VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐINH THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT
MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI
Bacillus anthracis VÀ Yersinia pestis

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

Hà Nội - 2017


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐINH THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT
MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI
Bacillus anthracis VÀ Yersinia pestis
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62 42 01 07

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn
Học viện Quân y

thiết bị.
TS. Đoàn Trọng Tuyên, Cục Quân y đã tạo điều kiện thuận lợi về chủng
nghiên cứu cùng những chia sẻ về kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu
với các mầm bệnh nguy hiểm.
Cuối cùng là gia đình thân yêu và bạn bè đã luôn tin tưởng, động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận án này.
Đinh Thị Thu Hằng
i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện và một số kết quả cùng
cộng tác với các cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép
của các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2017

NCS. Đinh Thị Thu Hằng

ii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Bio-safety level 3

An toàn sinh học cấp 3

CDC
CFU

Centers for Disease Control and
Prevention
Colony forming unit

Trung tâm kiểm soát và phòng
ngừa dịch bệnh
Đơn vị hình thành khuẩn lạc

CRMs

Certified reference materials

Vật liệu tham chiếu được chứng
nhận

dNTPs

Deoxynucleotide triphosphates

EQA

External quality assessment


Loop
mediated
amplification
Luria-Bertani

MCS

Multiplex cloning site

standard

isothermal

tìm

kiếm

sắp

Tổ chức Tiêu chuẩn Quốc tế

Khuếch đại đẳng nhiệt tạo vòm

Vùng đa điểm cắt

iii


mPCR


Mật độ quang học

ORF

Open reading frame

Khung đọc mở

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

QA

Quality assurance

Đảm bảo chất lượng

QC

Quality control

Kiểm soát chất lượng

RMs

Reference materials



NCBI
NGS
NIBSC
NIST

Các vật liệu tham chiếu chuẩn

Tổ chức Y tế Thế giới

iv


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1.

Đặc điểm hệ gen của chủng B. anthracis Ames .....................................
8

Bảng 2.1.

Thông tin các chủng vi khuẩn nghiên cứu ..............................................
34

Bảng 2.2.

Các mồi sử dụng trong nghiên cứu nhân dòng và giải trình tự ...............................
36


60

Bảng 3.4.

Tổng hợp kết quả tối ưu nồng độ dNTPs trong mPCR ..........................................
62

Bảng 3.5.

Tổng hợp kết quả tối ưu dung dịch đệm trong mPCR.............................................
62

Bảng 3.6

Các thành phần cho mPCR tối ưu với 6 cặp mồi xác định gen
vrrA, pagA, capA, ypo2088, pla, caf1 phát hiện đồng thời B.
anthracis và Y. pestis ...............................................................................................
63

Bảng 3.7.

Bảng pha loãng DNA xác định ngưỡng phát hiện B. anthracis ..............................
70

Bảng 3.8.

Bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định B. anthracis .............................................
71

Bảng 3.9.

anthracis ..................................................................................................................
92

vi


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1.

Bacillus anthracis trên tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm máu .........
4

Hình 1.2.

Khuẩn lạc B. anthracis trên môi trường thạch máu cừu .........................
5

Hình 1.3.

Yersinia pestis trên tiêu bản nhuộm Wright - Giemsa ...............................................
11

Hình 1.4.

Khuẩn lạc Y. pestis trên môi trường thạch máu .........................................................
12

Hình 2.1.


Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen ypo2088 với kích thước
khác nhau ...................................................................................................................
50

Hình 3.6.

Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen pla với kích thước khác

nhau ............................................................................................................................
51
Hình 3.7.

Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen caf1 với kích thước khác
nhau ............................................................................................................................
51

Hình 3.8.

Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích của B. anthracis Ba1 bằng PCR
đơn mồi ......................................................................................................................
53

Hình 3.9.

Sản phẩm khuếch đại đồng thời 3 gen đích của B. anthracis bằng
mPCR với 3 cặp mồi vrrAF1/R1, pagAF1/R1, capAF1/R1 ......................................
54

Hình 3.10.


59

Hình 3.16.

