BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
*****K*J*****

NGUYỄN THỊ BẠCH MAI

XÂY DỰNG QUI TRÌNH KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ CỦA
VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ
TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS)
TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC ĐỊA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 11/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
*****K*J*****

NGUYỄN THỊ BẠCH MAI

XÂY DỰNG QUI TRÌNH KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ
CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ
TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS)
TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC ĐỊA
Chuyên ngành: Nuôi trồng thuỷ sản
Mã số: 60.62.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

4. Phản biện 2:

PGS. TS NGUYỄN NGỌC TUÂN
Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

5. Ủy viên:

TS. NGUYỄN HỮU THỊNH
Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
HIỆU TRƯỞNG


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên là Nguyễn Thị Bạch Mai sinh ngày 27 tháng 12 năm 1977 tại huyện
Bình Đại, tỉnh Bến Tre. Con ông Nguyễn Kim Chi và bà Trương Bạch Liên.
Tốt nghiệp tú tài tại trường trung học phổ thông Nguyễn Thị Minh Khai,
Thành phố Hồ Chí Minh năm 1994.
Tốt nghiệp Đại học ngành Nuôi trồng Thủy Sản hệ chính quy năm 2000 tại
trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Sau đó làm việc tại Khoa Thủy Sản - trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí
Minh.
Tháng 9 năm 2007 theo học Cao học ngành Nuôi trồng Thủy Sản tại trường
Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Tình trạng gia đình: kết hôn với Phan Thương Huy năm 2004; con gái Phan
Nguyễn Mai Hân sinh năm 2005.
Địa chỉ liên lạc: 44/3 Đường 79 phường Tân Quy, Quận 7, TP.HCM.
Điện thoại: 0913673349
Email: [email protected]


Tp.Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2010
Nguyễn Thị Bạch Mai

iv


TÓM TẮT
Đề tài được thực hiện với ba mục tiêu là xác định mật độ vi khuẩn E. ictaluri
trong huyền phù có OD550 0,125 và Mc-Farland 0,5; xác định mật độ vi khuẩn trong
gan, thận, lách và trong dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra gây bệnh thực nghiệm
bởi E. ictaluri và xây dựng qui trình làm kháng sinh đồ cho bệnh gan thận mủ trên
cá tra tại thực địa.
Kết quả đề tài cho thấy:
- Mật độ vi khuẩn trong huyền phù (X ± SE) có OD550 0,125 và Mc-Farland
0,5 tương đương nhau (lần lượt là 1,4 × 108 ± 0,3 × 108 và 1,3 × 108 ± 0,3 × 108
cfu/mL).
- Mật độ vi khuẩn ở gan, thận, lách cá tra nhiễm bệnh thực nghiệm tăng dần
theo thời gian, cao nhất vào ngày thứ 7 đối với cá 2 – 5 g, > 50 g và ngày thứ 8 đối
với cá 10 – 20g. Mật độ vi khuẩn trong gan, thận, lách ở cỡ cá 2 – 5 g và > 50 g đạt
trên 108 cfu/g từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 8 sau khi gây bệnh và ở cỡ cá 10 – 20 g là
từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9 sau khi gây bệnh.
- Dịch mẫu thu từ thận cá tra 2 – 5 g nhiễm bệnh thực nghiệm bởi E. ictaluri
vào ngày thứ 7 đạt được mật độ vi khuẩn trên 108 cfu/mL.
- Trong cùng phương pháp thực hiện, cùng cơ quan kiểm tra: không có sự
khác biệt có ý nghĩa (P >0,05) về đường kính vòng kháng khuẩn của doxycyclin ở
24 và 48 giờ; có sự khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) về đường kính vòng kháng
khuẩn của amoxicillin và tetracyclin giữa 24 giờ và 48 giờ. Tuy nhiên, kết quả phân
tích thống kê cho thấy không có sự sai khác có ý nghĩa (P > 0,05) về kết quả nhận

v

- Bacteria concentration of above 108 cfu/mL was also observed in kidney
suspension of 2-5g fish on the 7th experimental day.
- There was no significant difference (P>0.05) in diameter of zone of
inhibition between 24 and 48 hours for doxycyclin when testing on the same organ
with the same method whereas there were significant differences (P

