ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ TRÀ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG ARTEMISININ
TRÊN GEN K13 CỦA Plasmodium falciparum TẠI VÙNG SỐT RÉT
LƢU HÀNH NẶNG TỈNH BÌNH PHƢỚC, NĂM 2014 – 2015

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ TRÀ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG ARTEMISININ
TRÊN GEN K13 CỦA Plasmodium falciparum TẠI VÙNG SỐT RÉT
LƢU HÀNH NẶNG TỈNH BÌNH PHƢỚC, NĂM 2014 – 2015

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Độc vật học
Mã số: 60 42 01 03
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Trƣơng Văn Hạnh

tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện Sốt rét-KST-CTTƢ đã tạo
điều kiện thuận lợi, ủng hộ tôi về thời gian, vật chất và tinh thần trong quá
trình thực hiện Luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô, cán bộ Phòng Đào tạo Sau đại
học, Ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Trƣờng Đại học
Thái Nguyên đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại Trƣờng.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nghiên cứu Khoa Sinh học
phân tử và cán bộ các Khoa/Phòng của Viện Sốt rét-KST-CTTƢ, đã giúp đỡ,
ủng hộ và động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Với lòng biết ơn sâu nặng, cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn bên tôi.

Nguyễn Thị Trà

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ii


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU

1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1.


10

1.3.2. Cấu trúc gen K13 của P. falciparum

12

1.4.

Các nghiên cứu về đa hình đột biến gen K13 trên thế giới và Việt
Nam

1.5.

Các phƣơng pháp nghiên cứu ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc

14
20

1.5.1. Phƣơng pháp in vivo

20

1.5.2. Phƣơng pháp in vitro

22

1.5.3. Phƣơng pháp phân tử

22

25

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

iii


2.2.1. Thiết bị

25

2.2.2. Dụng cụ

25

2.2.3. Hóa chất

26

2.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu

27

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu

27

2.3.2. Phƣơng pháp chọn mẫu và cỡ mẫu


Xử lý số liệu nghiên cứu

34

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.

Kết quả xác định các đột biến gen K13 của P. falciparum phân lập từ
bệnh nhân sốt rét tại Bình Phƣớc

3.1.1. Kết quả xác định loài ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật PCR lồng

35
35
35

3.1.2. Kết quả xác định kiểu gen của P. falciparum bằng kỹ thuật PCR lồng 35
3.1.3. Kết quả phân tích đột biến gen K13 bằng kỹ thuật giải trình tự 37
ADN
3.2.

Đánh giá mối tƣơng quan giữa đột biến gen K13 với kết quả theo dõi 47
ký sinh trùng sốt rét trên bệnh nhân ngày D3

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN

50

KẾT LUẬN

ADN

Acid deoxyribonucleic

Bp

Base pair

DHA-PPQ

Dihydroartemisinine-piperaquine

dNTPs

Deoxynucleotide triphosphate

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

Thuốc sốt rét phối hợp với
Artemisinin

Cặp bazơ ni tơ

KST

Ký sinh trùng

KSTSR


v


DANH MỤC BẢNG
Trang

Bảng 1.1. Mƣời tỉnh có tỷ lệ ký sinh trùng sốt rét lƣu hành cao năm 2014 ....... 4
Bảng 1.2. Thời gian KSTSR P. falciparum kháng với các loại thuốc sốt rét ..... 7
Bảng 1.3. Danh sách các vị trí đột biến gen K13 xác định kháng hoặc liên
quan kháng artemisinin theo WHO 2015 ............................................................ 20
Bảng 3.1. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm đơn và nhiễm phối hợp kiểu gen ở các
mẫu nhiễm P. falciparum ngày D0 và D3 theo locus gen msp2 ......................... 36
Bảng 3.2. So sánh tỷ lệ đột biến gen K13 giữa 2 nhóm mẫu bệnh nhân ngày
D0 và ngày D3..................................................................................................... 44
Bảng 3.3. Tần suất của các vị trí đột biến gen K13 ở nhóm mẫu có đột biến .... 46
Bảng 3.4. Kết quả xác định đột biến gen K13 ở nhóm ký sinh trùng sốt rét
ngày D3 và D0..................................................................................................... 48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

