30, 34], ung thư đại tràng (HDAC1,
3, 6) [10, 30].
Các nghiên cứu có ý nghĩa thống kê đã chỉ ra rằng các HDAC liên quan
đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung
thư như chu trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chương trình, kể cả
sự di chuyển, sự xâm lấn và sự tạo mạch [9, 12, 19, 22]. Vai trò của các
HDAC trong quá trình sinh học của tế bào ung thư được tóm tắt như hình 1.4.

6
Hình 1.4: Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thư

1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC
1

không ức chế HDAC nhóm III [20] (xem hình 1.6).

Hình 1.6: Công thức cấu tạo của acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA)
M-carboxycinnamic acid bishydroxamid (CBHA) là chất ức chế HDAC
mạnh khác. Nó là cơ sở cấu trúc của nhiều dẫn chất khác bao gồm LAQ824 và
một dẫn chất sulfonamid PXD-101, cả hai chất này đều ức chế HDAC nhóm I
và II ở nồng độ nanomol [19, 21, 27].
Các HDACi có chứa nhóm hydroxamat đã được xác nhận là chúng
tương tác với vị trí xúc tác của HDAC, ngăn không cho cơ chất tiếp xúc với

8

ion Zn
2+
tại vị trí của nó. Nhược điểm của các hydroxamat là bị chuyển hóa
nhanh, ức chế không chọn lọc trên các HDAC [28].
1.2.1.2. Các acid béo mạch ngắn
Nhóm các acid béo mạch ngắn như phenylbutyrat cùng các dẫn chất và
các acid valproic (xem hình 1.7) có tác dụng ức chế HDAC tương đối yếu, ở
khoảng nồng độ micromol. Gần đây, một hợp chất có cấu trúc ghép giữa
phenylbutyrat và TSA (BL1521) đã được ghi nhận là có tác dụng ức chế ở
nồng độ micromol thấp [30].

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của acid valproic
1.2.1.3. Các peptid vòng
Nhóm các peptid vòng là nhóm có cấu trúc phức tạp nhất trong số các
HDACi, bao gồm: depsipeptid tự nhiên (FK228), apicidin và các phần tử khác
thuộc nhóm các CHAPs (các dẫn xuất của acid tetrapeptid hydroxamic vòng).
Trong khi hầu hết các hợp chất này là sản phẩm của vi khuẩn hoặc nấm, thì
apicidin và depsipeptide là sản phẩm kết hợp giữa acid hydroxamic và peptid

hóa [12, 13].
Các HDACi tác động tới tế bào ung thư theo ba cơ chế chủ yếu dưới
đây [12, 13, 18]:
- HDACi ức chế chu trình tế bào, hoạt hóa các chương trình biệt hóa.
- HDACi thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình (sau khi phát hiện
được các sai lệch về gen trong khi kiểm tra giai đoạn G2, tế bào ung thư được
đưa vào chu trình gây chết tế bào aptosis).
- HDACi ức chế sự tạo mạch.
1.2.2.1. Các chất HDACi gây ra sự biệt hóa
Khi là tác nhân riêng lẻ, các HDACi có thể ức chế chu trình tế bào
khiến cho nhiều loại tế bào ung thư bạch cầu và u rắn khác nhau phải thể hiện
đặc tính biệt hóa và ngừng tăng sinh. Phân tích các số liệu về chu trình tế bào
của các tế bào ung thư đã được điều trị với HDACi cho thấy các tế bào thường
dừng ở pha G1 nhưng đôi khi tích tụ đến pha G2 của chu trình.
Sự biệt hóa của tế bào tủy phụ thuộc vào sự hoạt hóa phiên mã của
RARα và protein gây ung thư PLZF-RARα làm ngắt quãng chương trình biệt
hóa bình thường. HDACi có thể kết hợp với RA để tạo ra sự biệt hóa tế bào
APL kháng hóa trị liệu PLZF-RARα cả in vivo và in vitro [16]. Tuy nhiên
HDACi cũng có thể gây ra sự biệt hóa ở rất nhiều loại tế bào khác, và các hiện
tượng phân tử có liên quan tới sự biệt hóa của các loại tế bào khác đó vẫn
chưa được sáng tỏ [9]. 11

