BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….W U X….

CHÂU THỤY VY

XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN GENE blaPER-1 CỦA VI KHUẨN
ACINETOBACTER BAUMANNII TIẾT
β-LACTAMASE PHỔ RỘNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 11/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….W U X….

CHÂU THỤY VY

XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN GENE blaPER-1 CỦA VI KHUẨN
ACINETOBACTER BAUMANNII TIẾT
β-LACTAMASE PHỔ RỘNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số

: 60.42.80



4. Phản biện 2:

PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI
Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM

5. Ủy viên:

TS. BS. PHẠM HÙNG VÂN
Trường Đại học Y Dược TP. HCM

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
HIỆU TRƯỞNG

i


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên là Châu Thụy Vy, sinh ngày 12 tháng 04 năm 1982 tại thành phố
Cần Thơ. Con Ông Châu Thành Cang và Bà Lữ Cẩm Hường.
Tốt nghiệp Phổ thông trung học tại Trường phổ thông trung học Châu Văn
Liêm, thành phố Cần Thơ năm 2000.
Tốt nghiệp Đại học ngành Công nghệ sinh học hệ chính quy tại Đại học Mở
Bán Công Thành phố Hồ Chí Minh năm 2005.
Tháng 09 năm 2006 theo học Cao học ngành Công nghệ sinh học tại Đại
học Nông Lâm, Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh.
Địa chỉ liên lạc: 35/11 Nguyễn Xuân Ôn, Phường 2, Quận Bình Thạnh,
Thành phố Hồ Chí Minh.
Điện thoại: (08)38413209 hoặc 0918867052.
Email: [email protected].

khuyến khích, động viên và hỗ trợ tôi vượt qua chính mình.

iv


TÓM TẮT
Sự gia tăng khả năng kháng thuốc của Acinetobacter baumannii trong
thập niên qua, một trong những cơ chế đề kháng đa kháng sinh là khả năng tiết
β-lactamase thuỷ phân các kháng sinh thuộc họ belactam được gọi là Expanded
Spectrum Betalactamase (ESBL). Trong đó, PER-1 là một ESBL có khả năng
đề kháng kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin và aztreonam. Do đó, dựa vào
kiểu hình để phát hiện sự hiện diện của ESBL trên Acinetobacter baumannii là
mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi. Nghiên cứu này đã được thực hiện với đề
tài “Phát hiện gen blaPER-1 nhằm xác định kiểu hình β-lactamase phổ rộng của
vi khuẩn Acinetobacter baumannii” tại phòng thí nghiệm công ty Nam Khoa,
thời gian từ tháng 10 năm 2009 đến tháng 08 năm 2010.
Dựa vào kết quả kiểu hình kháng sinh đồ của khoảng 350 chủng
Acinetobacter spp. được phân lập từ 3.000 mẫu bệnh phẩm ở bệnh viện
Nguyễn Tri Phương, Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 01 năm 2009 đến 06
năm 2010, chúng tôi nhận thấy trong đó chỉ có 3 chủng Acinetobacter spp. có
kiểu hình ESBL dương tính và đồng thời chọn 3 chủng Acinetobacter spp. có
kiểu hình ESBL âm tính ngẫu nhiên làm đối chứng. Tất cả 6 chủng
Acinetobacter spp. này được định danh lại với hệ thống định danh IDS 14 GRN
và trình tự 16S rDNA xác định loài Acinetobacter baumannii. Phát hiện sự hiện
diện của ESBL được xác định dựa vào kiểu hình và kiểu gen: (i) Phương pháp
xác định kiểu hình dựa vào sự mở rộng vòng vô khuẩn ở vùng giao tiếp giữa
cephalosporin và clavulanate gồm phương pháp đĩa đôi và đĩa kết hợp; (ii)
Phương pháp dựa vào kiểu gen gồm phương pháp PCR và giải trình tự khuếch
đại vùng gen blaPER-1 với cặp mồi đặc hiệu đã được công bố trên thế giới. Kết
quả giải trình tự nucleotide được so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI.