Tối ưu nồng độ MgCl2 trong mPCR ..........................................................................
61

Hình 3.17.

Tối ưu nồng độ dNTPs trong mPCR ..........................................................................
61

Hình 3.18.

Phân lập gen lef bằng cặp mồi IC1F-BamHI/R-NdeI và tạo dòng

phụ trong vector pJET1.2/blunt .................................................................................
64
Hình 3.19.

Các kết quả tạo dòng chứng nội tại pJET1.2-capA-IC1 ............................................
65

Hình 3.20.

Kiểm tra mPCR tối ưu có bổ sung IC trong quá trình tách chiết

DNA ở các nồng độ khác nhau với mẫu B. anthracis ...............................................
66
Hình 3.21.

Hình 3.27.

Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. anthracis và Y.
pestis ...........................................................................................................................
77

Hình 3.28.

Đánh giá độ đặc hiệu với B. anthracis của bộ kit BaYp-mPCR................................
78

Hình 3.29.

Kiểm định độ đặc hiệu với Y. pestis của bộ kit BaYp-mPCR ...................................
78

Hình 3.30.

Kiểm tra mPCR ngay sau khi tạo master mix ............................................................
79

Hình 3.31.

Kiểm tra độ ổn định của mPCR sau thời gian bảo quản một tháng ...........................
79

viii


Hình 3.32.

Hình 3.38.

Kiểm tra sản phẩm tổng hợp các gen đích của Y. pestis ...........................................
86

Hình 3.39.

Tạo dòng gen pagA trong vector pJET1.2/blunt ........................................................
87

Hình 3.40.

So sánh trình tự nucleotide gen vrrA của 10 chủng B. anthracis
với các chủng tham chiếu trên Genbank ....................................................................
89

Hình 3.41.

Xác định một số đột biến điểm trên trình tự nucleotide gen pagA

của 3 chủng Ba1, Ba3 và Ba4 khi so sánh với 15 chủng B.
anthracis tham chiếu ..................................................................................................
90
Hình 3.42.

So sánh trình tự gen capA của 3 chủng B. anthracis với 12 chủng
B. anthracis tham chiếu trên Genbank (đoạn nucleotide có đột
biến điểm)...................................................................................................................
91


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................
4
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN B. anthracis VÀ Y. pestis...................................
4
1.1.1. Tổng quan về vi khuẩn B. anthracis .............................................................
4
1.1.2. Tổng quan về vi khuẩn Y. pestis ....................................................................
11
1.1.3. B. anthracis, Y. pestis và vũ khí sinh học ......................................................
17
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH B. anthracis, Y. pestis .................................
18
1.2.1. Các phương pháp vi sinh truyền thống ..........................................................
18
1.2.2. Các phương pháp xác định sinh hóa ..............................................................
20
1.2.3. Các phương pháp xác định dựa trên ái lực ....................................................
20
1.2.4. Các phương pháp xác định dựa trên axit nucleic ..........................................
22
1.3. KIỂM ĐỊNH KIT mPCR CHẨN ĐOÁN..............................................................
30
1.3.1. Kiểm định kit PCR chẩn đoán trên thế giới...................................................
30
1.3.2. Kiểm định kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis ở Việt
Nam...............................................................................................................
31
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................
34
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...................................................................................

3.1.4. Nghiên cứu thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp trong kỹ thuật mPCR .............
63
3.1.5. Chế tạo kit mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis ...................
68
3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR
TRÊN CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ....................
69
3.2.1. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu
chuẩn ...............................................................................................................
69
3.2.2. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các chủng
phân lập .........................................................................................................
80
3.2.3. Kiểm định bộ kit BaYp-mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis ............
94
Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................
95
4.1. THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI B.
anthracis VÀ Y. pestis ........................................................................................
95
4.1.1. Thiết kế, tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis
và Y. pestis ..................................................................................................
95
xi


