BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

HÀ THỊ LIÊN
Mã sinh viên: 1101288

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG
LEVETIRACETAM TRONG HUYẾT
TƢƠNG NGƢỜI BẰNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

HÀ THỊ LIÊN
Mã sinh viên: 1101288

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG
LEVETIRACETAM TRONG HUYẾT
TƢƠNG NGƢỜI BẰNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS Nguyễn Tƣờng Vy
2. ThS. Tạ Mạnh Hùng
Nơi thực hiện:



với rất nhiều nỗ lực và cố gắng, khi khóa luận này được hoàn thành là lúc tôi xin

TP

và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.

ẠO

Trước tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng gửi lời cảm

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

ơn tới PGS.TS Nguyễn Tƣờng Vy và Ths. Tạ Mạnh Hùng- Giám đốc Trung tâm

N

G

Đánh giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, là những

H
Ư

người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá

TR


Tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình tôi, cùng toàn thể bạn

ÁN

bè, những người luôn sát cánh, chia sẻ, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

D

IỄ
N

Đ

ÀN

TO

tập và nghiên cứu.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới những người đã quan tâm, hướng dẫn


1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa…………………………………

3

1.1.2. Tác dụng dƣợc lý và dƣợc động học…………………………………..

4

1.1.3. Chỉ định - chống chỉ định……………………………………………….

4

1.1.4. Một số chế phẩm trên thị trƣờng………………………………………

5

1.1.5. Các phƣơng pháp định lƣợng Levetiracetam…………………………

5

1.2. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO…………………………………….

7

1.2.1. Khái niệm……………………………………………………………….

7

ẠO


1.2.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký…………………………

8

A

1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC……………………………………

H

Ó

1.2.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký……………………

11
14

1.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC

15

1.3.1. Khái niệm………………………………………………………………..

15

1.3.2. Các chỉ tiêu thẩm định………………………………………………….

15


H

Trang

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com

19

2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi……………………………………….

19

2.1.2. Dụng cụ, máy móc, thiết bị……………………………………………..

20

Ơ

20
20



tƣơng…………………………………………………………………………..

23

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

28

3.1. XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG LEVET TRONG HT

28

3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và nội chuẩn………………….

28

B

TR
ẦN

H
Ư

2.3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích…………………………………..

32

3.1.3. Quy trình phân tích Levetiracetam trong huyết tƣơng………………

3.2.5. Tỷ lệ thu hồi..............................................................................................

38

3.2.6. Độ ổn định của hoạt chất trong HT……………………………………

39

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................

44

4.1. KẾT LUẬN ................................................................................................

44

4.2. KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………

45

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-



www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com

Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)

2

DĐH

Dược động học

3

ĐVTN

Động vật thí nghiệm

4

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao



8

LCMS

Sắc ký lỏng khối phổ

TR
ẦN

H
Ư

N

6

(Liquid Chromatography Mass Spectrometry)
LLOQ

Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantification)

10

LQC

Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ thấp

10
00


SKĐ

Sắc ký đồ

16

SPE

Chiết pha rắn (Solid-Phase Extration)

17

TKTW

Thần kinh trung ương

18

TĐSH

Tương đương sinh học

19

US-FDA

Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ

Đ


U
Y

N

H

1

N

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu,
STT
Ý nghĩa
chữ viết tắt

(The United States Food and Drug Administration)
20

UV-VIS

Tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet - Visible)

