MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết đề tài
Bacillus anthracis và Yersinia pestis là hai loài vi khuẩn gây bệnh
tối nguy hiểm tương ứng là bệnh than và dịch hạch, từng gây nên nỗi
kinh hoàng trong lịch sử loài người, có thể bị lợi dụng làm vũ khí
sinh học. Ở Việt Nam, B. anthracis còn xuất hiện rải rác ở các tỉnh
miền núi phía Bắc, trong khi Y. pestis vẫn tồn tại trên một số loài
gặm nhấm ở khu vực Tây Nguyên và có thể bùng phát thành dịch bất
kỳ lúc nào. Mặt khác, chúng ta cần có phương án ứng phó nhanh, kịp
thời trong phòng chống khủng bố sinh học.
Trong một vụ tấn công nghi ngờ có khủng bố sinh học hay mẫu
môi trường nghi nhiễm các mầm bệnh này, việc phát hiện nhanh,
chính xác tác nhân sinh học là một trong những yếu tố quyết định
đến sức khỏe cộng đồng và an ninh quốc gia. Việc sàng lọc nhanh
những mẫu nghi ngờ giúp kiểm soát sự lây lan và đảm bảo điều trị
chính xác. Phương pháp nuôi cấy truyền thống được xem là “tiêu
chẩn vàng” trong xác định B. anthracis và Y. pestis. Tuy nhiên, mặc
dù có độ nhạy cao, phương pháp này đòi hỏi thời gian 2 - 3 ngày,
một số trường hợp độ đặc hiệu không cao, cần tiến hành các thử
nghiệm bổ sung. Ngoài ra, phương pháp này cần tiến hành ở điều
kiện phòng an toàn sinh học cấp 3 (BSL-3) với nhân viên được đào
tạo và có kinh nghiệm. Các phương pháp miễn dịch được nghiên cứu
dưới dạng các que thử nhanh rất thuận tiện nhưng độ nhạy, độ đặc
hiệu thấp. Do đó, các phương pháp này khó ứng dụng trong chẩn
đoán trên thực địa và phòng chống khủng bố sinh học.
Hiện nay, đã có một số kỹ thuật dựa trên PCR dùng để xác định
nhanh và chính xác B. anthracis cũng như Y. pestis được phát triển
với những ưu điểm nổi bật như độ nhạy, độ đặc hiệu cao và có thể
thực hiện với các mẫu đã bất hoạt (nên chỉ cần thực hiện ở điều kiện
phòng an toàn sinh học cấp 2). Tuy nhiên, hầu hết các kỹ thuật này
chỉ phát hiện một loại plasmid độc lực với từng tác nhân nên không

bộ mẫu chuẩn và các chủng phân lập.
3. Nội dung nghiên cứu của đề tài
- Thiết kế các cặp mồi cho kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng
thời B. anthracis và Y. pestis.
- Thiết kế, tối ưu kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B.
anthracis và Y. pestis.
- Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR chẩn đoán
đồng thời B. anthracis và Y. pestis trong phòng thí nghiệm và các
chủng phân lập.


- Phân tích trình tự các gen đích đặc trưng và gen độc lực của các
chủng B. anthracis và Y. pestis.
4. Đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong
nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng
thời B. anthracis và Y. pestis. Kỹ thuật multiplex PCR với 6 cặp mồi
được thiết kế, tối ưu cho phép khuếch đại đồng thời 7 sản phẩm bao
gồm: 3 gen đích là vrrA (thuộc nhiễm sắc thể), pagA (thuộc plasmid
pXO1), capA (thuộc plasmid pXO2) của B. anthracis; và 3 gen đích
là ypo2088 (thuộc nhiễm sắc thể), pla (thuộc plasmid pPCP1), caf1
(thuộc plasmid pMT1) của Y. pestis, cùng 1 gen chứng nội tại là
plasmid tái tổ hợp để xác minh kết quả chẩn đoán. Do đó, khắc phục
được hiện tượng dương tính giả đối với trường hợp các chủng vi
khuẩn B. anthracis và Y. pestis không đầy đủ độc lực, phân biệt với
chủng gây bệnh, giúp giảm giá thành chẩn đoán so với việc phải thực
hiện các lần PCR riêng rẽ, rút ngắn thời gian chẩn đoán.
5. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 139 trang, được chia thành các phần: Mở đầu (3
trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (30 trang); Chương 2: Vật liệu

