ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
–––––––––––––––––––

TRẦN THỊ BÍCH HẢO

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƢỢNG
CỦA THUỐC ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƢỜNG
TYP II METFORMIN HYDROCHLORIDE BẰNG
CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2016
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
–––––––––––––––––––

TRẦN THỊ BÍCH HẢO

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƢỢNG
CỦA THUỐC ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƢỜNG
TYP II METFORMIN HYDROCHLORIDE BẰNG
CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI
Chuyên ngành: Hoá Phân Tích
Mã số: 60 44 0118

Trần Thị Bích Hảo

a
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... a
MỤC LỤC ......................................................................................................... b
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ e
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................. g
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 2
1.1. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc ..................................... 2
1.1.1. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR) .......................................................... 2
1.1.2. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) ................................ 3
1.1.3. Phƣơng pháp phổ khối lƣợng (MS) ........................................................ 5
1.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng - sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........ 7
1.2.1. Khái niệm ................................................................................................ 7
1.2.2. Phân loại .................................................................................................. 8
1.2.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo ................................................................. 8
1.2.4. Pha động trong sắc ký pha đảo................................................................ 9
1.2.5. Detector dad .......................................................................................... 10
1.2.6. Detector ms ........................................................................................... 11
1.3. Khái quát về bệnh tiểu đƣờng .................................................................. 13
1.3.1. Phân loại bệnh tiểu đƣờng ..................................................................... 13
1.3.2. Các thuốc điều trị bệnh tăng đƣờng huyết ............................................ 14
1.3.3. Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đƣờng ............................. 15

3.1.2. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phƣơng pháp IR .... 27
3.1.3. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phƣơng
pháp NMR ...................................................................................................... 28
3.1.4. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phƣơng pháp MS . 30
3.2. Phân tích tìm kiếm các phƣơng pháp kết tinh metformine
hydrochloride để thu đƣợc độ sạch cao nhất ................................................... 31
3.3. Hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp hplc .............. 31
KẾT LUẬN .................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 35
PHỤ LỤC
c
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




d
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

13

C- NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon-13 (13C Nuclear Magnetic
Resonance)


Phần triệu (parts per million)

s

singlet

dd

Double doulet

CHCl3

Clorofrom

EtOH

Ethanol

MW

Microwave

MeOH

Methanol

OMe

Methoxy

Hình 1.3: Phổ khối lƣợng của benzamit............................................................ 7
Hình 1.4: Cấu trúc của cột ODS. ...................................................................... 9
Hình 1.5. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang........................................................ 10
Hình 1.6. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector ........................... 11
Hình 2.2: Biểu đồ đƣờng chuẩn. ..................................................................... 25
Hình 3.1: Phổ IR của hợp chất metformin hydrochloride .............................. 27
Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của chất metformin hydrochloride ........................... 29
Hình 3.3: Phổ 13C-NMR của chất metformin hydrochloride .......................... 29
Hình 3.4: Phổ MS của metformin hydrochloride............................................ 30
Hình 3.5: Biểu đồ đƣờng chuẩn định lƣợng.................................................... 32
Hình 3.6: Sắc kí đồ HPLC của metformin hydrochloride .............................. 33

g
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




MỞ ĐẦU
Metformin đƣợc mô tả năm 1957 nhƣ chất có hoạt tính hạ đƣờng
huyết và năm 1979 đƣợc đƣa ra thị trƣờng ở Pháp nhƣng đến tận 1994 mới
đƣợc FDA cho phép lƣu hành để chữa bệnh tiểu đƣờng Typ 2 ở Mỹ.
Metformin là một thuốc chống đái tháo đƣờng nhóm biguanid, có cơ chế tác
dụng khác với các thuốc chống đái tháo đƣờng nhóm sulfonylure.
Trƣớc đây, để xác định đƣợc cấu trúc phân tử một hợp chất hữu cơ đặc
biệt là cấu trúc và độ sạch của các hợp chất ứng dụng trong dƣợc phẩm không hề
đơn giản; có thể mất đến hàng năm hoặc vài năm. Để xây dựng đƣợc tiêu chuẩn
của hợp chất chính trong dƣợc phẩm là một công việc cực kì khó khăn và tốn
kém. Ngày nay, với các công cụ là các phƣơng pháp phân tích hóa lý hiện đại,
việc phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ đã trở thành đơn giản, có khi chỉ tốn

động cao hơn. Có 2 lại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị
và biến dạng, dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết,
dao động biến dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết.
Đƣờng cong biểu diễn cƣờng độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng
ngoại đƣợc gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với
những dao động đặc trƣng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định, (Hình 1.1).