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


Thiết bị HPLC

2.6

Cách chuẩn bị mẫu đường chuẩn trong HT

2.7

Cách chuẩn bị mẫu QC trong HT

2.8

Chuẩn bị mẫu QC xác định độ đúng

3.1

Độ đúng của các mẫu thuộc các đường chuẩn

3.2

Kết quả xác định giá trị LLOQ

37

3.3

Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày

37


3.9

Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ 2ºC - 8ºC

40

Ơ

6

19
20
20
22
22
24
36

41

3.11

Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài

42

3.12

Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương sau xử lý (trong


B

TR
ẦN

H
Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q

U
Y

N

H

19

Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông - rã

Nội dung

Trang

Công thức cấu tạo của levetiracetam

3

3.1

Phổ hấp thụ UV-VIS của LEVET

28

3.2

SKĐ LEVET và nội chuẩn amoxicillin

3.3

SKĐ LEVET và nội chuẩn atenolol

3.4

SKĐ LEVET và nội chuẩn paracetamol

3.5

SKĐ phân tích mẫu chuẩn LEVET với pha động: acetonitril : dung


3.9

SKĐ mẫu HT sau khi tủa protein bằng acid HClO4

33

3.10

SKĐ mẫu HT sau khi chiết lỏng – lỏng với cloroform

33

3.11

SKĐ mẫu HT trắng

34

3.12

SKĐ mẫu HT trắng có chuẩn nội paracetamol

35

3.13

SKĐ mẫu chuẩn LEVET nồng độ 0,25 µg/mL có IS

35


dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ 4 : 96 (tt/tt)

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

29

N

3.6

G

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ 15 : 85 (tt/tt)

ẠO

TP

.Q

U
Y

N

H


H

gây ra với bệnh cảnh rất phức tạp và đa dạng. Bệnh này có thể gặp ở mọi tuổi, mọi

.Q

kinh trên thế giới khoảng 0,5% dân số, thay đổi tùy theo từng quốc gia, từng vùng,

TP

từng dân tộc. Tại Việt Nam khoảng 2% dân số mắc bệnh và trong đó có đến 60% số

ẠO

bệnh nhân là trẻ em [8] [9] [12] [17]. Tổ chức Y tế thế giới WHO và Liên đoàn

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

Quốc tế chống động kinh ILAE (International League Against Epilepsy) xác định:

N

G

“Động kinh là tình trạng tái diễn ít nhất hai cơn động kinh trở lên cách nhau trên 24



-L

Í-

thuốc kháng động kinh kéo dài.
Levetiracetam (C8H14N2O2, M =171,19 g/mol) là dẫn chất của pyrolidin, dùng để

ÁN

điều trị bệnh động kinh có hiệu quả và mới được Cơ quan quản lý Thuốc và thực

TO

phẩm Mỹ (US-FDA) cấp phép đăng ký lưu hành năm 2008. Levetiracetam

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U
Y

giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ người mắc bệnh động

D

IỄ
N

Đ

bằng phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu xây dựng một phương

N

hành đề tài: “Nghiên cứu định lượng Levetiracetam trong huyết tương người

N

pháp phân tích LEVET trong huyết tương có đủ độ nhạy, độ chính xác và phù hợp

TP

.Q

(TĐSH) các thuốc chứa hoạt chất levetiracetam. Để đạt được mục tiêu này, đề tài
thực hiện các nội dung:

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

1. Khảo sát, xây dựng phương pháp định lượng levetiracetam trong huyết tương

G

Đ

bằng phương pháp HPLC.



H
Ư

N

2. Thẩm định phương pháp xây dựng theo quy định của US-FDA.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U
Y

cho các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng (SKD) và tương đương sinh học

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN



B

TR
ẦN

H
Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

Công thức cấu tạo của LEVET được trình bày ở Hình 1.1.

ẠO

- Tên khoa học: (-)-(S)-α-Ethyl-2-oxo-1-pyrrolidin acetamid [21]

-L

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của levetiracetam [21]

ÁN


học không liên quan đến các thuốc điều trị động kinh khác hiện có. Cơ chế tác dụng

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
4

của LEVET chưa được biết rõ. Ở động vật, LEVET không bảo vệ chống lại được
cơn co giật đơn độc do dòng điện hoặc hóa chất. Thuốc chỉ bảo vệ rất ít kích thích

N

dưới mức tối đa và các test ngưỡng, nhưng bảo vệ được cơn co giật toàn thể thứ

H

Ơ

phát sau co giật cục bộ do hai hóa chất gây co giật tạo ra, có những đặc tính giống

