ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
--------------------

Trần Thị Phƣơng

NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ VECTOR NHỊ THỂ
DÙNG CHO CHUYỂN GENE Ở NẤM SỢI
Aspergillus BẰNG VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
--------------------

Trần Thị Phƣơng

NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ VECTOR NHỊ THỂ
DÙNG CHO CHUYỂN GENE Ở NẤM SỢI
Aspergillus BẰNG VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60420121

Hà Nội, ngày 21 tháng 08 năm 2017
Học viên

Trần Thị Phƣơng


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
5-FOA

5 - fluoroorotic acid

A. awamori

Aspergillus awamori

A. nidulans

Aspergillus nidulans

A. niger

Aspergillus niger

A. oryzae

Aspergillus oryzae

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

HEPES

4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid

IM

Induction medium (môi trƣờng cảm ứng)

kb

kilo base pairs

LB

Left border (biên trái)/ Luria Bertani (môi trƣờng LB)


NST

Nhiễm sắc thể

OD

Optical Density (mật độ quang)

ORF

Open reading frame (khung đọc mở)

PCR


Ti plasmid

Tumor inducing plasmid (plasmid cảm ứng tạo khối u)

ura

Uracil

uri

Uridine

Vir

Virulence region (vùng độc lực)

WT

Wild-type (chủng tự nhiên)


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3
1.1.

Tổng quan về nấm sợi....................................................................................3

1.1.1. Đặc điểm sinh học ......................................................................................3

2.2.5. Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen ...........................................43
2.2.6. Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens .......................44
2.2.7. Sàng lọc các thể chuyển gen.....................................................................46
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................48
3.1. Lựa chọn chủng nấm dùng cho chuyển gen ...................................................48
3.1.1 Chủng nấm A. niger N402đƣợc lựa chọn để xóa gen ...............................48
3.1.2. Đặc điểm hình thái của chủng nấm A. oryzae VS1 và RIB40 trợ dƣỡng
uridine/uracil ......................................................................................................49
3.2. Tạo thành công chủng N402 đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil .....................50
3.2.1. Tạo cấu trúc xóa gen pyrG .......................................................................51
3.2.2. Xóa thành công gen pyrG ở A. niger N402 ..............................................52
3.3. Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil.....58
3.3.1. Tạo vector pEX2A....................................................................................58
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ uridine/ uracil đến sự phục hồi sinh trƣởng của
chủng xóa gen pyrG ...........................................................................................59
3.3.3. Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil
............................................................................................................................61
3.3.4. Đánh giá hiệu quả chuyển gen huỳnh quang DsRed vào A. niger N402 trợ
dƣỡng ..................................................................................................................64
3.4. Biểu hiện gen DsRed ở A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil sử dụng vector
pEX2A ...................................................................................................................65
3.4.1. Mức độ tƣơng đồng của gen pyrG ở chi Aspergillus ...............................65
3.4.2. Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi A. oryzae ...............................................66
3.5. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed dƣới sự kiểm soát của promoter glaA từ A.
niger .......................................................................................................................72


3.5.1. Tạo vector pEX2C ....................................................................................72
3.5.2. Biểu hiện gen DsRed dƣới sự kiểm soát của promoter glaA thông qua
vector pEX2C .....................................................................................................73

Hình 1.5. Mô hình vi khuẩn A. tumefaciens với hệ thống vector nhị thể

20

Hình 1.6. Biểu hiện gen huỳnh quang GFP ở nấm sợi A. oryzae

29

Hình 1.7. Biểu hiện gen DsRed ở chủng nấm sợi A. oryzae AUT1-PlD

30

Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của chủng nấm A. niger

47

Hình 3.2. Hình thái và cấu trúc hiển vi của 2 chủng A. oryzae VS1 và

48

RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil
Hình 3.3. Tạo cấu trúc xóa gen pyrG ở nấm Aspergillus niger

51

Hình 3.4. Kết quả PCR kiểm tra 3 khuẩn lạc AGL1 biến nạp vector xóa

52

pyrG A1, A2, A3


61

trợ dƣỡng uridine/uracil
Hình 3.12. Quy trình tối ƣu chuyển gen vào nấm A. niger N402 trợ dƣỡng