4.1.2. Chứng nội tại trong mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y.
pestis ...........................................................................................................
100
4.2. KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN CÁC BỘ

nhấm ở khu vực Tây Nguyên và có thể bùng phát thành dịch bất kỳ lúc nào. Mặt
khác, chúng ta cần có phương án ứng phó nhanh, kịp thời trong phòng chống khủng
bố sinh học.
Trong một vụ tấn công nghi ngờ có khủng bố sinh học hay mẫu môi trường
nghi nhiễm các mầm bệnh này, việc phát hiện nhanh, chính xác tác nhân sinh học là
một trong những yếu tố quyết định đến sức khỏe cộng đồng và an ninh quốc gia.
Việc sàng lọc nhanh những mẫu nghi ngờ giúp kiểm soát sự lây lan và đảm bảo
điều trị chính xác. Phương pháp nuôi cấy truyền thống được xem là “tiêu chẩn
vàng” trong xác định B. anthracis và Y. pestis. Tuy nhiên, mặc dù có độ nhạy cao,
phương pháp này đòi hỏi thời gian 2 - 3 ngày, một số trường hợp độ đặc hiệu không
cao, cần tiến hành các thử nghiệm bổ sung. Ngoài ra, phương pháp nuôi cấy cần tiến
hành ở điều kiện phòng an toàn sinh học cấp 3 (Biosafety level 3, BSL-3) với nhân
viên được đào tạo và có kinh nghiệm. Các phương pháp miễn dịch được nghiên cứu
dưới dạng các que thử nhanh rất thuận tiện nhưng độ nhạy, độ đặc hiệu thấp. Do đó,
các phương pháp này khó ứng dụng trong chẩn đoán trên thực địa và phòng chống
khủng bố sinh học.
Hiện nay, đã có một số kỹ thuật dựa trên PCR dùng để xác định nhanh và
chính xác B. anthracis cũng như Y. pestis được phát triển với những ưu điểm nổi bật
như độ nhạy, độ đặc hiệu cao và có thể thực hiện với các mẫu đã bất hoạt (nên chỉ


2

cần thực hiện ở điều kiện phòng an toàn sinh học cấp 2). Tuy nhiên, hầu hết các kỹ
thuật này chỉ phát hiện một loại plasmid độc lực với từng tác nhân nên không phát
hiện được các trường hợp chủng thiếu một trong các plasmid trên. Đối với B.
anthracis trong tự nhiên, để chẩn đoán chính xác những chủng gây bệnh, ngoài gen
đặc trưng trên nhiễm sắc thể, cần chỉ ra được sự có mặt đầy đủ của hai plasmid độc
lực là pXO1 và pXO2. Trong thực tế có những chủng B. anthracis thiếu một trong
hai plasmid trên nên khả năng gây bệnh thay đổi. Tương tự, Y. pestis chứa hai

là ypo2088 (thuộc nhiễm sắc thể), pla (thuộc plasmid pPCP1), caf1 (thuộc plasmid
pMT1) của Y. pestis, cùng 1 gen chứng nội tại là plasmid tái tổ hợp để xác minh kết
quả chẩn đoán. Do đó, khắc phục được hiện tượng dương tính giả đối với trường
hợp các chủng vi khuẩn B. anthracis và Y. pestis không đầy đủ độc lực, phân biệt
với chủng gây bệnh, giúp giảm giá thành chẩn đoán so với việc phải thực hiện các
lần PCR riêng rẽ, rút ngắn thời gian chẩn đoán.


4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN B. anthracis VÀ Y. pestis
1.1.1. Tổng quan về vi khuẩn B. anthracis
1.1.1.1. Đặc điểm sinh học
B. anthracis là trực khuẩn thuộc chi Bacillus, họ Bacillaceae. Chi Bacillus
gồm các vi khuẩn Gram dương sinh bào tử, đa số không gây bệnh, một số gây
nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (Bacillus cereus), một số có lợi cho con người
(Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides). Đặc điểm hình thái,
tính chất sinh lý, sinh hoá, tính chất nuôi cấy của các loài thuộc chi Bacillus rất
giống nhau. Tuy nhiên, B. anthracis có đặc điểm khác biệt với các loài trực khuẩn
hiếu khí sinh bào tử khác, đó là có plasmid pXO1 mã hóa cho ngoại độc tố và
plasmid pXO2 mã hoá protein vỏ.
B. anthracis hình thẳng, hai đầu vuông, kích thước từ 11,51,58 µm,
thường xếp thành từng chuỗi dài (Hình 1.1). Ở ngoại cảnh hoặc trong môi trường
nuôi cấy, vi khuẩn hình thành bào tử nằm giữa thân và không làm thay đổi hình
dạng tế bào. Trên động vật bị bệnh hoặc môi trường nuôi cấy đặc biệt, vi khuẩn có
vỏ, không di động (Lê Thu Hồng, 2011; Christine, 2015).