N

như phức hợp co giật cục bộ thứ phát toàn thể ở người. LEVET cũng có đặc tính ức


TR
ẦN

LEVET ức chế sự bùng phát nhưng không ảnh hưởng tới kích thích thần kinh bình
thường, vì thế thuốc ngăn ngừa có chọn lọc tính đồng bộ quá mức của sự bùng phát

10
00

1.1.2.2. Dược động học

B

dạng động kinh và sự lan truyền của cơn động kinh [2].
Khi dùng đường uống, thuốc nhanh chóng hấp thụ từ ống tiêu hóa với sinh khả

Ó

A

dụng xấp xỉ 100%, nồng độ tối đa trong máu thường đạt được trong vòng 1,3 giờ và

H

trạng thái cân bằng đạt được sau 2 ngày. Tỉ lệ thuốc liên kết protein huyết tương

-L

Í-

trên 12 tuổi, có thể ngắn hơn ở trẻ nhỏ. LEVET được bài xuất qua sữa mẹ, thuốc có

thể được thải trừ ra khỏi cơ thể nhờ thẩm tách máu [2].
1.1.3. Chỉ định - chống chỉ định
1.1.3.1. Chỉ định

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
5

Levetiracetam là một dẫn chất tương tự piracetam, được sử dụng trong điều trị động
kinh. LEVET dùng phối hợp với các thuốc khác để:

N

- Điều trị cơn động kinh cục bộ, có hoặc không kết hợp với cơn động kinh

H

Ơ

toàn thể thứ phát ở người lớn và trẻ em từ 1 tháng tuổi trở lên.

H
Ư

1.1.3.2. Chống chỉ định

TR
ẦN

Quá mẫn với LEVET hoặc các dẫn chất của pyrolidon [2].
1.1.4. Một số chế phẩm trên thị trƣờng

B

Các chế phẩm LEVET trên thị trường chủ yếu dùng ở dạng viên nén hàm lượng

10
00

250, 500, 750 hoặc 1000 mg; viên nén giải phóng kéo dài: 500, 750 mg; dung dịch
uống 100 mg/mL (chai 150 mL, 300 mL); dung dịch pha truyền 100 mg/mL x 5 mL

Ó

A

[2]. Theo thống kê của Cục Quản lý dược và Tổng công ty dược Việt Nam hiện trên

H

thị trường dược phẩm Việt Nam có hơn 50 sản phẩm thuốc chứa hoạt chất LEVET,

N

Đ

hợp, chỉ có một số dị tố (N, O), nên hấp thụ UV-VIS kém và không có phổ huỳnh
quang. Do vậy, định lượng LEVET trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với

các detector phổ dụng như UV hoặc huỳnh quang gặp nhiều khó khăn. Hiện nay, để
định lượng LEVET trong dịch sinh học đa số các tác giả sử dụng phương pháp sắc
ký lỏng khối phổ (LC-MS). Tuy vậy, phương pháp LCMS kỹ thuật phân tích phức
tạp, thiết bị phân tích có giá trị kinh tế cao không phổ biến tại nhiều phòng thí

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
6

nghiệm ở nước ta. Do vậy, khó có thể áp dụng được. Một số phương pháp HPLC
định lượng LEVET trong dịch sinh học đã được công bố tuy nhiên có độ nhạy

N

không cao, không áp dụng được cho các nghiên cứu SKD/TĐSH thuốc LEVET.

Chiết

Điều kiện sắc ký

TP

Phương pháp xử lý mẫu

H
Ư

N

- Detector: MS
Chiết SPE

- Cột C18, 100 x 3 mm, 1,8 µm

[13]

TR
ẦN

- Pha động: Amoni acetat pH 3,2 : acetonitril,
tỷ lệ 20 : 80

B

- Chuẩn nội: Chlonazepam



TO

Tủa protein bằng MeOH,

KH2PO4 tỷ lệ 6 : 94

acid perchloric. Sau đó

phosphat chứa triethylamin, pH 6; tỷ lệ 6:5:89

chiết SPE.