62

bằng vi khuẩn A. tumefaciens
Hình 3.13. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed ở chủng A. niger N402 trợ

64

dƣỡng uridine/uracil
Hình 3.14. Sự tƣơng đồng của pyrG giữa các loài Aspergillus khác nhau

65

Hình 3.15. Quy trình chuyển gen vào A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil

66

Hình 3.16. Kết quả chuyển gen DsRed vào A. oryzae chủng RIB40 và VS1

67

trợ dƣỡng uridine/uracil
Hình 3.17. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed ở chủng RIB40 trợ dƣỡng

68


76


MỞ ĐẦU

Aspergillus là chi nấm sợi phổ biến trong tự nhiên và có vai trò quan trọng
trong sản xuất thực tiễn. Một số loài nấm thuộc chi này đã đƣợc Cục Quản lý Thực
phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn (Generally Regarded as
Safe, GRAS) dùng trong sản xuất công nghiệp nhƣ A. oryzae, A. niger, A. awamori,
A. sojae, … Trong đó, hai loài A. niger và A. oryzae với khả năng tiết mạnh enzyme
vào môi trƣờng nuôi cấy nên đã đƣợc sử dụng nhƣ nhà máy tế bào để sản xuất nhiều
loại enzyme thƣơng mại cả ở dạng tự nhiên và tái tổ hợp. Gần đây, hệ gen của A.
niger và A. oryzae đã đƣợc giải trình tự hoàn toàn và là tiền đề cho cải biến di
truyền nâng cao hiệu suất biểu hiện các gen mong muốn ở hai loài nấm này.
Hiện nay, hai phƣơng pháp chuyển gen phổ biến ở nấm sợi là chuyển gen
thông qua tế bào trần (protoplast) và chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens. Phƣơng pháp chuyển gen bằng tế bào trần là khá phức tạp với chi phí
cao và hiệu quả không ổn định ở những lần lặp lại. Phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi
khuẩn A. tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,
ATMT) lần đầu tiên đƣợc áp dụng thành công cho nấm sợi vào năm 1998 với nhiều
ƣu điểm nhƣ dễ thực hiện, chi phí thấp và hiệu suất ổn định. Tuy nhiên, phƣơng
pháp chuyển gen ATMT vẫn chủ yếu sử dụng các gen kháng kháng sinh nên khó áp
dụng vào điều kiện sản xuất thực tế vì nguy cơ phát tán gen kháng thuốc vào môi
trƣờng. Chính vì vậy, phát triển hệ thống chuyển gen sử dụng gen trợ dƣỡng
(marker trợ dƣỡng) là hƣớng tiếp cận an toàn, hiệu quả về chi phí và có tiềm năng
ứng dụng vào sản xuất thực tiễn.
Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển gen hiệu quả cao cho nấm sợi
Aspergillus sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens và marker trợ dƣỡng, chúng tôi thực
hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gene ở nấm

1.1.1. Đặc điểm sinh học
Nấm sợi (nấm mốc) là những vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp sinh bào tử và
sống hoại sinh nhờ khả năng tiết enzyme để phân hủy các hợp chất hữu cơ có trong
môi trƣờng. Chúng phân bố rộng khắp trên trái đất và đóng vai trò quan trọng trong
tự nhiên cũng nhƣ trong đời sống của con ngƣời. Nấm thƣờng sinh trƣởng trên các
bề mặt cơ chất tạo thành các dạng sợi nhƣ lông tơ, mạng nhện hoặc sợi bông đƣợc
gọi là hệ sợi [23].