bệnh dịch hạch và viêm phổi cấp tính.
Vũ khí sinh học hiện nay đã trở thành mối quan tâm hàng đầu của
an ninh quốc gia bởi có thể bị các tổ chức khủng bố lợi dụng trong
chiến tranh sinh học. Trong các tác nhân đã được WHO và CDC nêu
ra, B. anthracis, Y. pestis được đánh giá là tác nhân có nguy cơ cao
nhất trong khủng bố vì gây bệnh nguy hiểm, dễ nuôi cấy, tăng sinh
khối với số lượng lớn, không cần trang bị hiện đại lại dễ sử dụng,
vận chuyển và gây nhiễm.
Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về phòng chống chiến tranh
sinh học đề phòng các tình huống địch tấn công bằng vũ khí sinh
học. Sự quan tâm được đặt ở mức đặc biệt với hai loại vi khuẩn là B.
anthracis và Y. pestis. Xác định tầm quan trọng của việc xác định


nhanh và chính xác hai loại vi khuẩn này, đề tài KCB 01-09 và một
số đề tài đã thiết kế các phản ứng PCR chẩn đoán cho từng loại tác
nhân. Năm 2005, Lê Thanh Hòa và cs. đã nghiên cứu xây dựng
phương pháp chẩn đoán nhanh Y. pestis trên các loại môi trường giả
định. Tuy nhiên, công trình chỉ dừng lại ở việc khẳng định Y. pestis
thông qua một đoạn gen duy nhất trên plasmid gây độc là pPCP1 (Lê
Thanh Hòa, 2005). Trên thực tế, một số chủng Y. pestis plasmid
pPCP1 có thể bị mất đi thì sản phẩm của nghiên cứu này sẽ không áp
dụng được (Marston, 2005). Hay nghiên cứu tách dòng và đọc trình
tự gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ từ chủng B. anthracis
VCM1167 (Phạm Thúy Kiều, 2006).
Như vậy, có thể nói các đề tài về B. anthracis và Y. pestis ở Việt
Nam hiện nay còn ít và riêng lẻ cho từng loại tác nhân. Do đó, việc
nghiên cứu phát triển kỹ thuật mPCR xác định nhanh và chính xác
đồng thời hai tác nhân nguy hiểm này là cấp thiết, đáp ứng yêu cầu
an ninh quốc phòng và phòng chống dịch bệnh. Kỹ thuật mPCR

2.2.2. Tách chiết DNA tổng số
2.2.3. Khuếch đại gen bằng PCR
2.2.4. Điện di DNA trên gel agarose
2.2.5. Tinh sạch DNA
2.2.6. Thiết kế kỹ thuật mPCR xác định đồng thời gen đặc trưng và
gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis
2.2.7. Tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y.
pestis
2.2.8. Thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp của kỹ thuật mPCR
2.2.9. Tối ưu kỹ thuật mPCR chứa chứng nội tại
2.2.10. Thiết lập và đánh giá bộ mẫu chuẩn đánh giá độ nhạy, đặc
hiệu và ổn định của kit mPCR
2.2.11. Xác định các chủng phân lập bằng nuôi cấy, định danh
2.2.12. Thử nghiệm kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập
2.2.13. Kiểm tra các chủng vi khuẩn bằng giải trình tự

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH
NHANH ĐỒNG THỜI B. anthracis VÀ Y. pestis
3.1.1. Nghiên cứu thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho mPCR
Kỹ thuật mPCR lý tưởng để xác định đồng thời B. anthracis và Y.
pestis phải được thiết kế phát hiện đồng thời B. anthracis, Y. pestis
và đánh giá đầy đủ các mức độ độc lực khác nhau của chúng trong tự
nhiên. Trong đó, với B. anthracis cần 1 cặp mồi trên nhiễm sắc thể
(lựa chọn gen vrrA) và 2 cặp mồi trên plasmid pXO1 và pXO2 tương
ứng là gen pagA và capA. Tương tự, với Y. pestis, gen ypo2088 (trên
nhiễm sắc thể), pla (pPCP1) và caf1 (pMT1) được lựa chọn. Như