xiv

Danh sách các bảng

xv

1. GIỚI THIỆU

1

1.1 Đặt vấn đề

1

1.2 Mục tiêu đề tài

3

1.3 Mục đích đề tài

3

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

2.1 Sơ lược về bệnh gan, thận mủ

4

9

2.2.2 Gây cảm nhiễm nhân tạo bằng phương pháp ngâm

9

2.3 Nghiên cứu về sự nhạy cảm và tính kháng kháng sinh của E. ictaluri

10

2.3.1 Trong nước

10

2.3.2 Nước ngoài

12

2.4 Phương pháp thu mẫu và thực hiện kháng sinh đồ trong thủy sản

13

2.4.1 Thu mẫu cá

13

2.4.2 Thu mẫu bệnh

13


20

3.4.1 Cá

20

3.4.2 Vi khuẩn

20

3.4.3 Môi trường

21

3.4.4 Đĩa giấy tẩm kháng sinh

21

3.4.5 Bộ test sinh hóa định danh vi khuẩn

22

3.5 Phương pháp nghiên cứu

22

3.5.1 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn

22


28

3.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm

30

3.6.1 Thí nghiệm 1: Xác định mật độ vi khuẩn E. ictaluri trong huyền phù
có OD550 = 0,125 và Mc-Farland 0,5

30

3.6.2 Thí nghiệm 2: Xác định mật độ vi khuẩn trong gan, thận, lách và
dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra nhiễm bệnh thực nghiệm

30

3.6.2.1 Mật độ vi khuẩn trong gan, thận, lách cá tra

30

3.6.2.2 Mật độ vi khuẩn trong dịch mẫu ở gan, thận, lách cá tra thu bằng
tăm bông

32

3.6.3 Thí nghiệm 3: Xây dựng qui trình làm kháng sinh đồ cho cá tra bệnh
gan thận mủ tại thực địa và so sánh với qui trình trong phòng thí nghiệm

33


47

4.3.1.1 Kết quả kháng sinh đồ (ĐKVKK) ở 24 và 48 giờ

47

4.3.1.2 Kết quả đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của E. ictaluri

51

4.3.2 So sánh kết quả kháng sinh đồ ở 24 giờ của các phương pháp

53

4.3.2.1 Kết quả kháng sinh đồ (ĐKVKK)

53

4.3.2.2 Kết quả đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của E. ictaluri

55

4.3.3 Các trường hợp đặc biệt

57

xi


4.3.4 Thao tác thực hiện – Ưu, nhược điểm của các qui trình thực hiện


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A. hydrophila

Aeromonas hydrophila

API-20E

Identification system for Enterobacteriaceae and other nonfastidious Gram-negative Rods

AX

Amoxicillin

BHIA

Brain Heart Infusion Agar

BHIB

Brain Heart Infusion Broth

CFU

Colony forming Units

CLSI

Clinical and Laboratory Standards Institute



Muller-Hinton Agar

NCCLS

National Committee for Clinical Laboratory Standards

OD

Optical Density

OIE

Office International des Epizooties

SE

Standard error

TB

Tăm bông

TC

Tetracycline

TSA

Tryptone Soya Agar

Hình 3.6 Kết quả test API-20E

27

Hình 3.7 Cá bệnh gan thận mủ trong ao nuôi ở Vĩnh Long

28

Hình 3.8 Bố trí thí nghiệm đối với cá 10 – 20 g

31

Hình 3.9 Nghiền mẫu bệnh phẩm trong eppendorf bằng chày nhựa

32

Hình 3.10 Thu mẫu bệnh bằng tăm bông vô trùng

33

Hình 4.1 Cá tra 10 – 20 g bị xuất huyết sau khi gây nhiễm thực nghiệm

37

Hình 4.2 Cá tra > 50 g bị gan thận mủ và xuất huyết sau khi gây nhiễm
thực nghiệm

41

Hình 4.3 Cá tra có gan, thận, lách bị mủ



DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 3.1 Tiêu chuẩn đường kính vòng vô khuẩn

22

Bảng 4.1 Chất lượng nước của bể thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn
trong gan, thận, lách cá tra

36

Bảng 4.2 Mật độ vi khuẩn trong gan, thận và lách cá cỡ 2 – 5 g

38

Bảng 4.3 Mật độ vi khuẩn trong gan, thận và lách cá tra cỡ 10 – 20 g

39

Bảng 4.4 Mật độ vi khuẩn trong gan, thận và lách cá tra cỡ > 50 g

40

Bảng 4.5 Trọng lượng của gan, thận và lách cá (g/cá hoặc g/5 cá)