Hình 1.1. Hình thái của một số loài nấm mốc điển hình. (A) Aspergillus fumigatus.
(B) Penicillium rubens. (C) Trichoderma sparsum. (D) Aspergillus flavus. (E)
Aspergillus oryzae. (F) Aspergillus niger [41, 42, 45, 92, 100]
Từ một bào tử nảy mầm, sợi nấm sẽ phát triển và phân nhánh hình thành nên
khuẩn lạc nấm. Sợi nấm kéo dài theo hình thức sinh trƣởng ở đỉnh sợi và phân
nhánh liên tục để tạo nên hệ sợi nấm (mycelium) xù xì nhƣ bông. Hệ sợi nấm cũng
có thể phát triển từ một đoạn sợi nấm sinh dƣỡng. Phần lớn sợi nấm có dạng trong
suốt. Tuy nhiên, ở một số loài, hệ sợi nấm tích lũy sắc tố khiến chúng có màu sắc
đặc trƣng hoặc hệ sợi tiết ra sắc tố làm đổi màu khu vực nấm phát triển. Một số loài
có hiện tƣợng tiết ra các hợp chất hữu cơ tạo nên những tinh thể trên bề mặt hệ sợi

3


[3]. Sợi nấm có cấu tạo đa bào, hình ống, đƣợc bao phủ bởi một lớp thành cứng, bên
trong chứa nguyên sinh chất có khả năng di chuyển. Chiều dài của sợi nấm thƣờng
không xác định, nhƣng đƣờng kính ống sợi tƣơng đối ổn định từ 2µm - 30µm, tùy
thuộc vào loài và điều kiện sinh trƣởng. Trên đĩa petri, hệ sợi nấm lan tỏa ra xung
quanh, phủ trên bề mặt thạch với tốc độ ổn định tạo nên các khuẩn lạc nấm dạng
tròn, đồng thời ăn sâu vào trong cơ chất [35].
Phần lớn nấm sợi không cần ánh sáng trong quá trình sinh trƣởng. Tuy nhiên,
ở một số loài, ánh sáng lại là yếu tố quan trọng trong quá trình hình thành bào tử.

trong nghiên cứu và ứng dụng sản xuất công nghiệp. Các sản phẩm tạo ra từ nấm
sợi vô cùng phong phú, từ axit hữu cơ đến các enzyme hay các chất chuyển hóa
phức tạp đƣợc ứng dụng nhiều mặt trong cuộc sống. Nấm sợi đƣợc coi là các nhà
máy tế bào lý tƣởng cho ngành công nhiệp sản xuất enzyme. Khoảng 40% enzyme
thƣơng mại trên thị trƣờng có nguồn gốc từ nấm sợi. Chúng đóng vai trò quan trọng
trong các ngành công nghiệp then chốt nhƣ công nghiệp thực phẩm, đồ uống, y
dƣợc, may mặc, thức ăn chăn nuôi [10, 15]. Phần lớn các enzyme này đƣợc sản xuất
từ các loài thuộc chi Aspergillus và Trichoderma bởi chúng có khả năng tiết một
lƣợng lớn enzyme, protein vào môi trƣờng. Nhiều loài nấm mốc đã đƣợc công nhận
là an toàn tiêu biểu nhƣ A. oryzae, A. niger, A. awamori, A. sojae [9, 15, 34]. Ngoài
các enzyme, nấm sợi còn đƣợc dùng làm nhà máy sản xuất các axit hữu cơ. Các axit
hữu cơ chủ yếu đƣợc sinh tổng hợp bởi nấm sợi là axit citric, axit gluconic, axit
itaconic với sản lƣợng hàng nghìn tấn mỗi năm. Các axit này đƣợc sử dụng trong
các ngành công nghiệp thực phẩm, đồ uống, dệt may và y dƣợc [15]. Trong các hệ
sinh thái, nấm sợi giúp phân hủy các hợp chất hữu cơ và không thể thiếu trong các
chu trình chuyển hóa vật chất. Ngoài ra, nấm còn đƣợc sử dụng làm sinh vật mô
hình trong di truyền học, hóa sinh học và nhiều lĩnh vực khác. Bên cạnh đó, cũng có
một số loài nấm gây hại nhƣ Aspergillus fumigatus gây bệnh cơ hội ở ngƣời,
Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin, hay một số loại nấm sợi gây hỏng rau quả
sau thu hoạch và gây bệnh cây trồng [14].
1.1.3. Giới thiệu chung về chi nấm sợi Aspergillus
Aspergillus là một chi nấm sợi phổ biến phân bố trên toàn cầu. Hiện
Aspergillus có khoảng trên 250 loài với các đại diện tiêu biểu nhƣ A. niger, A.