- Chuẩn nội: Adenosin

D

IỄ
N

Đ

ÀN

acetonitril, kẽm sulphat và - Pha động: MeOH : MeCN : dung dịch đệm

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Bảng 1.1. Một số nghiên cứu định lượng LEVET trong HT người

N

thể thực hiện được tại một số ít phòng thí nghiệm hiện đại vì thiết bị phức tạp

H

Ơ

và chi phí phân tích cao. Do thiết bị phân tích không phổ biến nên chúng tôi

N

không lựa chọn phương pháp này để định lượng LEVET trong HT người.

Phương pháp 3: Phân tích bằng HPLC với detector UV, quy trình xử lý tương

TP

.Q

đối phức tạp gồm 2 kỹ thuật tủa protein với acid và chiết lỏng - lỏng bằng
cyclohexan. Tuy vậy, giới hạn định lượng của phương pháp không cao (1,0

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

µg/mL) không phù hợp để định lượng LEVET trong HT người tham gia các


Dựa trên sự tham khảo các tài liệu đã được công bố và dựa vào tính chất lý hóa
của LEVET, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng LEVET trong

Ó

A

HT bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS bằng cách cải tiến các phương

H

pháp HPLC đã được công bố của các tác giả. Phương pháp xây dựng sử dụng chất

-L

Í-

nội chuẩn phù hợp đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của phương pháp

ÁN

phân tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm

TO

nghiệm của Việt Nam.

ÀN

1.2. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
8

nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế: Hấp phụ, phân tán, trao đổi ion,
loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt [5], [7].

N

1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC

H

Ơ

1.2.2.1. Hệ thống bơm

N

Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được điều chỉnh được

TP

.Q

định, phù hợp với quá trình sắc ký.
1.2.2.2. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lí dung môi

www.daykemquynhon.ucoz.com

10
00

1.2.2.4. Cột sắc ký

Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở cột xảy ra

Ó

A

quá trình phân tách các chất. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất,

H

chịu được áp suất cao tới vài trăm bar.

-L

Í-

Cột có nhiều cỡ khác nhau, tùy theo mức độ và mục đích của quá trình sắc ký.

ÁN

Nhìn chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10-25cm, đường kính 2-5mm.

TO

1.2.2.5. Bộ phận phát hiện

www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
9

của píc. Xác định thời gian lưu để định tính các chất trên sắc ký đồ, với một chất
nhất định tR là một hằng số khi tiến hành nhiều lần sắc ký trong cùng điều kiện.

N

Trong một phép phân tích còn có thời gian lưu hiệu chỉnh hay thời gian lưu thực

H

Ơ

(tR’), được tính bằng công thức sau:

TP

.Q

Nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì píc bị loãng, thời gian
phân tích kéo dài.

www.daykemquynhon.ucoz.com


10
00

Hệ số phân bố (K) là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung

Ó

CS
CM

H

k

A

bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột.

-L

Í-

Trong đó: CS và CM là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và pha động.

ÁN

Hệ số phân bố K phụ thuộc vào: Bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất

TO

k'  k 

vS Qs
t t
t'

 R  R 0
vR QM t '0
t0

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
10

Hệ số dung lượng k’ phụ thuộc: Bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc
điểm cột, thể tích pha động và pha tĩnh. Trong phân tích thường chọn cột, pha động

N

và các điều kiện phân tích sao cho: 1≤ k ’≤8 [5], [7].

H

chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [5], [7].

H
Ư

W
2a

TR
ẦN

F

N

1.2.3.5. Hệ số đối xứng của píc F

Trong đó:

B

W: Chiều rộng của píc đo ở 1/20 chiều cao của píc.

10
00

a: Khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh píc đến mép đường cong
phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao píc [5], [7].