vi


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Bản đồ các quốc gia và vùng lãnh thổ có lan truyền sốt rét .............. 3
Hình 1.2. Cấu trúc protein K13 của P. falciparum ............................................. 12
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc 3D protein K13 của P. falciparum ......................... 13
Hình 1.4. Đọc trình tự nucleotit theo phƣơng pháp Sanger ................................ 24

ngƣời, bệnh phổ biến tại nhiều quốc gia, đặc biệt ở các nƣớc nghèo, các nƣớc
đang phát triển.Theo báo cáo năm 2014 của Tổ chức Y tế thế giới(WHO),
hiện có 97 quốc gia và vùng lãnh thổ có sốt rét lƣu hành với khoảng 3,3 tỉ
ngƣời sống trong vùng có nguy cơ mắc sốt rét, trong đó khoảng 1,2 tỉ ngƣời
có nguy cơ mắcsốt rét cao [52]. Tại Việt Nam, năm 2014 có 27.868 trƣờng
hơ ̣p mắc sốt rét, 06 ca tử vong do sốt rét. Sốt rét lƣu hành chủ yếu tại các
vùng biên giới thuộc khu vực Miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam Bộ
nơiđồng bào dân tộc ít ngƣời sinh sống với điều kiện kinh tế, xã hội còn nhiều
khó khăn[1].
Trên thế giới hiện có 5 loài KSTSR gây bệnh cho ngƣời là P.
falciparum, P. vivax,P. malariae, P. ovalevà P.knowlesi trong đó P.
falciparumlà loài phổ biến và gây tử vong cao nhất. Hơn nữa, khó khăn rất
lớn trong phòng chống và loại trừ sốt rét là do ký sinh trùng sốt rét (KSTSR)
kháng thuốc. Đến nay,đãghi nhậnkháng thuốc sốt rétở 3 loài làP. falciparum,
P. vivaxvà P. malariae, đặc biệt loài P. falciparumđã kháng với nhiều loại
thuốc sốt rét [52].
Artemisinin và dẫn xuất là thuốc có hiệu quả cao trong điều trị cho
bệnh nhân sốt rét nhiễm P. falciparum chƣa biến chứng, đƣợc sử dụng rộng
rãi ở nhiều quốc gia từ những năm 1990 nhƣng đã có những bằng chứng cho
thấy P. falciparum phát triển kháng thuốc sau hơn 10 năm đƣợc sử dụng rộng
rãi.Do vậy,từ năm 2001 WHO đã khuyến cáo các quốc gia sử dụng các thuốc
sốt rét phối phợp nhiều thành phần (ACTs – Artemisinine base Combination
Therapy) trong đó artemisinin đóng vai trò là thành phần quan trọng nhất
nhằm làm chậm lại tốc độ phát triển của KSTSR kháng thuốc[48].
Những nghiên cứu gần đây đã ghi nhận P. falciparum kháng với
artemisinin tại Cam-pu-chia, Mi-an-ma, Thái Lan và Việt Nam [31, 50]. Đây
là một vấn đề đáng báo động, đặc biệt nguy hiểm vì đến nay thế giới chƣa có
một loại thuốc SR mới nào có hiệu lực cao, an toàn hơn để thay thế.Chính vì
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình sốt rét trên thế giới và Việt Nam
Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), có 5 loài Plasmodium spp. gây
bệnh cho ngƣời trong đó gây bệnh nghiêm trọng và dẫn đến tử vong nhiều
nhất là do loàiP. falciparum, số còn lại do P. vivax, P. malariae, P. ovale và
P.knowlesi có thể gây bệnh nhẹ hơn và thƣờng ít dẫn đến tử vong. Bệnh đƣợc
lây truyền qua vết đốt của muỗi cái Anopheles nhiễm ký sinh trùng.
Số liệu thống kê của WHO năm 2014 cho thấy hiện có 97 quốc gia và
vùng lãnh thổ có sốt rét lƣu hành với khoảng 3,3 tỉ ngƣời có nguy cơ nhiễm
sốt rét, trong đó khoảng 1,2 tỉ ngƣời có nguy cơ nhiễm cao. Năm 2013, trên
toàn thế giới ghi nhận 198 triệu ca mắc sốt rét và 584 nghìn trƣờng hợp tử
vong do sốt rét, phần lớn số ca tử vong xảy ra tại Châu Phi với 528 nghìn
ngƣời, chiếm 90% trong đó trẻ em dƣới 5 tuổi chiếm 78%, tại khu vực Đông
Nam Á có khoảng 41 nghìn ngƣời chết chiếm khoảng 7%[52].

