SVTH: Trần Thị Diệp

GVHD: Hoàng Thị Yến

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------------

--------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CƠ BẢN VÀ SỬ DỤNG KỸ
THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ PHÂN LOẠI ĐẾN LOÀI CỦA
CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP
ACID BÉO KHÔNG NO (DẠNG OMEGA 6,7,9)

Sinh viên thực hiện

: Trần Thị Diệp

Lớp

: 1302

Giáo viên hướng dẫn

: TS. Hoàng Thị Yến

Hà Nội – 2017



SVTH: Trần Thị Diệp

GVHD: Hoàng Thị Yến

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. 2
MỤC LỤC ................................................................................................................... 3
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................... 5
TÓM TẮT ................................................................................................................... 7
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... 9
DANH MỤC HÌNH..................................................................................................... 1
PHẦN 1: MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
1.1 Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu ....................................................................... 1
1.2 Mục đích ................................................................................................................ 3
1.3 Yêu cầu.................................................................................................................. 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 4
2.1 Giới thiệu về lipid và acid béo.............................................................................. 4
2.1.1 Giới thiệu về lipid .............................................................................................. 4
2.1.2 Giới thiệu về acid béo ......................................................................................... 5
2.2 Vi khuẩn tía quang hợp ........................................................................................ 11
2.2.1. Định nghĩa ....................................................................................................... 11
2.2.2 Phân loại về vi khuẩn tía quang hợp ................................................................ 12
2.2.3 Đặc điểm sinh học VKTQH ............................................................................... 13
3.1 Vật liệu ............................................................................................................... 26
3.1.1 Hóa chất ......................................................................................................... 26
3.1.2. Thiết bị máy móc. ............................................................................................. 26
3.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................................... 27
3.2. Các môi trường nghiên cứu ................................................................................. 27
3.3 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 28

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................... 49
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 49
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 50
PHỤ LỤC .................................................................................................................. 55


SVTH: Trần Thị Diệp

GVHD: Hoàng Thị Yến

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AGL

Axit linolenic-γ

ATP

Adenosine triphosphate

ARN

Ribonucleic acid

C18:1

Oleic

Bchl


EPA

Eicosa Pentaenoic Acid

GS

Glutamine synthetase

ICL

Isocitrate lyase

KDG

2-keto-3-deoxygluconate

MUFAs

Monounsaturated fatty acids

OAA

Oxaloaxetic

PCR

Polymerase chain reaction

PEP


GVHD: Hoàng Thị Yến

TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng chủng VKTQH được lấy từ
tập đoàn chủng giống VKTQH của Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ
gen thuộc Viện Công nghệ sinh học. Chủng VKTQH lựa chọn (ký hiệu VTB.8)
có khả năng sinh trưởng mạnh (tính theo ∆OD660: 1.534 ± 0.012; hàm lượng sinh
khối khô: 0.821 ± 0.075), chứa hàm lượng lipid cao: 27.88 ± 3.227 % trọng
lượng khô và đặc biệt có khả năng tổng hợp omega 6,7,9.
Qua nghiên cứu các đặc điểm sinh học cơ bản, chúng tôi đã xác định được
khuẩn lạc của chủng VTB.8 có hình dạng tròn, lồi, bề mặt xù xì, màu nâu đỏ,
đường kính d = 1,5- 2 mm. Tế bào của chủng này có hình bầu dục, đường kính
0,7- 1,8 µm, là vi khuẩn gram (-), chứa bacteriochlorophyll a (Bchl a). Chủng
VK nghiên cứu có khả năng sinh trưởng tốt trong khoảng pH từ 5,5 – 6,5 (tối ưu
tại pH = 5,5), sinh trưởng ở nồng độ muối (NaCl) từ 0-5% (tối ưu trong khoảng
nồng độ từ 0,5 – 2,5%) và sinh trưởng tốt trong điều kiện kỵ khí - sáng. Khi
nghiên cứu khả năng sử dụng các nguồn carbon và nitơ cho sinh trưởng, chủng
VK này có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon và nitơ. Sinh trưởng tối ưu
trên môi trường chứa nguồn carbon: glucose, acetate, succinate, và nguồn nitơ
như: L. glutamine, alanine, threonine, NH4Cl.
Sử

dụng

cặp

mồi:

forward



GVHD: Hoàng Thị Yến

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. So sánh hấp thụ cực đại của hai dạng bacteriochlorophyll a và b ở
VKTQH (trong tế bào nguyên và trong dịch chiết ete) ..................................... 15
Bảng 2.2. Các nhóm carotenoid có mặt trong tế bào VKTQH .......................... 17
Bảng 4.1. Khả năng sinh trưởng, tích lũy sinh khối, lipid và tổng hợp acid béo
không no của chủng VK VTB.8 ....................................................................... 35
Bảng 4.2 Mức độ tích lũy thu sinh khối (OD660) của chủng VTB.8 .................. 37
Bảng 4.3 Khả năng sinh trưởng trên các nguồn carbon và nitơ khác nhau của
chủng VKTQH VTB.8 ..................................................................................... 41
Bảng 4.4 Kêt quả ∆OD660 sau 5 ngày nuôi cấy của chủng VKTQH VTB.8 trên
môi trường DSMZ-27 ...................................................................................... 42
Bảng 4.5 Kết quả ∆OD660 sau 4 ngày nuôi cấy của chủng VKTQH VTB.8 trên
môi trường DSMZ-27 tại pH ban đầu khác nhau .............................................. 44


DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Hình dạng tế bào của một số đại diện VKTQH không lưu huỳnh ..... 14
Hình 2.2. Cấu tạo hóa học của vòng porphyry.................................................. 16
Hình 2.3. Cấu trúc của một số Carotenoid có trong VKTQH ........................... 17
Hình 2.4. Sơ đồ cấu tạo của một dạng chromotophor ở VKTQH ..................... 18
Hình 2.5 Sơ đồ định vị của các thành phần bộ máy quang hợp sơ cấp ở VKTQH
......................................................................................................................... 18
Hình 2.6. Mạch truyền điện tử ở tảo và vi khuẩn bậc cao và VKTQH ............. 19
Hình 2.7. Chuỗi truyền điện tử ở cả hệ thống hô hấp và quang hợp của VKTQH
......................................................................................................................... 24

omega 6,7,9 như: Sea Buckthorn Oil blend Omega 7 (Mỹ), Sibu seven Omega 7
(Mỹ), Terry Naturally Omega 7 (Mỹ),…Trong các sản phẩm kể trên, các sản
phẩm có chứa acid béo không no dạng omega - 7 chủ yếu được sản xuất từ hạt
macadamia và cây hắc mai biển.
Ở Việt Nam, hiện nay thực phẩm chức năng có chứa omega 3,6,7,9 hầu
như đều là các sản phẩm nhập ngoại. Tuy nhiên, cũng đã có một số sản phẩm
được nghiên cứu và sản xuất trong nước ở quy mô thương mại như: sản phẩm
STIPIPINE của dự án sản xuất thử nghiệm “Hoàn thiện công nghệ và sản xuất
thực nghiệm hỗn hợp omega 3 và omega 6 từ nhân hạt hồ đào”. Kết quả của
dự án đã ép được 20 tấn nhân hạt hồ đào; thu được 8.033,6 kg hỗn hợp acid béo
omega 3,6 và sản xuất được 1.000.000 viên nang mềm STIPIPINE đạt tiêu
chuẩn chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm. Sản phẩm STIPIPINE có tác

1


dụng giúp hỗ trợ giảm chlesterol và triglyxerit, hỗ trợ giảm rối loạn chuyển hóa
lipit; sản phẩm Algal Oil Omega 3-6 do công ty Cổ phần Dược phẩm Quốc tế
ABIPHA sản xuất và phân phối. Sản phẩm này đã được nghiên cứu bởi Viện
Công Nghệ Sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa và Công nghệ Việt Nam. Cả 2 sản
phẩm nêu trên đều thuộc Đề án Phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh học
trong lĩnh vực công nghệ chế biến đến năm 2020 do Bộ Công thương là cơ quan
chủ trì .().
Các sản phẩm thực phẩm chức năng ở Việt Nam nêu trên đều là các sản
phẩm chứa các acid béo không no (dạng omega 3,6,9) mà chưa có sản phẩm nào
chứa acid béo không no (dạng omega 7) và hầu hết các sản phẩm đều được chiết
xuất từ thực vật, cá biển, tảo biển. Omega 7 rất khan hiếm ở cả giới động vật
cũng như thực vật, chúng được chiết suất chủ yếu từ cây hắc mai biển và dầu
macadamia [44 ]. Tuy nhiên, khi nghiên cứu về nhóm vi khuẩn tía quang hợp
(VKTQH) không lưu huỳnh có khả năng tổng hợp lipid cao và có chứa acid béo