vậy, 6 cặp mồi đặc hiệu cho mPCR được thiết kế đảm bảo khuếch đại

CCTCGCGCACTTCTTTTTCT-R

20

59.76
59.13

222

pagAF1/R1

AAATGGAGCACGGCTTCTGA-F
AGCCTGTATCCACCCTCACT-R

20

59.96
59.96

751

capAF1/R1

TGACGATGACGATGGTTGGT-F
GCTTCCTGTCTAGGACTCGG-R

20

59.39
59.26

CGCTTACTCTTGGCGGCTAT-F
GCTGCAAGTTTACCGCCTTT-R

20

60.25
59.69

271

*Tm. Nhiệt độ nóng chảy

3.1.2. Nghiên cứu thiết kế kỹ thuật mPCR
Kỹ thuật mPCR được thiết kế và đánh giá trên 2 chủng chuẩn có
đầy đủ độc lực là B. anthracis Ba và Y. pestis Yp cùng đối chứng âm
là B. cereus và E. coli, Y. enterocolitica.
3.1.2.1. PCR đơn mồi phát hiện gen vrrA, pagA, capA của B.
anthracis
Để có cơ sở cho thiết kế kỹ thuật mPCR phát hiện đồng thời 3
gen đích B. anthracis, PCR đơn mồi được thực hiện ban đầu giúp
kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm và độ đặc hiệu từng cặp mồi.
Hình 3. 8. Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích
pagA, vrrA, capA của B. anthracis Ba bằng
PCR đơn mồi
ĐC(-). Đối chứng âm là nước khử ion; M.
Marker 100 bp (Thermo Scientific)

Các gen pagA (751 bp), vrrA (222 bp) và capA (610 bp) đều xuất
hiện băng đặc hiệu và không có băng phụ (Hình 3.8). Như vậy, nồng
độ các thành phần, chu trình nhiệt trong PCR đơn mồi này sẽ được


bp

Hình 3. 12. Sản phẩm PCR với 6 cặp mồi,
từng loại DNA khuôn
ĐC(-). Đối chứng âm là nước khử ion; Yp. Sản
phẩm mPCR với khuôn DNA Y. pestis; Ba. Sản
phẩm mPCR với khuôn DNA B. anthracis; M.
Marker 100 bp (Thermo Scientific)

3.1.2.6. Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 2 tác nhân
Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 2 loại khuôn chỉ thu được 3
băng đích của Y. pestis.


3.1.3. Nghiên cứu tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B.
anthracis và Y. pestis
Cần tối ưu các thông số của mPCR để đảm bảo xác định đồng
thời B. anthracis và Y. pestis như: nồng độ mồi, đệm, MgCl 2, dNTPs
cũng như các điều kiện về chu trình nhiệt để thu được đồng thời 6
băng sản phẩm đích đặc hiệu.
Nồng độ các mồi Y. pestis 0,1 μM và B. anthracis 0,6 μM là tối
ưu trong mPCR (Hình 3.14).
Hình 3. 14. Tối ưu nồng độ mồi của mPCR
M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1. 0,1
μM; 2. 0,2 μM; 3. 0,4 μM; 4. 0,6 μM

Với nhiệt độ gắn mồi 56oC, nồng độ MgCl2 và dNTPs tối ưu
tương ứng là 0,6 mM và 0,25 mM, phản ứng mPCR cho kết quả 6
băng đặc hiệu rõ nét nhất. Nồng độ dung dịch đệm được khảo sát ở 4

IC trong quá trình tách chiết DNA ở
các nồng độ khác nhau với mẫu B.
anthracis
M. Marker 100 bp (Thermo Scientific);
109-103. Các mức nồng độ IC tương ứng.

Để kiểm soát toàn bộ các công đoạn của xét nghiệm, IC được bổ
sung vào trong quá trình tách chiết với một lượng tối thiểu có thể
phát hiện được nhằm loại bỏ tối đa sự ảnh hưởng đến hiệu quả tách
chiết cũng như mPCR. Kết quả trên cho thấy, băng chứng nội tại (1
kb) xuất hiện rõ ở các mức nồng độ plasmid từ 10 9-105 copy/ mẫu. Ở
mức nồng độ IC là 106-105 copy/ mẫu xuất hiện đầy đủ 3 băng đích
của B. anthracis và băng IC. Trong đó, băng IC xuất hiện rõ nét,
không bị smear và quan trọng hơn, băng đích capA cũng xuất hiện.
Còn mức nồng độ IC là 104 và 103 copy không còn xuất hiện băng IC
(Hình 3.20). Qua quá trình tối ưu trên các mẫu B. anthracis, Y. pestis,
mPCR-IC cho các băng đích rõ nét, tách biệt gồm 6 băng cho xác
định B. anthracis và Y. pestis và 1 băng IC. Có thể thấy rằng, mức
nồng độ IC 5x104copy/ mẫu cho các băng rõ nét nhất và đây chính là
nồng độ được lựa chọn sau khi tối ưu lại nồng độ của cặp mồi
capAF1/R1 (0,64 µM), các thông số khác của mPCR đã tối ưu ban
đầu cơ bản vẫn giữ nguyên (Hình 3.21). Như vậy, đã thiết kế thành