Acinetobacter baumannii based on the suitable bio-chemical reactions by using the
IDS 14 GNR system and 16S rDNA. ESBL expressing status of the strains was
determined by the phenotypic and genotypic tests: (i) The phenotypic test, which
is based on seeking synergy between cephalosporins and clavulanate, includes the
double disc and combination disc methods; (ii) The genotypic test includes the
direct PCR method with the PCR-amplified the blaPER-1 gene by using previously
reported primers and the gene sequencing techniques. Nucleotide sequence
analysis was performed at the National Center of Biotechnology Information
Website.

vii


A detailed analysis of the results not only determined ESBL expressing
status based on the phenotypic test and direct PCR, but also identified the blaPER-1
gene of Acinetobacter baumannii located on the class I integron. To the best of our
knowledge, this is the first study to detect the ESBL phenotype and blaPER-1 gene
of Acinetobacter baumannii in Vietnam, further supporting the global spread of
such strains.

viii


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

Trang tựa
Trang Chuẩn Y........................................................................................................ i

2.2.6.1 Các ESBL của A. baumannii ..........................................................................15
2.2.6.2 Gen ESBL của A. baumannii ..........................................................................16
2.3 Một số phương pháp phát hiện ESBL...................................................................18
2.3.1 Phương pháp dựa vào kiểu hình.........................................................................18
2.3.1.1 Phương pháp đĩa đôi .......................................................................................19
2.3.1.2 Phương pháp đĩa kết hợp ................................................................................19
2.3.1.3 Phương pháp Etest ..........................................................................................19
2.3.2 Phương pháp dựa vào kiểu gen..........................................................................20
2.3.2.1 Phương pháp oligotyping................................................................................20
2.3.2.2 Phương pháp PCR-RFLP................................................................................21
2.3.2.3 Phương pháp PCR-SSCP ................................................................................21
2.3.2.4 Phương pháp LCR...........................................................................................22
2.3.2.5 Phương pháp PCR và giải trình tự gen ...........................................................22
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................................24
3.1 Đối tượng nghiên cứu ...........................................................................................24
3.2 Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................................24
3.2.1 Thiết bị dụng cụ .................................................................................................24
3.2.2 Hoá chất .............................................................................................................25
3.3 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................25
3.3.1 Phương pháp định danh sinh hoá .......................................................................25
3.3.2 Phương pháp kháng sinh đồ xác định kiểu hình ESBL .....................................26
3.3.3 Phương pháp ly trích vi khuẩn ...........................................................................26
3.3.4 Phương pháp PCR..............................................................................................27
3.3.4.1 Trình tự primer................................................................................................27
3.3.4.2 Phương pháp loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại PCR ......................29
3.3.4.3 Phương pháp PCR định danh vi khuẩn 16s rDNA .........................................29
x


3.3.4.4 Phương pháp PCR khuếch đại gen blaPER-1 ....................................................30

A. baumanii

Acinetobacter baumannii

β-lactama

betalactama

β-lactamase

betalactamase: men betalactama

cs

cộng sự

CS

Conserved Squence: trình tự gene bảo tồn

CLSI

Clinical and Laboratory Standards Institute

ddNTP

dideoxyribonucleotide triphosphate

dNTP


MHA

Mueller Hinton Agar

MIC

Minimum Inhibitory Concentration

NALC

N-Acetyl-L-Cysteine

NCBI

National Center for Biotechnology Information

ORF

Open Reading Frame

PCR

Polymerase Chain Reaction

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

SSCP


Hình 2.5 B Sơ đồ xác định blaPER-1 A. baumannii không xuất hiện
trên Tn 1213 ..............................................................................................17
Hình 2.6 Cấu trúc integron lớp 1............................................................................18
Hình 4.1 Kết quả định danh sinh hoá IDS 14 mẫu 999..........................................37
Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR 16s rDNA ..............................................38
Hình 4.3 Hình dữ liệu thô trình tự nucleotide 16s rDNA mẫu 999........................39
Hình 4.4 Kết quả giải trình tự 16s rDNA xác định A. baumannii mẫu 999...........40
Hình 4.5 Kết quả kiểu hình ESBL (-).....................................................................40
Hình 4.6 Kết quả kiểu hình ESBL (+)....................................................................41
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR PER-1 ở nhiệt bắt cặp 55oC và 60oC.........42
Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR PER-1.............................................................................. 42
Hình 4.9 Kết quả điện di chip sản phẩm PCR blaPER-1 mẫu 1900 và 2040............43
Hình 4.10 Hình dữ liệu thô trình tự nucleotide blaPER-1 mẫu 1900 ........................44
Hình 4.11 Kết quả giải trình tự xác định blaPER-1 mẫu 1900..................................45
Hình 4.12 Hình dữ liệu thô trình tự nucleotide blaPER-1 mẫu 2040 .................................... 45
Hình 4.13 Kết quả giải trình tự xác định blaPER-1 mẫu 2040..................................46