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của benzyl ancol
Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo đƣợc đối chiếu với các dao động đặc
trƣng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân
tử. Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của
các phân tử khác nhau thì khác nhau, tƣơng tự nhƣ sự khác nhau của các vân
ngón tay. Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thƣờng đƣợc làm dẫn
chứng cho hai hợp chất giống nhau [3].
Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu đƣợc
chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trƣng. Các
pic nằm trong vùng từ 4000 - 1600 cm-1 thƣờng đƣợc quan tâm đặc biệt, vì
vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, nhƣ OH, NH, C=O,
C≡N… nên đƣợc gọi là vùng nhóm chức. Vùng phổ từ 1300 - 626 cm-1 phức
tạp hơn và thƣờng đƣợc dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định
nhóm chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến
hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 đƣợc gọi là vùng vân ngón tay [3].
1.1.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (CHTHN) là phƣơng pháp vật lý hiện đại

Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hƣởng của chất chuẩn TMS và của
hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hƣởng của máy phổ.
Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học đƣợc định nghĩa
một các tổng quát nhƣ sau:


 chuan  x
.10 6 ( ppm)
o

Trong đó: νchuan, νx là tần số cộng hƣởng của chất chuẩn và của hạt
nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hƣởng của máy phổ.
Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hƣởng của đám mây electron bao
quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C
trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến
chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học
của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hƣởng ở trƣờng yếu
hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [1].
Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết đƣợc loại proton nào có mặt
trong chất đƣợc khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên
mà đƣợc tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12
ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm.

4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Hình 1.2: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat


ABC
ABC

e
ABC

2

3e (2)

ABC-

Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại là các
ion mang điện tích +2 và điện tích âm (-). Năng lƣợng bắn phá các phân tử
thành ion phân tử khoảng 10 eV. Nhƣng với năng lƣợng cao thì ion phân tử
có thể phá vỡ thành các mảnh ion dƣơng (+), hoặc các ion gốc, các gốc, hoặc
phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên ngƣời ta thƣờng thực hiện bắn phá các phân
tử ở mức năng lƣợng 70 eV [3].
ABC

A

ABC

AB

AB

A

lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến bằng liên
kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phƣơng pháp này ngày càng đƣợc sử
dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định
lƣợng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phƣơng pháp HPLC rất rộng , nhƣ phân tích các
hợp chấ t thuốc trừ sâu , thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong
lĩnh vực thực phẩm, dƣợc phẩm, môi trƣờng…
7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




1.2.2. Phân loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, ngƣời
ta chia HPLC thành 4 loại:


Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).



Sắc ký phân bố (partition chromatography).



Sắc ký ion (ion chromatography).




không thể ứng dụng phƣơng pháp rửa giải gradient dung môi.

8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Vì vậy, ngƣời ta thƣờng chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên
kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu
trúc dạng này.
Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu nhƣ không phân
cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl mạch dài nhƣ C8 (n-octyl), C18 (noctadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn
nhƣ C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân
cực cao hơn nhóm alkyl. Ngƣời ta nhận thấy các alkyl mạch dài cho kết quả
tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại đƣợc sử dụng nhiều nhất.

Hình 1.4: Cấu trúc của cột ODS.
1.2.4. Pha động trong sắc ký pha đảo
Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:


Hòa tan mẫu phân tích.



Phù hợp với đầu dò.




(chế độ isocratic) hoặc đƣợc thay đổi theo một chƣơng trình đã định sẵn
(chƣơng trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.
1.2.5. Detector dad
Trung tâm của thiết bị là một dãy diot hàng trăm chiếc (những máy
hiện nay có thể lắp 1024 diot) đƣợc sắp xếp cạnh nhau liên tục thành dãy trên
tấm silicon tinh khiết, kích thƣớc 1-6 cm, độ rộng của mỗi diot riêng là
0,0015 - 0,050 mm.