công kỹ thuật mPCR-IC tại xác định đồng thời B. anthracis và Y.
pestis. Chu trình nhiệt: Biến tính 94oC/4 phút, 32 chu kỳ (94oC/1
phút; 56oC/45 giây; 72oC/50 giây), 72oC/10 phút.
Hình 3. 21. Kiểm tra mPCR tối
ưu có bổ sung IC ở các nồng độ
105 và 5x104 copy

Hình 3. 23. Xác định ngưỡng phát hiện B. anthracis
M. Marker 50 bp; B50-B59. các mức nồng độ DNA; ĐC(-). Đối chứng âm

Mẫu có nồng độ DNA thấp nhất còn cho khả năng phát hiện được
là B55 (mã số gốc PBA19) (Hình 3.23), nồng độ 0,000092 ng/µl
tương đương 81,5 copy/ phản ứng mPCR sử dụng 5 µl DNA.
Với kết quả xác định ngưỡng của mPCR phát hiện B. anthracis
như trên, tiến hành thiết lập bộ mẫu chuẩn độ nhạy 100 ống (50
µl/ống), bao gồm: 10 hàng (ký hiệu EB1 đến EB10) x 10 cột. Sử
dụng 10 mức nồng độ ở bộ mẫu chuẩn xác định ngưỡng mPCR phát
hiện B. anthracis từ PBA10 (0,046875 ng/µl) - PBA19 (0,000092
ng/µl) tương ứng ký hiệu EB1 - EB10.
Tương tự, ngưỡng phát hiện của bộ mẫu chuẩn Y. pestis là 130,5
copy/ phản ứng. Bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định Y. pestis
cũng được thiết lập gồm 100 ống (50 µl/ống), bao gồm: 10 hàng (ký
hiệu EY1 đến EY10) x 10 cột.


Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu chẩn đoán của kit
mPCR
Các bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu mPCR đối với B. anthracis được
thiết lập tương tự với các bộ mẫu chuẩn độ nhạy, sử dụng chủng B.
cereus. Tương tự, sử dụng chủng E. coli và Y. enterocolitica cho Y.
pestis.
Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn xác định độ nhạy, độ đặc hiệu
của kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis
Để thuận tiện cho việc đánh giá nội bộ, sau khi thiết lập bộ mẫu
chuẩn độ nhạy và đặc hiệu xác định từng tác nhân, chúng tôi tiến
hành phối trộn các bộ mẫu chuẩn riêng rẽ tương ứng để tạo các bộ
mẫu chuẩn hỗn hợp đồng thời B. anthracis và Y. pestis.

nghiệm lâm sàng. Với các chủng lâm sàng B. anthracis cũng như Y.
pestis, đặc biệt là các mẫu phân lập ngoài môi trường hay lưu trữ thời
gian dài trong phòng thí nghiệm, một số tính chất về kiểu hình, kiểu
gen có thể bị biến đổi. Do đó, để khẳng định việc thiết kế thành công
kỹ thuật mPCR, các chủng phân lập B. anthracis và Y. pestis sau khi
được kiểm tra, xác định bằng nuôi cấy, được xác định bằng kỹ thuật
mPCR. Kết quả xác định của mPCR được khẳng định bằng phân tích
trình tự toàn bộ chiều dài một số gen tiêu biểu trên nhiễm sắc thể, các
plasmid độc lực.
Xác định chủng phân lập bằng nuôi cấy, định danh
Các chủng nghi ngờ B. anthracis và chủng chuẩn B. anthracis Ba
(đối chứng dương) được nuôi cấy trên môi trường thạch máu cừu ở
37oC/CO2 5%/ 24 giờ. Kết quả, tất cả các chủng cho khuẩn lạc dạng
R, màu xám, trực khuẩn Gram dương, hình vuông hai đầu, xếp đôi,
chuỗi, bào tử ở giữa và không làm biến đổi hình dạng vi khuẩn, trong
đó 11 chủng không tan máu β trên môi trường thạch máu cừu - có 4
chủng hình thành vỏ (B. anthracis Ba, Ba1, Ba3, Ba4). 13 chủng còn
lại tan máu β. Định danh cho 11 chủng là B. anthracis, còn lại là B.
cereus (ID > 90%). Chủng Y. pestis Yp1, Yp2 cho kết quả mọc các
khuẩn lạc kích thước 1 - 2 mm dạng S, màu xám đục, bờ đều, bề mặt
nhẵn, trung tâm lồi giống hình trứng oplet và không tan máu, là trực
khuẩn Gram âm nhỏ, oxydase (-). Định danh là Y. pestis với ID Yp1,
Yp2 lần lượt là 98,6 và 96,4%.
Thử nghiệm kỹ thuật mPCR
Kỹ thuật mPCR được thử nghiệm trên các mẫu nghiên cứu B.
anthracis, Y. pestis và các mẫu đối chứng âm là B. cereus, E. coli.
Mẫu hỗn hợp được tạo ra bằng cách trộn lẫn chủng B. anthracis và Y.
pestis sau đó tiến hành tách DNA tổng số. Ở tất cả các mẫu đối
chứng và mẫu thử nghiệm đều xuất hiện băng chứng nội tại IC, điều