xiv


CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU
Bệnh nhiễm trùng vẫn còn đang đứng hàng đầu trong mô hình bệnh tật ở
nước ta và các nước phát triển, đặc biệt là nhiễm khuẩn bệnh viện do các tác nhân vi
khuẩn gram âm. Nếu trước đây các nhiễm khuẩn bệnh viện có thể được điều trị dễ
dàng bằng các cephalosporin thế hệ 3 hay thế hệ 4 thì hiện nay tình hình không còn
dễ dàng như vậy nữa vì các vi khuẩn này đã sở hữu được một thứ vũ khí rất đáng sợ,
đó là khả năng tiết men betalactama (β-lactamase) thuỷ phân các kháng sinh thuộc
họ β-lactam được gọi là Expanded Spectrum Betalactamase (ESBL) giúp vi khuẩn
kháng được tất cả các kháng sinh cephalosporin các thế hệ từ 1 đến 4 và hầu hết các


2


CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Vi khuẩn Acinetobacter baumannii
2.1.1 Lịch sử
Acinetobacter được miêu tả lần đầu tiên bởi Morax vào 1896 (Ann Inst
Pasteur, 1896). Những năm sau đó, với hình thái học được miêu tả bởi Axenfeld
được xem như là “Morax-axenfeld bacilli”, vi khuẩn tiếp tục sự thay đổi với các tên
gọi khác nhau như Bacterium anitratum, Herella (hoặc Herellea) vaginicola, Mima
polymorpha, Achromobacter, Micrococcus calcoaceticus, Diplococcus, B5W và
Cytophaga. Cho đến năm 1954, tên Acinetobacter baumannii xuất xứ từ Hy Lạp là
akinetos (ακίvєτοσ) với nghĩa “không chuyển động” do Prévôt và Brisou đề xướng
và đã được công nhận bởi Juni và Janik (1969). Cho đến 1980, sự phân loài
Acinetobacter được xác định dựa vào kiểu gene (Dijkshoorn và cs, 1998) và sự lai
DNA và trình tự 16s rDNA (Bouvet và Grimont, 1986). Giống Acinetobacter bao
gồm 31 loài (17 loài có tên được công nhận), nhưng chỉ có một vài loài được xác
định là có khả năng gây bệnh, trong đó Acinetobacter baumannii được biết đến liên
quan đến nhiễm trùng bệnh viện, đặc biệt tại các khoa chăm sóc tích cực (trích dẫn
bởi Bergogne-Bérézin, 2007).
2.1.2 Đặc điểm phân loại, hình thái và sự phân bố
Theo phân loại NCBI, Acinetobacter baumannii (A. baumannii ) thuộc:
Giới (Kingdom)

: Bacteria

Ngành (Division)



Hình 2.1: Hình dạng vi khuẩn A. baumannii
(Nguồn: http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/9330/9330_lores.jpg)
A. baumannii sống trên cơ thể người ở da, họng, hệ thống hô hấp, tiêu hoá và
hầu hết các nơi ẩm ướt trên cơ thể người (Bergogne-Bérézin, 1987; Joly-Guillou và
Burn-Buisson, 1996). A. baumannii liên quan đến nguồn lây nhiễm bệnh viện xuất
hiện thỉnh thoảng rải rác hoặc bùng phát (Bergogne-Bérézin và cộng sự, 1987;
Fiérobe và cs, 2001) (trích dẫn bởi Bergogne-Bérézin, 2007).
2.1.3 Đặc điểm gây bệnh và sự truyền nhiễm
Vào những năm 1980, A. baumannii được tìm thấy ở các khoa chăm sóc tích
cực tại một số nước như Tây Ban Nha với tỷ lệ lây nhiễm từ 4 – 8,2 % vào năm