Bảng 4.14 Kết quả kháng sinh đồ (ĐKVKK) của E. ictaluri ở các phương pháp
sau khi ủ ở 30oC, 24 giờ

54

Bảng 4.15 Kết quả đánh giá sự nhạy cảm với kháng sinh của E. ictaluri trên gan,
thận, lách cá tra sau khi ủ ở 30oC, 24 giờ

xv

56


Chương 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt Vấn Đề
Trong những năm gần đây nghề nuôi cá tra ở nước ta phát triển rất nhanh đã
góp phần tích cực vào việc nâng cao nguồn thu nhập của cộng đồng và tăng kim
ngạch xuất khẩu. Tuy nhiên, khi nghề nuôi được thâm canh hóa nhất là nuôi với mật
độ cao thì vấn đề dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn và thiệt hại cũng nhiều hơn.
Cá tra nuôi thường gặp phải bệnh nghiêm trọng là gan thận mủ, bệnh này gây thiệt
hại rất lớn cho nghề nuôi. Đây là bệnh do vi khuẩn nên hướng điều trị chủ yếu là sử
dụng kháng sinh. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh không đúng đã gây nên hiện
tượng kháng thuốc. Kháng sinh đồ thực hiện trên vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ và
xuất huyết trên cá tra nuôi tại các trang trại thuộc các tỉnh Cần Thơ, An Giang, Vĩnh
Long, Trà Vinh, Hậu Giang và Bến Tre cho thấy mức độ nhạy của thuốc trên vi
khuẩn gây bệnh ngày càng giảm dần. Kết quả nghiên cứu kháng sinh đồ từ 1/2006–
3/2008 cho thấy sự nhạy cảm với kháng sinh của đa số vi khuẩn được khảo sát ngày
càng giảm dần chứng tỏ vi khuẩn gây bệnh ngày càng kháng thuốc nên dẫn đến tỷ lệ

điều trị bệnh bằng việc sử dụng kháng sinh phù hợp trong giai đoạn bệnh mới bắt
đầu. Tuy nhiên, việc áp dụng các phương pháp này còn tùy tiện và chưa có nghiên
cứu kiểm chứng. Do đó, việc nghiên cứu xây dựng một phương pháp làm kháng
sinh đồ nhanh, đơn giản nhưng kết quả đáng tin cậy là một việc làm cần thiết.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, đề tài “XÂY DỰNG QUI TRÌNH KIỂM
TRA KHÁNG SINH ĐỒ CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ
TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC ĐỊA”

đã được thực hiện.

2


1.2 Mục tiêu đề tài
Xây dựng qui trình làm kháng sinh đồ cho bệnh gan thận mủ trên cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus) trong điều kiện thực địa nhanh, đơn giản.
1.3 Mục đích đề tài
Góp phần nâng cao hiệu quả điều trị bệnh gan thận mủ bằng việc sử dụng
kháng sinh hợp lý.

3


Chương 2
TỔNG QUAN

2.1 Sơ lược về bệnh gan thận mủ
Năm 1979, nghề nuôi cá da trơn (Ictalurus punctatus) ở Mỹ đương đầu với
một dịch bệnh nghiêm trọng, đó là bệnh nhiễm trùng máu và viêm ruột (Enteric
Septicemia Catfish: ESC). Bệnh này được xem là một trong những bệnh ảnh hưởng

Khi trong môi trường nuôi cấy có sự hiện diện của một loài vi khuẩn phát
triển nhanh hơn E. ictaluri (như Aeromonas sp.), chúng sẽ ức chế hoặc làm cho E.
ictaluri phát triển rất chậm (Plumb, 1994). Shotts và Waltman (1990) đã nghiên cứu
một môi trường có tính chọn lọc cho E. ictaluri là Edwardsiella ictaluri agar (EIA)
giúp tăng tính chính xác khi phán đoán sự có mặt của E. ictaluri trong lần phân lập
vi khuẩn đầu tiên.
Khi dịch bệnh ESC được đề cập đến lần đầu tiên vào năm 1977, người ta cho
rằng E. ictaluri là mầm bệnh bắt buộc vì nó không thể tồn tại ở môi trường ngoài ký
chủ (Hawke, 1979). Tuy nhiên, nghiên cứu của Plumb và Quinlan (1986) chứng
minh rằng chúng có thể tồn tại trong bùn đáy ao trên 90 ngày ở 25oC.