5


oryzae, A. nidulans, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus…[30]. Các loài trong
chi Aspergillus có mức độ tƣơng đồng cao về hình thái nên khó để phân biệt một
cách chính xác và đều có khả năng sinh sản vô tính bằng hình thành bào tử. Bào tử

đính (conidia). Bào tử của A. oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau tạo
thành màu đặc trƣng của khuẩn lạc [43, 62] Hình thái và cấu trúc khuẩn lạc của nấm
mốc A. oryzae đƣợc mô tả chi tiết ở Hình 1.2.

Hình 1.2. Hình thái và cấu trúc hiển vi của A. oryzae [41]
(A, B) Hình thái khuẩn lạc trên đĩa CYEA, MEA. (C) Cuống sinh bào tử.
(D, E) Hình thái và cấu trúc hiển vi của cuống sinh bào tử. (F) Bào tử A. oryzae
A. oryzae phân bố rộng khắp trên toàn thế giới, đặc biệt là các nƣớc nhiệt
đới. Vì là sinh vật hiếu khí bắt buộc nên A. oryzae thƣờng đƣợc tìm thấy ở những
nơi giàu ôxi, trên bề mặt nhiều loại cơ chất cung cấp dinh dƣỡng cần thiết cho
chúng. Chúng có thể sinh trƣởng và phát triển dễ dàng trên nhiều loại cơ chất nhƣ
mảnh vụn thực vật, lá cây, gỗ mục, các loại hạt…. Nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng,
phát triển của A. oryzae là 30oC - 40oC [49].

7


1.2.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. oryzae
Hệ gen đầy đủ của chủng quốc tế A. oryzae RIB40 đƣợc công bố năm 2005,
gồm 8 nhiễm sắc thể (NST) và hệ gen ty thể, kích thƣớc ƣớc tính đạt 37,6 Mbp với
khoảng 1207 gen, lớn hơn 25% - 30% so với hệ gen của một số loài thuộc cùng chi
Aspergillus. So với loài chuẩn dùng trong nghiên cứu phòng thí nghiệm là A.
nidulans và loài gây bệnh cơ hội ở ngƣời A. fumigatus thì hệ gen của A. oryzae lớn
hơn lần lƣợt là 29% - 34% [63]. Việc mở rộng kích thƣớc hệ gen cũng diễn ra ở các
loài có quan hệ gần gũi với A. oryzae là A. niger và A. flavus, đặc biệt là A. flavus
có hệ gen tƣơng đồng với A. oryzae đến 99,5%. Hệ gen của A. oryzae lớn hơn là do
thu nạp thêm DNA trong quá trình tiến hóa [62, 87]. Theo các nghiên cứu gần đây,
các loài A. oryzae, A. fumigatus và A. nidulans chứa lần lƣợt 135, 99, 90 gen mã
hóa cho các protease, chiếm khoảng 1% hệ gen (genome). Tất cả những gen mã hóa
cho protease có mặt trong hai loài A. fumigatus và A. nudilans đều có mặt trong A.

diện cho hai loài, nhận thấy hệ gen của hai chủng A. oryzae RIB40 và A. flavus
NRRL3357 có độ tƣơng đồng 99,5% DNA và 98% protein [87]. Nấm sợi A. oryzae
khác với A. flavus ở việc mất khả năng sinh độc tố aflatoxin do trong quá trình tiến
hóa đã tích lũy nhiều đột biến điểm và đột biến mất đoạn ở một số gen liên quan
đến sinh tổng hợp aflatoxin [20].
Không chỉ đƣợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, A. oryzae còn đƣợc
sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp sản xuất enzyme, và các sản phẩm
chuyển hóa thứ cấp. Các loại enzyme đƣợc sản xuất từ A. oryzae nhƣ glucoamylase,
α-amylase và một số protease với giá trị kinh tế cao đƣợc sử dụng trong công
nghiệp sản xuất bánh kẹo và đồ uống [98]. Đây cũng là loài cung cấp enzyme
protease sản lƣợng lớn phục vụ cho các ngành công nghiệp thực phẩm và sản xuất
các chất tẩy rửa [8].
Hiện nay, những hiểu biết về hệ gen của A. oryzae cùng với sự phát triển
vƣợt bậc của công nghệ sinh học hiện đại, đặc biệt là kỹ thuật di truyền, đã cho
phép chúng ta nghiên cứu chi tiết vai trò của các gen và biểu hiện chúng một cách
chủ động trong loài nấm sợi an toàn này.