4


1990-1997 (Vaque và cs, 1999) và ở toàn Châu Âu là 9 % vào năm 1995 (Vincent
và cs, 1995). Acinetobacter là nguyên nhân gây ra các bệnh nhiễm trùng như nhiễm
trùng máu, một trong những nguồn lây nhiễm cao nhất ở các bệnh viện, theo nghiên
cứu ở Anh với tỷ lệ 5 % trên toàn bệnh viện, trong đó ở các khoa chăm sóc tích cực
chiếm 54 %, sự hiện diện của A. baumanni chiếm 10 – 15 % (Wisplinghoff và cs,
2000). Ngoài ra, A. baumannii còn được biết đến do có khả năng gây viêm phổi
được xác định chính xác đầu tiên vào năm 1997 làm cho 85 % động vật chết trong 3
ngày (Joly-Guillou và cs, 1997) và đặc biệt ở các khoa chăm sóc tích cực A.
baumannii là nguyên nhân gây viêm phổi quan trọng nhất, theo thống kê nghiên cứu
tại Mỹ, chiếm 5 – 10 % và có khả năng ngày càng gia tăng (Gaynes và Edward,
2005). Thêm vào đó, sự lây lan của A. baumannii gây viêm phổi đã xuất hiện ra
ngoài cộng đồng chủ yếu là ở các vùng nhiệt đới như Úc và các nước Châu Á. Bên
cạnh đó, A. baumannii gây nhiễm trùng dẫn đến hoại tử vết thương và có khả năng
gây bùng phát do xuất hiện hiện tượng kháng đa kháng sinh, được thể hiện gần đây
nhất trong cuộc chiến ở Irac và Apganixtan, A. baumannii chiếm 32,5 % từ kết quả

t i

Tiết βlactamase
thuỷ phân phá
vỡ cầu amide

Hoạt động của bơm đẩy
β-lactam đẩy kháng sinh
ra ngoài tế bào

Hình 2.2: Các cơ chế đề kháng kháng sinh của A. baumannii
(Nguồn: http://www.Sitemaker.umich.edu/…/filesmedchemresistance.html)

6


Hình 2.3: Vị trí tác động của β-lactamase lên các kháng sinh chứa vòng β-lactam
(Nguồn: http://www.showcasehospitals.com/.../David_Wareham.ppt)

Hình 2.4: Cơ chế tác động của β-lactamase lên vòng β-lactam
(Nguồn: Livermore, 1995)

7


2.1.4.2 Tình hình đề kháng kháng sinh
Sự gia tăng khả năng kháng đa kháng kháng sinh của A. baumannii là
nguyên nhân gây ra bùng phát tại các bệnh viện ở các nước trên thế giới như ở Châu
Âu (Anh, Pháp, Đức, Ý, Tây Ban Nha, Hà Lan và Bungari), Bắc Mỹ (New York),
Mỹ La Tinh (Achentina, Braxin, Chilê và Côlombia), Châu Úc (Brisbane, Sydney

Araj, 2003; Poole, 2004).
2.2.2 Sự tiến hoá của ESBL
Một trong các cơ chế đề kháng mới là sự đột biến gene trên plasmid được tìm
thấy đầu tiên vào 1983 tại Đức với 2 loài Klebsiella pneumoniae và E. coli tạo ra các
β-lactamase có khả năng thuỷ phân các cephalosporin hoạt phổ rộng được gọi là
extended-spectrum β-lactamase (ESBL). Các ESBL có nguồn gốc từ sự đột biến của
các β-lactamase nguyên thuỷ như: TEM-1, SHV-1, CTX-M... (Poole, 2004; Jacoby
và Munoz-Price, 2005; Livermore và Paterson, 2005; Phạm Hùng Vân, 2006).
Nhiều nhà nghiên cứu không nghĩ rằng AmpC β-lactamase (β-lactamase trên
nhiễm sắc thể lớp C có khả năng thuỷ giải cephalosporin) là một ESBL. Dĩ nhiên
thuật ngữ ESBL dành cho enzyme có khả năng chuyển đổi thuộc lớp A và thuỷ giải
được cephalosporin cũng như bị ức chế bởi acid clavulanic. ESBL không thể thuỷ
giải carbapenem (không như ApmC) cũng như cephamycin (cefoxitin và cefotetan)
và không giống như AmpC, ESBL kháng được với cephalosporin thế hệ 4 như
cefepime và cefpirome. Định nghĩa ESBL được mở rộng cho cả những đột biến βlactamase OXA thuộc lớp D có khả năng ức chế cephalosporin vì chúng đại diện
cho sự tiến hoá song song với một số loại enzyme nhóm A, mặc dù khác nhau về
khả năng đề kháng các chất ức chế β-lactamase (Livermore và Paterson, 2005).
2.2.3 Các lớp β-lactamase
TEM-ESBL (Lớp A): là các đột biến TEM penicillinase, việc thay thế amino
acid tại nhiều vị trí ở TEM-1 β-lactamase có thể làm thay đổi hình dạng vị trí hoạt

9