Sản xuất enzyme Protease tái tổ hợp
từ chủng Bacillus sp
I. Tổng quan về enzyme Protease và vi khuẩn Bacillus
1. Tổng quan về enzyme Protease
1.1. Giới thiệu chung
* Protease là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt liên kết peptide (CO-NH)
trong phân tử polypeptide, protein và một số cơ chất khác tương tự thành các
amino acid tự do hoặc các peptide phân tử thấp.
* Phân loại:
**Dựa vào vị trí tác dụng cua protease lên các liên kết peptide trong phân tử
protein, người ta chia protease ra làm hai nhóm chính:
Endopeptidase (protease): chủ yếu phân giải các liên kết peptide nằm trong
phân tử protein tạo thành những đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ
(polypeptide mạch ngắn, peptone,..).
Exopeptidase (polypeptidase): chủ yếu phân cắt liên kết ở hai đầu mạch. Ví dụ:
nhóm cacboxylpeptidase và aminopeptidase phân giải liên kết peptide từ hai đầu
mạch polypeptide có nhóm cacboxyl và amin tự do
** Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu cho hoạt động của
protease, người ta chia protease thành các nhóm như sau:
_ Protease axit: pepsin, renin,... hoạt động ở vùng pH axit
_ Protease kiềm: trypsin, chymotrypsin,...hoạt động ở vùng pH kiềm, có nhiều
ở hệ enzym ruột non, tuyến tụy, nấm men.
_ Protease trung tính: amylase, papain,.. hoạt động ở vùng pH trung tính. Loại
protease này có rất nhiều ở các loài nấm mốc khác nhau. Ngoài nấm mốc ra
protease trung tính còn thấy ở vi khuẩn Bacillus
Tuy nhiên, việc tạo ra các loại protease axit, trung tính hay kiềm còn phụ thuộc
rất nhiều ở thành phần môi trường hoặc vào cơ chất mà chúng tác dụng.


**Dựa vào cơ chế thủy giải liên kết peptide liên quan tới cấu trúc đặc biệt của
trung tâm hoạt động. Protease được chia làm 4 nhóm nhỏ, tên các nhóm này

hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein
qua màng


- Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ
tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ
vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật
(gan, dạ dày bê...).
1.2.Đặc điểm và tính chất của Protease vi sinh vật
Trước hết hệ Protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều
enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó
tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên Protease vi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng.

2. Tổng quan nguồn thu nhận Protease từ vi khuẩn Bacillus
Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do
hàng loạt những ưu điểm về sinh lí vi sinh vật và về kĩ thuật sản xuất sau đây:
- Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối
lượng cơ thể chúng hàn ngàn lần sau một ngày đêm
- Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao
- Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau.
- Tốc độ sinh sản của vi sinh vật nhanh trong thời gian ngắn có thể thu được
lượng sinh khối vi sinh vật lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được một
lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao
- Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành,
kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều.
- Vi sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp do trong sản suất,
quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp hoàn toàn không phụ thuộc và
khí hậu bên ngoài

enzym phân giải protein mà ngày nay gọi là pepsin.
Năm 1957, Corvisart tách được trypsin từ dịch tụy đó là protease đầu tiên ở
dạng chế phẩm nhưng chưa được tinh sạch. Brucke (1861) tách được pepsin từ
dịch dạ dày chó ở dạng tương đối tinh khiết. Danilevxki (1862) dùng phương
pháp hấp phụ trên colodion đã tách được trypsin với amylase tụy tạng. Phương
pháp nghiên cứu hấp phụ này có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu tinh chế enzym


cũng như protein. Sau đó hàng loạt các protease được nghiên cứu và tách ra ở
dạng chế phẩm như: chymotrypsin được Hommarsten tách ra vào năm 1872;
papain được Wurtz tách ra từ các phần khác nhau của cây đu đủ; bromelin được
Willstatter, Grassmann, Ambros tách ra từ các phần của cây dứa; cathepsin cua
mô động vật được Willstatter Bamann tách ra vào năm 1929.
Từ năm 1930 đến nay, sau khi Summer (1926) kết tinh được urease từ đậu
tương, các nhà khoa học đã kết tinh được hàng loạt các protease. Nhờ kết tinh
được enzym có độ tinh sạch cao nên người ta đã nghiên cứu được cấu trúc phân
tử, cấu trúc trung tâm hoạt động, tính chất hóa lý và tính đặc hiệu của các
protease.
Từ năm 1950 đến nay, nhờ sử dụng một số phương pháp mới để tinh chế protein
và enzym nên người ta đã tách được các dạng khác nhau của nhiều protease, ví
dụ như năm 1959 Ryle và Porter dùng phương pháp sắc ký trao đổi ion đã tách
được hai thành phần trong chế phẩm pepsin lợn là pepsin B và pepsin C.
Metrione Neves và Fruton (1966) dùng phương pháp lọc qua gel sephadex kết
hợp với sắc ký trao đổi ion đã thu được chế phẩm cathepsin đồng nhất,... Trong
những năm 1950 đến nay, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu protease
VSV và đạt được một số thành tựu đáng kể như: năm 1950 Giintelberg và
Ottesen tách được protease kiềm từ Bac.subtilis, năm 1967 Danno và Yoshimura
tách được protease cua Asp.sydowi
2.4.2. Một số nghiên cứu về protease ở Việt Nam
Năm 1964, Nguyễn Lân Dũng, Đào Trọng Hùng và Ngô Khắc Truy nghiên cứu

4R bão hòa/ 1 dd chiết, thu được CPE protease có hoạt tính cao nhất [20].
Các nghiên cứu về protease trên thế giới nói chung và ở Việt nam nói riêng đã
mở ra một hướng đi mới cho việc nghiên cứu ứng dụng protease trong thực tiễn
cuộc sống.