Đường cong sinh trưởng

•

Đặc điểm hệ sắc tố quang hợp

•

Ảnh hưởng của oxy

•

Đặc điểm dinh dưỡng cacbon và nitơ

•

Ảnh hưởng của nồng độ muối cho sinh trưởng

•

Ảnh hưởng của pH ban đầu

- Xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn nghiên cứu

3


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU


bên ngoài đã được hấp thu không truyền dẫn vào bên trong cơ thể, có tác dụng
cách nhiệt.
Lipid phân bố không đều trong cơ thể người với tổng hàm lượng khoảng
10%. Lượng chất béo chủ yếu tập trung ở các tổ chức dưới da tạo thành lượng
mỡ dự trữ để cơ thể sử dụng khi cần thiết. Một phần chất béo còn bao quanh phủ
tạng như là tổ chức bảo vệ, để ngăn ngừa các va chạm và giúp chúng ở vị trí
đúng đắn. Nó còn giúp cơ thể tránh khỏi các tác động bất lợi của môi trường
ngoài như nóng, lạnh. Người gầy thì lớp mỡ dưới da mỏng, do vậy mà cơ thể
kém chịu đựng với sự thay đổi của thời tiết.
• Thúc đẩy việc hấp thu các vitamin tan trong chất béo
Vitamin A, D, E, K không tan trong nước mà tan trong chất béo hoặc
dung môi. Lipid có trong thức ăn sẽ làm dung môi để thúc đẩy sự hấp thu chúng.
Nếu hàm lượng lipid trong bữa ăn thấp thì sẽ ảnh hưởng đến việc hấp thu
caroten trong rau xanh (trong cơ thể caroten chuyển thành vitamin A).
•

Làm tăng cảm giác no bụng
Lipid ngừng ở dạ dày với thời gian tương đối lâu, cho nên khi ăn những

thức ăn có hàm lượng lipid cao sẽ lâu bị đói.
• Nâng cao giá trị cảm quan của thức ăn
Thức ăn có nhiều chất béo sẽ có mùi thơm và ngon, do vậy làm tăng sự
thèm ăn.
2.1.2 Giới thiệu về acid béo
2.1.2.1 Định nghĩa

5


Acid béo là thành phần chính của hầu hết các lipid. Acid béo là những

hòa là nhóm acid béo trong phân tử có chứa ít nhất một liên kết đôi. Các acid
béo không no (không bão hòa) đơn nối đôi (Monounsaturated fatty acidsMUFAs) và đa nối đôi (Polyunsaturated fatty acids- PUFAs) đã được quan tâm
nghiên cứu và ứng dụng trong dinh dưỡng và dược phẩm. Cơ thể không thể tự
tổng hợp được các chất này mà phải lấy từ thức ăn bên ngoài nên chúng được
gọi là các acid béo không thay thế.
MUFAs và PUFAs có 3 vai trò sinh học chủ yếu. Đầu tiên là tham gia vào
sự điều hòa trao đổi lipid, vận chuyển và hướng tới các mô. Thứ 2 là tham gia
vào thành phần cấu trúc nên thành tế bào. Các PUFAs được chia làm 2 nhóm
chính là omega 3 và omega 6 (Sijtsma và de Swaaf, 2004). Ngoài ra còn có
omega 9. Tên gọi của omega dựa vào liên kết đôi đầu tiên tại vị trí carbon.
Các axit béo omega 6 và omega 9 thuộc họ các axit béo không no đa nối
đôi
2.1.2.3 Vai trò của Omega 6,7,9 đối với sức khỏe con người
Trong khoảng ba thập kỉ gần đây, các axit béo không no (MUFAs và
PUFAs) đã được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm bởi vai trò to lớn mà chúng
mang lại. Con người và động vật hầu như không tự tổng hợp đươc omega 6,7,9
mà chủ yếu cung cấp từ nguồn thức ăn.
Tác dụng của omega 6 (www.viendinhduong.vn).
Bệnh thần kinh và đái tháo đường: một số nghiên cứu cho thấy
uống axit linolenic gamma (AGL) trong 6 tháng trở lên có thể làm giảm triệu
chứng đau dây thần kinh ở những người bị bệnh thần kinh đái tháo đường.
Ung thư vú: AGL ức chế hoạt động của khối u trong các dòng tế
bào ung thư vú.