1.2.2.2. Các chất HDACi thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình
Quá trình điều trị các tế bào ung thư với HDACi có thể dẫn đến sự gây
chết tế bào theo chương trình với mục đích kiểm soát số lượng tế bào bất
thường trong quá trình phát triển [9]. Người ta đã xác định hai con đường chết
nội bào với chức năng riêng biệt nhưng có mối liên hệ phân tử với nhau.

hàng loạt các dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC [2, 3, 6] (xem
hình 1.10). Các nghiên cứu và thử nghiệm cho thấy kết quả khả quan về khả
năng ức chế HDAC cũng như độc tính in vitro trên một số dòng tế bào ung
thư.
Các kết quả này đã tạo nền tảng cho tác giả phát triển theo hướng
nghiên cứu trên trong việc thiết kế công thức, tổng hợp và thu được những kết
quả nhất định trong khóa luận này.
Dưới đây là cấu trúc chung của một số dãy chất nghiên cứu đã công bố:
O
OH
O
N
H
S
N
NH
R
1
n
( )
n = 3,5
O
OH
O
NH
S
N
NH
R
2

N
S
NH
(
)
6
Hình 1.10: Cấu trúc chung của một số dãy chất nghiên cứu đã công bố
Nói chung cấu trúc của các chất ức chế HDAC thường bao gồm 3 phần
chính [23]:
- Phần A (nhóm nhận diện bề mặt hay nhóm khóa hoạt động – capping
group): thường là vòng thơm hoặc peptid vòng, thường nằm trên bề mặt
enzym; phần này liên quan tới hiệu lực và tính đặc hiệu của HDACi (thường
là aryl hoặc phenyl)

13

- Phần B (cầu nối): thường là các hydrocacbon thân dầu, nằm trong
lòng mạch enzym (như amid-alkyl).
- Phần C (nhóm kết thúc): có thể gắn với Zn
2+
trên vị trí tác dụng của
các enzym HDAC (zinc-binding group-ZBG), có thể là acid hydroxamic, các
thiol, benzamid, mercapoceton.
Mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế HDAC
mang cấu trúc acid hydroxamic có thể xem ở hình 1.11. Nghiên cứu thiết kế
công thức cho các HDACi mới đều dựa trên việc thay đổi cấu trúc của 3 phần
này.

Hình 1.11: Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC
dẫn chất acid hydroxamic

Trong HDACi nguyên mẫu,nhóm khóa hoạt động có thể liên kết với
phần cầu nối thông qua các nhóm cho hoặc nhận liên kết hydro như amid,
ceton. Đối với các HDACi có liên kết amid ở cầu nối, liên kết này có vai trò
quan trọng. Việc đảo chiều liên kết amid cũng làm thay đổi tác dụng của
HDACi, IC
50
giảm rõ rệt khi đổi chiều liên kết amid ở SAHA [8]. Tuy nhiên
việc thiếu hụt nhóm cho hoặc nhận liên kết hydro trong nửa liên kết tạo ra cơ
hội liên kết chặt chẽ hơn với các nhóm khác, dễ tổng hợp và thỏa mãn hơn về
dược động học [11].
Ngoài ra phần cầu nối chứa vòng thơm có thể ảnh hưởng tới tác dụng
ức chế chọn lọc HDAC, cũng như đến hiệu lực của HDAC. Nếu cầu nối là
mạch carbon béo mà thiếu nhóm nhận diện bề mặt như các acid béo mạch
ngắn thì hầu như không tương thích với túi enzym của HDAC nhóm IIb [8].
15

c. Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt
Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt nhằm khai thác sự khác biệt ở phần
miệng kênh enzym giữa các HDAC, từ đó có thể thiết kế công thức làm tăng
hoạt tính hoặc tăng khả năng ức chế chọn lọc. Nhóm nhận diện bề mặt chủ
yếu là các vòng, có thể là vòng thơm hoặc peptid vòng. Các nghiên cứu cho
thấy nhóm nhận diện bề mặt là vòng thơm thì tác dụng tốt hơn vòng no. Mặt
khác vòng lớn thường tốt hơn vòng nhỏ. Ví dụ khi thay nhóm phenyl của
SAHA bằng vòng indol thì IC
50
của dẫn chất indol nhỏ hơn SAHA nhiều lần [25].
Việc thay đổi phần A còn ảnh hưởng tới khả năng ức chế chọn lọc của