Hình 1.1. Bản đồ các quốc gia và vùng lãnh thổ có lan truyền sốt rét
(theo nguồn WHO, 2014)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3


Việt Nam nằm trong khu vực Tây Thái Bình Dƣơng là nơi có lƣu hành
sốt rét với tỷ lệ mắc cao. Theo thống kê của WHO, hiện có khoảng 712 triệu

SRLH

trùng

Ký sinh
trùng/1000dân
số chung

1.406.542

971.274

4.367

3,01

Ninh Thuận

588.280

234.170

1.033

1,76

3

Bình Phƣớc


1,07

6

Đắk Lắk

1.847.979

1.484.415

1913

1,04

7

Khánh Hòa

1.222.450

190.980

1.174

0,96

8

Kon Tum


0,61

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

4


1.2. Tình hình ký sinh trùng số t rét P. falciparumkháng thuốc trên thế
giới và Việt Nam
1.2.1. Tình hình kháng các thuốc sốt rét của P. falciparumtrên thế giới
Trong vòng vài thập kỷ gần đây, vấn đề KSTSR kháng thuốc đã trở
thành một trong những cản trở chính đối với chiến lƣợc phòng chống và loại
trừsốt rét trên toàn thế giới. Tình trạng kháng thuốc đã đƣợc ghi nhận đối với
3 trong số 5 loài KSTSR gây bệnh cho ngƣời là P. falciparum, P. vivax và P.
malariae[49]. Hiện nay P. falciparum đã kháng với hầu hết các thuốc sốt rét,
kể cả artemisinin và các liệu pháp kết hợp artemisinin (ACTs) chống kháng.
Kháng thuốc là rất phức tạp vì thực tế cho thấy KSTSR đã kháng chéo
giữa các thuốc có cùng thành phần hóa học hoặc có cùng cơ chế tác động. Đa
kháng thuốc xảy ra với P. falciparum khi mà ký sinh trùng này kháng với
nhiều loại thuốc khác nhau về thành phần hóa chất hoặc cơ chế tác động. Tốc
độ phát triển kháng và mức độ lan rộng kháng thuốc diễn biến phức tạp và có
sự khác nhau giữa các thuốc sốt rét.
Báo cáo tổng kết của WHO giai đoạn 2000 -2010 cho thấy đã có sự gia
tăng có ý nghĩa về mức độ kháng thuốc của KSTSR [49]. Trong đó:
Kháng quinin:
P. falciparum kháng thuốc quinin phát hiện đầu tiên tại Bra-xin từ
những năm 1908 - 1910. Đến những năm 1960 cũng đã ghi nhận kháng tại
khu vực Đông Nam Á. Theo kết quả của 9 nghiên cứu đánh giá hiệu lực điều
trị tại 6 quốc gia (giai đoạn 2002 đến 2007) cho thấy tỷ lệ thất bại điều trị cao
(>20%) tại 2 điểm nghiên cứu ở Bô-li-vi-a và Vê-nê-du-ê-la, tuy nhiên thuốc