Kết quả thử nghiệm kỹ thuật mPCR cho thấy, khi chỉ xuất hiện 1
băng có kích thước tương ứng với gen đích vrrA (mẫu Ba5 Hình
3.36a) hay không xuất hiện băng đích nào (mẫu Ec Hình 3.36b),
được xác định là mẫu âm tính với B. anthracis và Y. pestis gây bệnh
(tương ứng là mẫu B. anthracis Ba5 và E. coli). Cụ thể, kết quả Hình
3.36a, đường chạy ký hiệu BY2 xuất hiện đầy đủ 6 băng đích có kích
thước đúng với mẫu đối chứng dương, được xác định là mẫu dương
tính đồng thời với B. anthracis và Y. pestis có đầy đủ độc lực. Mẫu
ký hiệu Yp1, Yp2, Ba4 (Hình 3.36a) và mẫu Ba3 (Hình 3.36b) xuất
hiện đầy đủ 3 băng của các gen đích cho từng đối tượng, được xác
định lần lượt là chủng Y. pestis và B. anthracis gây bệnh. Trong khi
đó, đáng chú ý trên Hình 3.36a, mẫu Ba6 chỉ xuất hiện 2 băng có
kích thước tương ứng với 2 gen đích là pagA và vrrA, không xuất
hiện băng chỉ thị gen capA. Đây là mẫu B. anthracis bị thiếu plasmid
pXO2, không đầy đủ độc lực (chủng B. anthracis Ba6). Như vậy,
trong 10 chủng phân lập B. anthracis, bằng kỹ thuật mPCR đã xác
định được 3 chủng B. anthracis đầy đủ độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4), 1


chủng giảm độc do thiếu gen capA thuộc plasmid pXO2 (chủng B.
anthracis Ba6), 6 chủng còn lại là B. anthracis không độc. Đồng thời
với Y. pestis, kỹ thuật mPCR đã xác định được 2/2 chủng Y. pestis có
đầy đủ gen độc lực.
Để khẳng định kết quả, băng điện di đặc hiệu cho các gen đích
chẩn đoán được tinh sạch gel và giải trình tự. Kết quả, tất cả các trình
tự đều thuộc các gen đích tương ứng của B. anthracis và Y. pestis.
Như vậy, kỹ thuật mPCR đã được thử nghiệm thành công trên chủng
chuẩn và chủng phân lập.
Phân tích trình tự gen đặc trưng và gen độc lực của B. anthracis
và Y. pestis

trong tất cả các trường hợp bởi nằm trên vùng đa điểm cắt. Ngoài ra,
trong một số trường hợp, chúng tôi sử dụng thêm một số enzyme
khác có trình tự nhận biết ở trên vector và trong trình tự gen đích.
Quá trình cắt kiểm tra bằng các enzyme giới hạn được minh họa với
vector tái tổ hợp pJET1.2-pagA (Hình 3.39).

Hình 3. 39. Tạo dòng gen pagA trong vector pJET1.2/blunt
a) Sơ đồ biểu hiện quá trình cắt kiểm tra vector pJET1.2-pagA bằng BglII;
b) Cắt kiểm tra vector pJET1.2-pagA trên gel agarose 1,2%.