Hình 1. 1. B. anthracis trên tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm máu


6

trung tính, yếu tố bảo vệ giúp độc tố xâm nhập vào tế bào chủ và yếu tố gây chết làm
tăng hoạt hóa đại thực bào, hoạt hóa quá trình đốt oxy, giải phóng cytokin, bất hoạt
protein kinase (Lê Thu Hồng, 2011; Jang, 2011).
Protein vỏ có bản chất là chuỗi trùng hợp axit poly-D-glutamic mà sự tổng
hợp của nó liên quan đến sự xuất hiện của plasmid pXO2. Plasmid này có thể truyền
từ loài có khả năng hình thành vỏ sang loài không có khả năng này (Jang, 2011; Lê
Thu Hồng, 2011; Christine, 2015). Những chủng không có khả năng hình thành vỏ
cũng mất khả năng gây bệnh và thường được dùng để chế tạo vắc xin (Okinaka,
2014). Bản thân protein vỏ không gây độc nhưng có chức năng bảo vệ vi khuẩn do có
khả năng chống lại phức hợp bổ thể và hiện tượng thực bào của bạch cầu. Vỏ của vi
khuẩn có thể được hình thành ở động vật mắc bệnh hoặc trên môi trường nuôi cấy ở
điều kiện khí trường CO2 5%, được phát hiện bằng các phương pháp như: Nhuộm
mực tàu, kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang. Đây cũng là những phương pháp để phân
biệt B. anthracis với B. cereus và B. thuringiensis bởi chúng đều không có khả năng
tổng hợp vỏ. Với những chủng B. anthracis không có plasmid pXO2, thành tế bào
xuất hiện lớp S-layer (Surface layer), gồm 2 loại protein là EA1 (Extractable Antigen
1- Kháng nguyên có thể tách chiết) và Sap (Surface array protein- Protein bề mặt),
được mã hóa bởi các gen trên nhiễm sắc thể. Đây là một dạng siêu cấu trúc xuất hiện
phổ biến ở một số đơn bào nguyên thủy và các vi khuẩn khác. Lớp S-layer được cho
là có vai trò quan trọng trong mối liên hệ giữa vi khuẩn và môi trường bên ngoài,
đảm bảo hình dạng vi khuẩn và là nơi gắn kết của các phage. Ngoài ra, S-layer còn có
vai trò giúp vi khuẩn chống lại tác động của bổ thể và thay đổi khả năng tiếp cận của
đại thực bào vật chủ (Fouet, 1999).
1.1.1.2. Đặc điểm hệ gen
Hệ gen của B. anthracis gồm 1 nhiễm sắc thể dạng vòng và 2 plasmid độc
lực là pXO1, pXO2. Hệ gen với hàm lượng nucleotide AT cao, GC chỉ chiếm
khoảng 35%. Điều này cho thấy DNA của B. anthracis có nhiệt độ nóng chảy thấp

Việc tổng hợp nên protein của các khung đọc mở có liên quan tới các trình tự
chèn. Các trình tự chèn này có thể gắn tự do vào bất kì vị trí nào trên hệ gen vi
khuẩn. Hoạt động gắn và tách khỏi hệ gen không phụ thuộc vào thông tin di truyền


8

trên nhiễm sắc thể. Khi gắn vào vị trí mới, chúng làm cho đoạn gen gắn vào bị mất
chức năng.
Bảng 1. 1. Đặc điểm hệ gen của chủng B. anthracis Ames
Đặc điểm