5


2.1.2 Đường truyền lây
E. ictaluri có thể lây nhiễm cho cá qua nhiều con đường khác nhau:
(1) Vi khuẩn trong nước có thể xâm nhập vào cơ thể cá thông qua đường mũi,
đến dây thần kinh khứu giác rồi đến màng não (Miyazaki và Plumb, 1985; Shotts và
ctv, 1986; Morrision và Plum, 1994). Sự nhiễm trùng bắt đầu và lan rộng từ màng
não đến hộp sọ và vùng da trên sọ tạo thành một lổ lõm ở đầu (Plumb, 1994). Vi
khuẩn này tấn công vào mũi làm giảm chức năng của niêm mạc mũi ở lớp màng
nhầy. Khi quan sát dưới kính hiển vi nhận thấy có sự hiện diện E. ictaluri trên bề
mặt màng nhầy và trong biểu mô.
(2) E. ictaluri cũng có thể xâm nhập qua đường tiêu hóa. Đầu tiên vi khuẩn
qua đường miệng phát triển ở ruột, gan, thận và cơ trong vòng 2 tuần gây cảm
nhiễm làm ruột trương to, đầy hơi (Fracis-Floyd và ctv, 1987). Vi khuẩn từ đường
tiêu hóa xâm nhập qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu (Shotts và ctv,
1986).
(3) E. ictaluri cũng xâm nhập qua mang. Thí nghiệm chứng minh trong suốt
quá trình ngâm, vi khuẩn phát triển thành tập đoàn trên biểu bì mang với số lượng

thường mà tách rời ra từng tế bào hoặc thoái hóa thành một vùng không còn nhận ra
được cấu trúc với nhiều mức độ. Giai đoạn đầu có hiện tượng sung huyết động
mạch và tĩnh mạch gan, đặc biệt là hệ thống xoang mao mạch giữa các dãy tế bào
gan làm cho toàn bộ tổ chức gan bị sưng to. Sau đó, do quá trình sung huyết kéo dài
dẫn đến vỡ mạch máu và giải thoát nhiều enzyme (protease, lipase,...) làm các tế
bào ở vùng viêm bị hủy hoại dẫn đến hoại tử. Lúc này quan sát thấy những tế bào

7


đã tách rời nhau, nhân tế bào co lại và vỡ vụn, cuối cùng những tế bào này bị tiêu
hủy.
Khi cá bệnh nặng, những tổn thương lan rộng làm gan không còn chức năng
khử độc và lọc máu, các chất độc tích tụ trong cơ thể kết hợp với những yếu tố khác
làm cá chết. Ngoài ra, do tổ chức gan bị hư hại làm mất khả năng tiết mật của gan.
Một số cá mới chết khi mổ ra thấy túi mật bị vỡ, dịch mật lan tràn khắp nội quan.
Điều này có thể do khi gan bị hoại tử, ống dẫn mật và túi mật cũng bị hoại tử và túi
mật bị vỡ, dịch mật thoát ra ngoài.
Bệnh tích vi thể ở thận: Cấu trúc vi thể của thận bị hủy hoại trầm trọng, các
phản ứng sưng viêm xảy ra ở toàn bộ tổ chức. Thận sưng to đồng thời bị nhũn do
sung huyết, một phần có thể do tích tụ nước trong thận mà không đào thải được do
hệ thống tiểu cầu thận và ống thận bị hư hại. Phản ứng viêm kéo dài gây hoại tử và
làm mất chức năng các đơn vị cấu tạo nên thận. Mô tạo máu nằm xen kẽ với các tế
bào nội tiết của thận cũng bị hoại tử làm cho máu trong cơ thể bị giảm sút. Khi thận
bị hoại tử, chức năng bài tiết chất thải trong quá trình trao đổi chất bị ngưng trệ.
Trong khi đó quá trình trao đổi chất lại đặc biệt tăng mạnh do cơ thể cá huy động
các tổ chức nhằm đào thải các tác nhân gây bệnh. Ngoài ra, hai loại hormone tuyến
thượng thận là adrenalin và noradrenalin không được sản xuất khi thận bị hoại tử
cũng góp phần làm rối loạn chức năng sinh lý của cá.
Bệnh tích vi thể ở lách: Cùng với gan và thận, lách cũng là cơ quan bị hủy