Ó

N

Đ

ÀN

TO

Trong đó:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U
Y

chọn lọc α :

W1/2: Chiều rộng píc đo ở nửa chiều cao của đỉnh píc.

W: Chiều rộng của píc đo ở đáy píc [5], [7].

1.2.3.7.Độ phân giải Rs của cột
Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)
N  16[

1.18.(t( R ) A  t( R ) B )
tR 2
t
] N  5,54[ R ]2 hoặc Rs 

N

1.2.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

TP

.Q

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của

ẠO

một hỗn hợp nhiều chất. Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký được

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

chia thành 2 loại:

G

Đ

- Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân tích

N

thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực.

TR

10
00

đảo: Pha tĩnh trên nền silica (Hình 1.2) có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất.

Hình 1.2. Gốc siloxan

Đ
IỄ
N
D

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U
Y

1.3.4.1 Lựa chọn pha tĩnh cho HPLC

Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc siloxan:
- R là các nhóm phân cực (ưa nước): Nhóm -OH hoặc các alkylamin -CH2-NH2,
alkyl nitril - CH2-CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha thuận để phân
tích các chất ít hoặc không phân cực [15].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

ẠO

theo môi trường pH phân tích. Trong môi trường acid mạnh, pH < 2 thì có sự phân

G

Đ

ly các nhóm ether ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân

N

tích không thể tương tác với cột. Trong môi trường base (pH>7), các nhóm -OH

H
Ư

trong cột sẽ tương tác với chất tan có tính base. Tương tác này khác với kiểu tương

TR
ẦN

tác của chất tan với nhóm -SiC18, dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có
những đỉnh ra khác nhau hay là hiện tượng kéo đuôi làm cho việc tích phân tính

B



liên kết của cột LC-DB được trình bày ở hình 1.3.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U
Y

N

đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân

Hình 1.3. Cấu trúc pha tĩnh cột LC-DB
Có một cách khác để loại trừ bớt sự ảnh hưởng của nhóm -OH mà không cần
tương tác với nó là thay những nhóm methyl của -Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm
thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che chắn đi những nhóm -OH,
được trình bày ở hình 1.4:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com



G

Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký và là yếu tố

H
Ư

thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp. Trong sắc ký pha đảo, pha

TR
ẦN

động là dung môi phân cực như: Nước, methanol, acetonitril… hoặc hỗn hợp của
chúng. Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ.

B

Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký như:

10
00

Độ chọn lọc α, thời gian lưu tR, độ phân giải Rs, độ rộng của đáy píc… nên việc
phân tích, lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng.

Ó

A



IỄ
N

Đ

ÀN

+ Các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả
- Bản chất của dung môi để pha pha động.
- Thành phần các chất trong pha động.
- pH của pha động.
- Tốc độ dòng của pha động.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
14

+ Chọn đệm - pH: Trong sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính chất acid hoặc base
thường phải sử dụng đệm ở pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. Giá trị pH

N


N

1.2.5. Phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC

G

Đ

theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác nhau [15].

TR
ẦN

- Đánh giá diện tích píc: Để tính diện tích píc có thể dùng tích phân kế hoặc dùng
máy tính đã cài đặt sẵn chương trình.

B

- Đánh giá chiều cao của píc với điều kiện các chỉ số k’ là hằng định. Đo chiều

10
00

cao của píc chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình.
1.2.5.2. Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC

Ó

A

các chất phân tích được tốt nhất mà đạt hiệu quả cao về thời gian và kinh tế [15].