7


Cao huyết áp: AGL giúp giảm huyết áp cao.
Loãng xương: thiếu omega 6 có khả năng gây loãng xương. Nghiên
cứu cho thấy, phụ nữ trên 65 tuổi bị loãng xương bổ sung omega 6 đã ít loãng

và omega -6 nằm giữa 5:1 và 3:1 là tối ưu cho người (Simopoulos, 2008; Gupta
và cs, 2012).
2.1.2.3 Các nguồn cung cấp Omega 6,7,9
Nguồn cung cấp các axit béo omega trong tự nhiên rất phong phú và đa
dạng, nhiều nghiên cứu về tách chiết các acid béo có nguồn gốc động vật, thực
vật và đặc biệt là vi sinh vật đã được các nhà khoa học quan tâm trong vài năm
trở lại đây.
Từ động, thực vật:
Nguồn cung cấp omega 6 trong tự nhiên khá phong phú, chúng được tìm
thấy trong hầu hết các loại dầu thực vật như: dầu bắp, dầu hạt bông vải, dầu hạt
nho, dầu mè, dầu đậu nành, dầu hoa hướng dương, dầu hoa anh thảo, dầu lý
chua đen. Omega 6 còn được tìm thấy trong các loại gia cầm, trứng gà, trong
mỡ, trong bơ, lúa mì cứng, ngũ cốc nguyên hạt, bánh mỳ và đặc biệt từ tảo xoắn
Spirunila platensis (Chamorro và cs., 2002).
Không giống như các omega khác, nguồn cung cấp omega 7 rất hiếm
trong cả giới thực vật và động vật. Chúng được cung cấp từ dầu cá (các loại cá
nước lạnh như cá hồi, cá ngừ, cá mòi, cá thu), một số loại dầu động vật và thực
vật như dầu macadamia và chủ yếu là cây hắc mai biển và một lượng nhỏ trong
quả

bơ

( />
Against Metabolic-Syndrome0). Hai acid béo omega 7 thường gặp trong tự
nhiên là acid palmitoleic và acid vaccenic được phát hiện năm 1928 trong mỡ
động vật và quả bơ.

9



10


chi: Rhodovulum (R.strictum, R.sulfidophilum, R.euryhalinum, R. tesquicola);
Rhodobacter marinus; Rhodopseudomonas palustris; Rhodobacter viridis,7,9).
Gần đây, VKTQH cũng đã được các nhà khoa học chứng minh là có khả
năng tổng hợp được các axit béo mà đặc biệt là axit béo không no (0mega 6,7,9)
với hàm lượng rất cao chiếm 65 – 82% tổng axit béo. Các loài có khả năng tổng
hợp axit béo không no điển hình thuộc các chi: Rhodovulum (R. strictum, R.
sulfidophilum, R. adriaticum, R. euryhalinum, R. tesquicola, Rhodobacter
marinus, Rhdopseudomonas palustris, Rhodobacter viridis).
Một trong những ví dụ điển hình như Hiraishi và Ueda (1995) đã phân
lập được một số loài VKTQH thuộc chi Rhodovulum ở vùng biển xuất hiện thủy
triều đỏ ở Nhật Bản. Các loài VKTQH không lưu huỳnh này có khả năng tổng
hợp được omega 7 (C18:1ω7) với hàm lượng rất cao từ 60-80% tổng axit béo,
mặc dù C16:0 chỉ đạt 4-12% và 4 chủng VKTQH thuộc chi Rhodobacter từ bùn
thải của một con sông ở Ấn Độ. Bốn chủng vi khuẩn này đều có hàm lượng
omega 7 rất cao chiếm từ 61,2-79,8% của tổng axit béo (Raj,2013). Kim và cộng
sự (2012) đã tiến hành nghiên cứu sản xuất sinh khối VKTQH với mục đích sử
dụng sinh khối để tách chiết axit béo omega 7. Ông đã tiến hành nghiên cứu
công nghệ sản xuất sinh khối loài VKTQH này ở điều kiện nuôi liên tục, có
khuấy đảo, sử lactate làm nguồn carbon và có bổ sung một số nguồn nitơ. Sau 4
ngày nuôi cấy thu được 16,2g sinh khối tươi/lít, axit béo là 665mg FA/L/ngày,
hàm lượng lipit đạt 35% trọng lượng khô và chứa axit vaccenic chiếm 60% tổng
axit béo.
2.2 Vi khuẩn tía quang hợp
2.2.1. Định nghĩa
Vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH) là nhóm vi sinh vật tiền nhân có khả
năng tiến hành quang hợp nhưng không thải oxy như vi khuẩn lam Khi được
chiếu sáng, rất nhiều loài trong nhóm này có khả năng sinh trưởng quang tự