9


1.3. Giới thiệu chung về A. niger
1.3.1. Phân loại và đặc điểm sinh học nấm sợi A. niger
Năm 1867 nấm sợi A. niger lần đầu tiên đƣợc phân lập bởi nhà thực vật học
ngƣời Pháp Philippe Edouard Léon van Tieghem. A. niger thuộc phân nhóm Nigri
(còn gọi là phân nhóm Aspergillus đen) của chi Aspergillus, họ Trichocomaceae.
Đây là loài điển hình và phổ biến nhất của chi Aspergillus phân bố rộng khắp các
vùng địa lý trên thế giới [30]. Nấm phát triển nhanh, chịu nhiệt, chịu lạnh tốt nên có
thể bắt gặp ở bất cứ nơi đâu, từ trong đất, nƣớc, không khí, mảnh vụn thực vật, hoa
quả thối rữa đến cả trên tƣờng nhà [93]. Dƣới kính hiển vi có thể quan sát thấy sợi
nấm trong suốt, có vách ngăn, phân nhánh liên tục, đƣờng kính hệ sợi 2,5 - 8µm.

cho bào tử của A. niger đƣợc bảo vệ lâu dài dƣới điều kiện khắc nghiệt [23].
Ngoài khả năng chịu lạnh, chịu nóng tốt, A. niger còn có giới hạn pH rất
rộng từ 1,5 - 9,8. Điều này cho phép chúng sinh trƣởng tốt ở cả môi trƣờng có độ
axit thấp dƣới mức chuẩn của nhiều loài. pH tối ƣu cho loài nấm này phát triển là
khoảng 4 - 6,5. Độ ẩm tối thiểu cần thiết cho sinh trƣởng của A. niger là 23%. Nấm
mốc A. niger không cần ánh sáng cho sự sinh trƣởng và phát triển [23].
1.3.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. niger
Kích thƣớc hệ gen của các chủng A. niger dao động trong khoảng 33,9 đến
38,5 Mb với khoảng 13000 gen, trong đó 6000 - 8000 gen hoạt động [24]. Năm
2007, trình tự hệ gen của A. niger chủng CBS 513.88 đã đƣợc công bố. Theo đó,
kích thƣớc hệ gen của CBS 513.88 là 33,9 Mb, với 14165 khung đọc mở trong đó
có 55% gen tham gia mã hóa cho các sản phẩm protein. Trong số 14165 khung đọc
mở có 3002 trình tự mã hóa cho các sản phẩm liên quan đến chuyển hóa. Dữ liệu
này cho thấy A. niger là một nhà máy đầy tiềm năng cho các ngành công nghiệp
sinh học [82].
1.3.3. Vai trò của nấm sợi A. niger
Nấm sợi A. niger giữ vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm,
đặc biệt là công nghệ lên men [23]. Nó đƣợc đánh giá là vi sinh vật tiềm năng trong
sản xuất amylase. Amylase là một enzyme phổ biến chiếm 25 - 35% lƣợng enzyme
thƣơng mại trên thị trƣờng đƣợc sử dụng cho quá trình thủy phân tinh bột trong sản
xuất bánh mì, bia và trong việc loại bỏ keo từ vải. Có nhiều nguồn cung cấp enzyme
này nhƣ động vật, thực vật và vi sinh vật nhƣng amylase có nguồn gốc từ nấm
đƣợc ƣa chuộng hơn cả do có khả năng hoạt động ở môi trƣờng pH thấp. Ngoài ra,
A. niger còn có khả năng sản xuất invertase xúc tác sự thủy phân của sucrose tạo
thành glucose và fructose, pectinase đƣợc ứng dụng trong tiền xử lý các loại nƣớc
ép trái cây để loại bỏ cặn cũng nhƣ làm giảm vẩn đục trong rƣợu vang, α-

12