Hình 1.5. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Trên mỗi tấm silicon còn có một tụ điện, một công tắc cho mỗi diot. Hệ
thống đƣợc điều khiển bằng computer luôn ngắt mỗi công tắc làm cho tụ điện
đƣợc tích - 5V. Khi bức xạ chiếu vào mặt diot làm đóng mạch điện và tụ điện
phóng điện. Sự nạp điện lại đƣợc tiếp tục ở chu kỳ tiếp theo. Kết quả là dòng
điện tỷ lệ với lƣợng bức xạ chiếu vào, khuếch đại, số hóa và ghi lại vào bộ nhớ.

a) đường quang chữ Z,

b) đường quang bong bóng, c) đường quang phản xạ nhiều lần.

Hình 1.6. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector
(cải tiến flowcell)
1.2.6. Detector ms
Phƣơng pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phƣơng pháp
nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lƣợng phân tử của

Ƣu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí
quyển ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử
dụng trƣớc đó cho LC/MS nhƣ bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục
(continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay nhƣ tia nhiệt
(thermospray - TS) đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự
ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân
tích nhờ đó thu đƣợc khối phổ của ion phân tử . Ngoài ra, với kỹ thuật này,
ngƣời ta có thể điều khiển đƣợc quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những
ion con tùy theo yêu cầu phân tích.
Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS:
* Ion hóa tia điện (electrospray ionization - ESI).
* Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical
ionization - APCI).
* Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure
Photoionization - APPI).
Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI , đă ̣c biê ̣t là ESI đƣợc sử dụng
nhiều hơn cả.
***Các loại đầu dò khố i phổ
Có các loại tổng quát sau:
* Sự uấn cong nhờ từ trƣờng (Magnetic field deflection).
12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




- Máy khối phổ đơn giản sử dụng từ trƣờng (a single focussing
magnetic sector mass spectrometer): máy có độ phân giải thấp.
- Máy khối phổ nhị tiêu (double focussing mass spectrometer): sự uốn
cong nhờ từ trƣờng và điện trƣờng, máy có độ phân giải cao.

- Bệnh tuyến tụy ngoại tiết ....
1.3.2. Các thuốc điều trị bệnh tăng đường huyết
Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh tiểu đƣờng
đƣợc chia thành 3 nhóm chính nhƣ sau:
- Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin.
- Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin.
- Các thuốc chống tăng đƣờng huyết sau bữa ăn.
a) Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin:
+ Insulin:
Insulin là hormon do tế bào  của tuyến tuỵ tiết xuất, đóng vai trò chủ
yếu trong cơ chế điều hoà đƣờng huyết của cơ thể. Insulin là một trong những
hormon quan trọng của cơ thể, không chỉ tác dụng trên chuyển hoá năng
lƣợng và phát triển cơ thể, mà còn là chất cần thiết cho sự sống. Tác dụng của
insulin bao gồm các đáp ứng phức tạp mà ảnh hƣởng cuối cùng là trên chuyển
hoá glucid, lipid và protid.
+ Thuốc kích thích bài tiết insulin.
Các sulfonylurea.
Năm 1942, Janbon đã tình cờ phát hiện tác dụng hạ đƣờng huyết của dẫn
suất sulfonamid (1154RP) ở những bệnh nhân điều trị sốt thƣơng hàn. Từ
phát hiện này, nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đƣờng huyết của các
sulfonylurea đã đƣợc tiến hành. Các nghiên cứu ngày càng làm sáng tỏ cơ chế
tác dụng của thuốc. Nhiều thuốc thuộc nhóm sulfonylurea đã ra đời, bao gồm
các thuốc thế hệ I (tolbutamide, chlorpropamide) và các thuốc thế hệ II
(Glyburide, Glypizide). Các thuốc này đang đƣợc sử dụng rộng rãi trên lâm
sàng, đem lại nhiều kết quả khả quan cho ngƣời bệnh.
b) Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin.
Các biguanide:
14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


(Momordica

charantia

L.Cucurbitaceae),

hoàng

kỳ

(Astragalus

membranaceus, Fabaceae), Huyền sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl,
Scrophulariaceae)...
15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




1.4. Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng metformine hydrochloride
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Cho đến nay, ở trong nƣớc có duy nhất một công trình nghiên cứu tổng
hợp metformin từ CaO, ure và dimethylamin. Quá trình tổng hợp đƣợc đƣợc
tiến hành qua 3 bƣớc [5]:
* Bƣớc 1: Tổng hợp calci cyanamide:

Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid.
Calci cyanamide đƣợc tạo thành phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ
phản ứng. Theo tác giả Ngô Quốc Huy, quá trình phản ứng thực hiện theo