D

IỄ
N

Đ

ÀN

nhược điểm của phương pháp chuẩn ngoại, giúp hạn chế tối đa những sai số có thể

gây ra do máy móc, kỹ thuật nhất là với những qui trình xử lý mẫu phức tạp và các
mẫu có hàm lượng chất cần định lượng thấp.
+ Nguyên tắc phương pháp chuẩn nội: Thêm cả vào mẫu chuẩn và mẫu thử những
lượng bằng nhau của một chất tinh khiết (chất chuẩn nội) rồi tiến hành sắc ký trong
cùng điều kiện.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
15


hóa nhiều điểm. Để chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy chuẩn ít nhất là 5 mẫu

G

Đ

có nồng độ chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng chứa một lượng chuẩn nội bằng

H
Ư

N

nhau.Tiến hành chạy sắc ký các mẫu, ta xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương
quan giữa tỷ số diện tích (hay chiều cao) píc của chất chuẩn với chuẩn nội (SS/SIS)
tìm ra nồng độ chất thử [5], [7].

TR
ẦN

so với tỷ số nồng độ chất chuẩn với chuẩn nội (CS/CIS). Dựa vào đường chuẩn để

B

1.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC

10
00


Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U
Y

- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.

D

IỄ
N

Đ

ÀN

sinh (các muối vô cơ, lipid, protein và chất chuyển hóa) và sự khác nhau giữa các cá
thể, lượng mẫu ít, nồng độ chất phân tích thường rất thấp. Do vậy, phương pháp
phân tích sinh học phải được thẩm định trước khi áp dụng vào phân tích mẫu để
đảm bảo độ tin cậy [11], [19].

1.3.2. Các chỉ tiêu thẩm định
Nội dung thẩm định phương pháp được hướng dẫn trong các thẩm định phương

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial



ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

Tính chọn lọc - đặc hiệu được coi là đạt khi kết quả thu được trên SKĐ cho các

G

Đ

đáp ứng píc thỏa mãn đồng thời các điều kiện sau:

N

- Píc của chất phân tích và IS phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách được

H
Ư

hoàn toàn khỏi píc tạp và đáp ứng các yêu cầu: Hệ số kéo đuôi T ≤ 2,0; độ phân giải

TR
ẦN

(Rs) giữa píc của chất phân tích, píc IS với píc gần nhất phải lớn hơn 1,5.
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng píc của từng

B


quy (phương pháp bình phương nhỏ nhất).
Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U
Y

diện “chất cần phân tích” và không bị “nhầm lẫn” bởi các chất khác. Do vậy, kết

D

IỄ
N

Đ

ÀN

chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Đường chuẩn gồm:
1 mẫu trắng (dịch sinh học không có chuẩn và IS).
1 mẫu zero (dịch sinh học có chuẩn nội, không có chuẩn).
6 mẫu non-zero (dịch sinh học có bổ sung chuẩn và IS) có nồng độ chất chuẩn

pha trong cùng một mẫu dịch sinh học, bao phủ toàn bộ dãy nồng độ mong muốn.
Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu phân tích.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú



- Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó
LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêu chuẩn.

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

- Có hệ số tương quan r ≥ 0,99.

G

Đ

1.3.2.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

N

LLOQ là nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn có thể định lượng được với độ

TR
ẦN

đúng và độ chính xác của phương pháp.

H
Ư

đúng và độ chính xác chấp nhận được. Do đó giá trị LLOQ thể hiện độ nhạy, độ

* Độ chính xác (precision): Độ chính xác của phương pháp phân tích là mức độ

TO

thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình được áp dụng lặp đi lặp lại
nhiều lần trên cùng 1 mẫu thử đồng nhất. Độ chính xác bao gồm độ lặp lại trong

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U
Y

LLOQ được chấp nhận 80% -120%.

D

IỄ
N

Đ

ÀN

ngày và độ lặp lại khác ngày, được biểu thị bằng giá trị của hệ số biến thiên CV(%).
Trong đánh giá TĐSH, độ chính xác của phương pháp bao gồm độ lặp lại

(repeatability) ở những thời điểm khác nhau (trong ngày và khác ngày) và độ tái lặp
(reproducibility). Phương pháp xác định độ lặp lại là thực hiện phân tích trên một
mẫu thử đồng nhất n lần (n ≥ 5) cùng một lúc và trong cùng một thời điểm hoặc