Trong 162 nghiên cứu đánh giá hiệu lực điều trị của thuốc Fansidar
trong giai đoạn từ 2000 đến 2007 cho thấy tỷ lệ điều trị thất bại thấp (từ 4,7
đến 5%) tại một số quốc gia Nam Mỹ, Trung Đông và Trung Á. Tỷ lệ điều trị
thất bại trung bình tại khu vực Đông Phi là 52,8%, Tây Phi là 18,7%, vùng
Trung Phi là 23%, Nam Phi là 23,2%. Tại Lào và Việt Nam tỷ lệ thất bại


1948

1949

Bra-xin

Sulfadoxin-pyrimethamin

1964

1968

Thái Lan

Mefloquin

1972

1982

Thái Lan

Artemisin và dẫn xuất

1990

2006-2007

Cam-pu-chia

dihydroartemisinin-piperaquine còn ký sinh trùng ngày D3 vẫn tăng từ 26%
(2008) đến 45% (2010).
Tại Lào, nghiên cứu tại tỉnh Champasack cho thấy 22,2% bệnh nhân còn
KST ngày D3 với thuốc artemether-lumefantrine, đã xác định có đột biến K13
trong các quần thể ký sinh trùng.
Tại Mi-an-ma, kháng artemisinin đƣợc ghi nhận vào năm 2008. Các số
liệu nghiên cứu năm 2009 cho thấy kháng artemisinin đã xảy ra ở 5 vùng và
tiểu bang thuộc Đông Nam Mi-an-ma với cả 3 loại thuốc phối hợp đƣợc sử
dụng

là

artemether-lumefantrine,

artesunate-mefloquine

dihydroartemisinin-piperaquine.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

8

và


Tại Thái Lan, từ năm 2008 đã ghi nhận tỷ lệ thất bại điều trị với thuốc
artesunate-mefloquine ≥ 10%. Tỷ lệ thất bại điều trị cao đƣợc chứng minh do
có tỷ lệ kháng cao với thành phần mefloquine. Tuy vậy, đến 2012 với
artemether-lumefantrine đƣợc sử dụng thay thế đã xác định có 2 tỉnh có tỷ lệ
thất bại điều trị đạt khoảng 10%.
Tại Nam Mỹ, đã ghi nhận sự gia tăng tỷ lệ ký sinh trùng ngày D3 tại

rét. Tuy nhiên tỉ lệ tái phát cao và tăng nhanh khi điều trị thuốc đơn thuần.
Nghiên cứu sử dụng phác đồ điều trị artemisinin đơn thuần trên 1000 bệnh
nhân sốt rét do P. falciparum cho thấy tỉ lệ tái phát 12,2% với phác đồ điều trị
7 ngày, và 47% với phác đồ điều trị 3 ngày [9].
Tại tỉnh Bình Phƣớc, phác đồ đơn trị liệu với artesunate trong 5 hoặc 7
ngày đƣợc sử dụng tại Việt Nam đến năm 2009 đã cho thấy 87,5% và 88,9%
đáp ứng đầy đủ cả về lâm sàng và ký sinh trùng học (ACPR) tƣơng ứng năm
2008 và 2010. Tuy nhiên tỷ lệ dƣơng tính ký sinh trùng ở ngày thứ 3 (D3) có
xu hƣớng tăng từ 10% năm 2008 lên 18,2% năm 2010. Tỷ lệ này cũng quan
sát đƣợc ở tỉnh Đắk Nông là 16,3% năm 2010 [10, 11].
Năm 2009, phác đồ điều trịcho các trƣờng hợp sốt rét doP.
falciparumchƣa biến chứnglà thuốc sốt rét phối hợp dihydroarteminisinpiperaquine (DHA-PIP) trong 3 ngày đƣợc sử dụng [2]. Kết quả của nhiều
nghiên cứu theo dõi hiệu lực điều trị củaphác đồ này cho thấy kết quả điều trị
khỏi > 95%, tuy nhiên tỷ lệ dƣơng tính ký sinh trùng D3 vẫn còn >10% tại
một số tỉnh và có xu hƣớng ngày càng gia tăng; tại Bình Phƣớc năm 2009 là
15,3%, năm 2012 là 30,6%, và 36% năm 2014; tại Đắk Nông và Gia Lai lần
lƣợt là 29,2% và 22,8% năm 2012 [8]. Dƣơng tính ký sinh trùng D3 đƣợc coi
là dấu ấn nguy cơ của thất bại điều trị muộn.Nếu tỷ lệthất bại điều trị vƣợt quá
10% thì cần phải thay đổi trong chính sách sử dụng thuốc của chƣơng trình
phòng chống và loại trừ sốt rét quốc gia [47].
1.3.Đặc điểm gen K13 của P. falciparumliên quan đến kháng artemisinin
1.3.1. Cơ sở khoa học chọn K13 là chỉ thị phân tử kháng artemisinin
Năm 2013, Areiy và cộng sự đã thành công trong việc xác định gen
K13 là chỉ thị phân tử liên quan đến kháng artemisinin tại khu vực Đông Nam
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