Sử dụng enzyme giới hạn BglII, cặp enzyme XbaI và EcoRI,
chúng tôi đã chọn được các dòng tế bào mang plasmid chứa gen
pagA cho sản phẩm kích thước khoảng 4,0 và 1,2 kb (cắt bằng XbaI
và EcoRI) và khoảng 2,8; 2,4 kb đối với BglII. Như vậy, các gen đích
đã được tách dòng thành công.
Phân tích trình tự các gen đích đặc trưng và gen độc lực
Phân tích trình tự gen vrrA trên 10 chủng B. anthracis phân lập
cho thấy, gen vrrA giống nhau hoàn toàn, độ tương đồng từ 99-100%
so với chủng tham chiếu. Phân tích trình tự gen pagA của 3 chủng B.
anthracis độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4) xác định được 3 đột biến điểm
(T→C), trong đó 1 đột biến đồng nghĩa (T→C)195, 2 đột biến sai nghĩa
là (T→C)1693 và (T→C)1799 khi so sánh với chủng B. anthracis
Vollum-USA. Nghiên cứu trình tự gen cya và lef (pXO1), chỉ xác
định được 1 đột biến đồng nghĩa (T→C)600 trên gen cya chủng B.
anthracis Ba3 và Ba4, còn gen lef có mức độ tương đồng 100% so
với chủng tham chiếu. Một đột biến sai nghĩa hoàn toàn mới


(A→G)1048 ở gen capA chủng B. anthracis Ba1 làm thay đổi axit amin
lysine thành glutamic (Hình 3.43). Hai gen còn lại là capB, capC có

thường. Các thành phần tham gia trong phản ứng cũng như chu trình
nhiệt cần được đánh giá, tối ưu. Đồng thời, việc nghiên cứu, thiết kế
mồi trong mPCR có vai trò rất quan trọng. Đối với 2 tác nhân B.
anthracis và Y. pestis, cần chỉ ra được chủng gây bệnh (có đầy đủ
độc lực) hay không. Với B. anthracis, gen pagA (pXO1) được WHO
khuyến cáo sử dụng bởi khi chủng B. anthracis thiếu gen này sẽ
không thể gây độc. Ngoài ra, gen capA (pXO2) được lựa chọn nhiều
trong chẩn đoán (Skottman, 2007; Kurosaki, 2009). Một gen đích
nữa được sử dụng để phát hiện tất cả các chủng vi khuẩn than là vrrA
nằm trên nhiễm sắc thể - có tính ổn định cao và bền vững. Trong xác
định Y. pestis, pla, caf1, ypo2088 là các gen đích thường được sử
dụng, cho phép chẩn đoán chính xác Y. pestis. Như vậy, cần thiết kế 6
cặp mồi trong mPCR cho xác định đồng thời B. anthracis và Y.
pestis. Khi thực hiện mPCR với nhiều cặp mồi, xác suất tạo sản
phẩm không đặc hiệu, bắt cặp chéo giữa các mồi tăng lên. Do đó, sau
khi nghiên cứu thiết kế mồi, tối ưu mPCR là điều kiện tiên quyết để
hạn chế tối đa những tương tác lẫn nhau giữa các cặp mồi cũng như
việc tạo thành các sản phẩm phụ.
Cho đến trước nghiên cứu này, có rất ít công trình phát triển kỹ
thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis cũng như
các tác nhân truyền nhiễm khác có kết hợp các cặp mồi chẩn đoán
xác định cả gen đặc trưng trên nhiễm sắc thể và gen độc lực trên
plasmid cùng chứng nội tại để xác minh kết quả. Hầu hết các công
trình chỉ lựa chọn một trong các gen đích độc lực trên plasmid
(Batra, 2013; Safari Foroshani, 2013; Whiteduck-Leveillee, 2016),
như vậy sẽ không đánh giá được đầy đủ tình trạng độc lực của các
chủng vi khuẩn gây bệnh và có thể bỏ sót chẩn đoán. Để khắc phục
hạn chế này, một số nghiên cứu đã kết hợp cả gen trên nhiễm sắc thể
và gen độc lực, tuy nhiên lại trên từng tác nhân riêng rẽ (Chen, 2012;
Ogawa, 2015; Riojas, 2015; Lindsey, 2017). Mặt khác, nhiều công