Nhiễm sắc thể

pXO1

pXO2

Kích thước (bp)

5.227.293

181.677

94.829

Số lượng gen

5.508



11

0

0

tRNAs

95

0

0

sRNAs

3

2

0

Số gen phage

62

0

0


19

Số gen chưa biết chức năng

657

8

5

Số gen hypothetical

877

122

51

(Nguồn: Read, 2003)

Plasmid
Toàn bộ độc lực của B. anthracis nằm trên 2 plasmid là pXO1 và pXO2.
Plasmid pXO1 có khối lượng 110 MDa, kích thước khoảng 182 kb, gồm 217 gen, tỷ
lệ GC là 32,5%. Trên plasmid pXO1 có 143 khung đọc mở, trong đó gần 70% ORF
mã hóa cho protein không rõ chức năng, 11 ORF được dự đoán là mã hóa cho
protein cấu trúc. Hầu hết chức năng của plasmid này được quy định bởi một “đảo
gây bệnh” PAI (Pathogenicity Island), nằm ở vị trí từ 117.177 đến 162.013 trên
plasmid, kích thước 44,8 kb, tỷ lệ nucleotide GC là 30% và được giới hạn bởi 2
đoạn chèn IS1627 ở mỗi đầu. Đây là vùng chứa tất cả các gen mã hóa cho protein

thành phần p38, ERK (extracellular signal-regulated kinases), JNK (c-Jun aminoterminal kinases). Hoạt động này của LF gây tổn thương lan rộng, có thể tổn hại đa


10

hệ thống như hệ miễn dịch, hệ tuần hoàn, hệ nội tiết, gây chết tế bào (Agrawal,
2004).
Plasmid pXO2 có khối lượng 60 MDa, kích thước khoảng 95 kb, gồm 113
gen, 85 ORF, trong đó có các gen capA, capB, capC liên quan đến sự tổng hợp
protein vỏ. Đồng thời, protein vỏ là một trong những yếu tố độc lực chính trong quá
trình xâm nhập của B. anthracis (khi kết hợp với yếu tố LF và EF). Nhờ điện tích
âm mà protein vỏ ức chế bảo vệ vật chủ thông qua sự ức chế thực bào của các đại
thực bào. Một báo cáo gần đây cho thấy protein vỏ của B. anthracis kích hoạt sinh
Interleukin-1β từ tế bào monocyte, gây ảnh hưởng lâu dài đến lympho T trong máu
trên mô hình động vật thí nghiệm (Jang, 2011). Các gen tổng hợp protein vỏ được
sắp xếp theo thứ tự là capB, capC và capA, với kích thước tổng thể là 3.244 bp.
Việc tổng hợp protein vỏ được điều hòa bởi gen atxA trên pXO1 và gen acpA trên
plasmid pXO2 (Drysdale, 2004).
Gen capA kích thước 1.235 bp, mã hóa cho protein capA (411 axit amin, khối
lượng phân tử 46 kDa), thường được sử dụng trong chẩn đoán B. anthracis (Irenge,
2010; Ogawa, 2015). Gen capB kích thước 1.394 bp, mã hóa cho protein capB (397
axit amin, khối lượng phân tử 44 kDa). Gen capC kích thước 449 bp, mã hóa cho
protein capC (149 axit amin, khối lượng phân tử 16 kDa).
Để xác định chính xác B. anthracis gây bệnh trong tự nhiên, ngoài gen đích
trên nhiễm sắc thể, cần thiết kế thêm các cặp mồi xác định gen trên plasmid độc lực
pXO1 và pXO2. Plasmid pXO1 và pXO2 được duy trì ổn định trong B. anthracis
khi phát triển trong cơ thể chủ. Tuy nhiên, trong quá trình nuôi cấy, hay trong tự
nhiên, dưới áp lực chọn lọc, plasmid pXO2 có thể bị mất. Ngược lại, plasmid pXO1
hiếm khi bị mất, sự ổn định này có thể liên quan đến topoisomerase 1 thuộc
plasmid. B. anthracis có thể được phục hồi plasmid qua nuôi cấy tại điều kiện 43oC