họ

Chromatiaceae

và

Ectothiorhodospiracea.
Theo hệ thống phân loại mới VKQHT không lưu huỳnh nằm trong nhóm
“Alphaproteobacteria” và “Betaproteobacteria”. Trong khi đó, VKTQH lưu
huỳnh lại nằm trong nhóm “Gammaproteobacteria”
12


2.2.3 Đặc điểm sinh học VKTQH
2.2.3.1 Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn tía quang hợp là các tế bào gram âm, đơn bào và có các dạng
cầu, xoắn, gậy, phẩy. Cũng có thể gặp chúng ở trạng thái chuỗi điều kiện môi
trường đặc biệt. Kích thước của tế bào thường từ 0,3 - 6 µm. Đa số các loài đều
sinh sản bằng nhân đôi, một số loài có tế bào dinh dưỡng dạng phân cực thường
sinh sản bằng cách nảy chồi.
Khi sinh trưởng trong điều kiện quang hợp, dịch huyền phù tế bào thường
có màu tím tía, đỏ, nâu vàng, nâu. Sự khác nhau về màu sắc này là do khả năng
hấp thụ ánh sáng khác nhau ở các bước sóng khác nhau và được thể hiện trên
phổ hấp thụ. Khi sinh trưởng trong điều kiện có ánh sáng và có mặt các hợp
trong những chất khử của lưu huỳnh thì các tế bào vi khuẩn tía lưu huỳnh tích
lũy nguyên tố lưu huỳnh trong tế bào ở dạng giọt còn ở các tế bào vi khuẩn tía
không lưu huỳnh thì không có hiện tượng này. Đây chính là đặc điểm hình thái
quan trọng làm cơ sở ban đầu để tách biệt hai nhóm vi khuẩn tía nêu trên
(Hình 2).

khử của lưu huỳnh, hydro phân tử hoặc các hợp chất hữu cơ đơn giản làm chất
cho điện tử và do đó không thải oxy.
Phương trình tổng quát của phản ứng quang hợp được viết như sau:
CO2 + 2H2A ----hv--->

(CH2O)n + 2A + H2O

Ở tảo và thực vật bậc cao H2A chính là H2O còn ở vi khuẩn quang hợp
H2A có thể là chất hữu cơ đơn giản, các hợp chất khử của lưu huỳnh hoặc hydro
phân tử. Riêng các chất hữu cơ vừa đóng vai trò làm chất cho điện tử vừa có thể
làm nguồn carbon cho sinh trưởng của tế bào.

14


- Sắc tố quang hợp ở VKTQH:
Sắc tố quang hợp có chức năng hấp thu ánh sáng cho quang hợp. Sắc tố
quang hợp ở VKTQH là bacteriochlorophyll và carotenoid.
+ Bacteriochlorophyll (Bchl)
Sắc tố quang hợp xảy ra trong quá trình quang hợp của vi khuẩn tía quang
hợp được phát hiện năm 1932. Chúng liên quan đến chlorophyll là sắc tố chính
trong tảo và vi khuẩn lam, có khả năng quang hợp nhưng không tạo ra oxi. Hiện
nay bacteriochlorophyll được chia thành 6 nhóm a, b, c, d, e, g dựa vào cấu trúc
phân tử và cơ chế tối đa hấp thụ tia hồng ngoại (nm). Trong đó, trong tế bào
VKTQH chứa hai loại Bchl thuộc nhóm a và b, đây là đặc điểm để phân biệt sự
khác nhau giữa VKTQH với các loại vi khuẩn quang hợp khác (Bảng 2.2).
Bảng 2.1. So sánh hấp thụ cực đại của hai dạng bacteriochlorophyll a và b ở VKTQH
(trong tế bào nguyên và trong dịch chiết ete)
Dạng