10


Á. Để đƣa ra đƣợc kết quả này Ariey F. và CS đã chọn lọc dòng P.

Có sự mất liên tiếp những chủng KSTSR kiểu hoang dại ở phía
TâyCam-pu-chia suốt giai đoạn bắt đầu có sự kháng artemisinin;

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

11


-

Kiểu KSTSR đột biến tăng lên về tần số tại các vùng kháng thuốc của
Cam-pu-chia và xuất hiện rất ít ở những nơi kháng artemisinin là không
phổ biến;

-

Gen PF3D7_1343700 nằm trong vùng dấu hiệu ƣu tiên để chọn lọc;

-

Những đột biến đa dạng trên K13-propeller phản ánh chọn lọc dƣơng;

-

Những đột biến xảy ra trên vùng gen có tính bảo tồn cao của P.
falciparum, chỉ có một đột biến đa hình đơn nucleotide dạng SNPs
(single nucleotide polymorphism)đƣợc ghi nhận từ một phân lập ở châu
Phi;

-


tính

chất

bảo

tồn

đặc trƣng

loài Plasmodium spp.,
+ ·Một vùng BTB/POZ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

12

cho


+ Vùng phía đầu C với 6 vùng nhỏ hình cánh quạt điển hình cho motif
Kelch. Motif Kelch chứa protein đƣợc bảo tồn qua tiến hóa giữa các
loài khác nhau và nhóm lại thành loại protein KLHL.
Các dữ liệu phân tích protein cho thấy protein Kelch đƣợc sản sinh ở tất
cả giai đoạn phát triển của P. falciparum thể vô tính (thể nhẫn, tƣ dƣỡng, giao
bào và các merozoit) và thể hữu tính trong máu (thể giao bào). Đa hình các
điểm đột biến gen K13 ở vùng cánh quạt của protein K13 đƣợc chứng minh là
có liên quan chặt chẽ đến tỷ lệ sống sót của P.falciparum trong thử nghiệm in
vitro và tỷ lệ sạch ký sinh trùng trên in vivo ở bệnh nhân điều trị sốt rét do
P.falciparum với ACTs [19].

nghĩa và sự phân bố địa lý của chúng.
Quan trọng hơn, sự phân bố tần suất của alen đột biến tại các tỉnh khác
nhau cũng phù hợp với tỷ lệ tồn tại KSTSR ở ngày D3 ở bệnh nhân sau khi
đƣợc điều trị bệnh SR do P. falciparum với thuốc phối hợp ACTs. Hiện tƣợng
này đƣợc xem là chỉ điểm gợi ý cho kháng artemisinin trong điều trị lâm sàng.
Một nghiên cứu khác tại Cam-pu-chia của Pharath Lim và cộng sự
(2013) [34] cho biết trong khi P. falciparum đa kháng thuốc có mặt phổ biến
ở khu vực phía Tây và phía Bắc Cam-pu-chia, hiện không có bằng chứng nào
cho thấy có hiện tƣợng kháng piperaquin, điều này cũng xảy ra tƣơng tự ở
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

14