mẫu chuẩn. Các chủng chuẩn sử dụng trong tách chiết DNA cho thiết
lập mẫu chuẩn nội bộ đều được kiểm tra, đánh giá tính chất sinh vật,
hóa học điển hình. Các mẫu DNA có độ tinh sạch và nồng độ cao
được sử dụng làm mẫu chuẩn. Theo cách này, bộ mẫu chuẩn có độ
đồng nhất cao và có thể pha loãng thành các nồng độ chính xác, cũng
là hướng thiết lập được WHO khuyến cáo. Giá trị ngưỡng phát hiện
cho B. anthracis và Y. pestis tương ứng là 81,5 và 130,5 copy/phản
ứng, tương đương với kết quả của các công trình đã công bố (Heinz


Ellerbrok, 2002; Batra, 2013; Nghiem, 2015), độ nhạy 100% thử
nghiệm trên số mẫu đủ lớn là 100, đạt tiêu chuẩn cơ sở.
Kết quả đánh giá độ đặc hiệu cho thấy, nếu chỉ sử dụng 1 gen trên
nhiễm sắc thể (vrrA) có thể chẩn đoán nhầm giữa B. anthracis và B.
cereus (Bode, 2004; Rasko, 2004). Mặt khác, nếu chỉ dựa vào 1 gen
trên plasmid thì nguy cơ âm tính giả với chủng mất một trong các
plasmid độc lực. Với B. anthracis, để khẳng định là vi khuẩn than
gây bệnh cần có mặt đồng thời 3 gen là vrrA, pagA, capA. Kết quả
này cũng minh chứng cho yêu cầu phải kiểm định trên panel mẫu với
tất cả các kit thương mại trước khi đưa ra thị trường. Như vậy, các bộ
panel độ nhạy và độ đặc hiệu được thiết lập là đảm bảo và có ý nghĩa
đánh giá giá trị khoa học của bộ kit, có khả năng kiểm định các tiêu
chuẩn của một bộ kit PCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis với
nhiều cách thiết kế mồi khác nhau.
Đánh giá kit PCR chẩn đoán trên các bộ mẫu chuẩn là kiểm định
trong điều kiện lý tưởng. Trên thực tế, B. anthracis và Y. pestis có thể
tồn tại tự nhiên hay bị gây nhiễm ngoài môi trường, là những mẫu
phức tạp, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật PCR, đòi hỏi cần
được xác định nhanh, chính xác trong những trường hợp nghi ngờ.
Kỹ thuật mPCR này đã được thử nghiệm trên chủng chuẩn và chủng

chứa plasmid giống pXO1 và pXO2, có khả năng tạo kháng nguyên
bảo vệ và tạo vỏ. Xác định trình tự đa locus những chủng này cho
thấy chúng có quan hệ rất gần với B. anthracis và là chủng B.
cereus và B. thuringiensis độc hiếm gặp (Koehler, 2009). Đến nay,
chỉ mới có một vài trường hợp này được báo cáo trên thế giới, làm
thay đổi quan niệm cũ về bệnh than chỉ được giới hạn trong B.
anthracis (Hoffmaster, 2004; Klee, 2006; Kim, 2015). Đây là trường
hợp hiếm, cá thể khi bị nhiễm những chủng đặc biệt này đều bị tử
vong giống bệnh than, và cũng có thể được xác định bằng kỹ thuật
mPCR được phát triển này (Chun, 2012; Irenge, 2012; Girault,
2014). Như vậy, kỹ thuật mPCR tối ưu chứa chứng nội tại tái tổ hợp
này đã cho phép xác định B. anthracis cũng như Y. pestis gây bệnh.
Kỹ thuật mPCR này đã chứng tỏ đây là công cụ hữu ích cho việc xác
định nhanh đồng thời cũng như phân biệt chính xác các chủng B.
anthracis, Y. pestis độc lực và không độc lực trong tự nhiên.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Phát triển thành công kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng
thời B. anthracis và Y. pestis.
Phát triển thành công kỹ thuật mPCR tối ưu với 6 cặp mồi và
chứng nội tại tái tổ hợp, cho phép xác định nhanh đồng thời B.
anthracis và Y. pestis, trong đó:


-

3 cặp mồi phát hiện 3 gen đặc hiệu của B. anthracis là vrrA,
pagA, capA và 3 cặp mồi phát hiện 3 gen đặc hiệu của Y. pestis
là ypo2088, pla, caf1 trong kỹ thuật mPCR.