-1ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
ĐẠI HỌC KHOA HỌC

Nguyễn Ngọc Mai

“Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao
sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá
tính chất của enzyme này”.

Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-2-

MỞ ĐẦU
Chitin phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, là polysaccharide phổ biến thứ hai
sau cellulose. Nó là một chuỗi polymer chứa các đơn phân là N-acetylglucosamine
đƣợc liên kết bởi liên kết β-1,4-glucoside, có trọng lƣợng phân tử cao, không hòa
tan trong nƣớc và các dung môi hữu cơ khác. Chitin là thành phần cấu trúc chính
trong vỏ và lớp biểu bì của động vật chân đốt, giáp xác, các loài côn trùng và trong
thành tế bào của nấm.
Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân, phân cắt chitin thành các sản phẩm
khác nhau nhƣ N-acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose. Chitinase có trong
nhiều loại cơ thể sống khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật không xƣơng
sống, thực vật và động vật có xƣơng sống. Chitinase đƣợc ứng dụng nhiều trong
các ngành nông nghiệp nhƣ là một tác nhân nhằm kiểm soát nấm gây bệnh thực
vật, kiểm soát côn trùng. Trong y dƣợc, chitinase có giá trị trong phòng trừ dịch
bệnh, tổng hợp chitooligosaccharide hoạt hóa… Hiện nay, ngƣời ta đã nghiên cứu
tách chiết chitinase phân giải chitin từ các nguồn khác nhau nhƣ vi khuẩn, nấm,

- Gây đột biến chủng nấm lecanicillium lecanii bằng cách sử dụng hóa chất
gây đột biến NTG (N–methyl–N'–nitron–nitrosoguanidine) và tia UV (tia cực tím).
- Sàng lọc các chủng nấm kí sinh côn trùng có hoạt tính chitinase cao nhất.
- Tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí
sinh côn trùng đột biến sàng lọc.
- Xác định tính chất chitinase.

Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-4-

Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITINASE
1.1.1. Giới thiệu về chitinase
Chitinase [poly-β-1,4-(2-acetalmido-2-deoxy)-D-glucoside glucanohydrolase]
thuộc nhóm glycosyl hydrolase, là enzyme thùy phân chitin thành các đơn phân là
chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết β-1,4-glucoside
giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin.
Kí hiệu của chitinase là EC3.2.1.14
Trong đó: 3

→ Hydrolase

2

→ Glycosylase



-5Cơ chất của chitinase là chitin và một số dẫn xuất của nó.
Chitin [111]
Chitin [(C8H13O5N)n] là một trong những dạng
polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, đƣợc tạo
thành bởi các đơn phân là N-acetylglucosamine liên
kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside. Về mặt
cấu trúc , chitin có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cellulose,
điểm khác biệt duy nhất là nhóm acetamido ở vị trí
số 2 trên khung carbon của chitin đƣợc thay bằng
nhóm hdroxyl (-OH) ở cellulose [71].

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học
của chitinase

Chitin có hoạt tính hóa học thấp, màu trắng, cứng và có chứa nitrogen. Nó
không hòa tan trong nƣớc, kiềm loãng hay đặc, rƣợu và hầu hết các dung môi hữu
cơ thông thƣờng. Nó tan axit vô cơ đặc (HCl, H2SO4, H3PO4…) và một số dung
môi khác (hexafluro isopropanol, hexafluro acetone…) [69], [94].
Một số động vật không xƣơng sống nhƣ côn trùng, huyễn thể, giáp xác và
giun tròn, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của lớp vỏ. Ở động vật thủy
sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực, hàm lƣợng chitin chiếm khá cao
từ 14 – 35% so với trọng lƣợng khô [10]. Trong giới thực vật, chitin có ở thành tế
bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae [85].
Các dẫn xuất của chitinase
Chitinase có thể thủy phân một số dẫn xuất của chitin nhƣ glycol-chitin,
carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfat, 4-methylumbellferyl-tri N-acetyl
chititrioside (MUC – phát huỳnh quang) [33], [60] và không thủy phân một số cơ
chất: chitin nitrat, cellulose, hyaluronic acid, alginic acid hoặc mucin.




-7-

Họ Glycohydrolase 18:
Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, đƣợc tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc
Eukaryote, Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là chitinase, ngoài ra còn
có chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase.
Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8
xoắn α/β cuộn tròn, hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các
đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β-anomer [43]. Chúng thủy phân các
liên kết GlcNAc – GlcNAc, GlcNAc – GlcN bằng cơ chế giữ nguyên cấu hình
anomeric. Hoạt tính của các chitinase thuộc họ 18 bị ức chế bởi allosamidin [53].
Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 bao gồm những chitinase từ thực
vật (Arabidosis, dƣa leo, cây họ đậu, thuốc lá…), nấm (Aphanocladium, Rhizopus,
Saccharomyces…), vi khuẩn (Alteromonas, Bacillus, Serratia, Streptomyces…),
virus và động vật [53].
Họ Glycohydrolase 19:
Họ này gồm hơn 130 chi, thƣờng thấy chủ yếu ở thực vật nhƣ cà chua
(Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum sativum)…
ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus
influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông
qua cơ chế nghịch chuyển.
Họ Glycohydrolase 20
Họ

Glycohydrolase

20


Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II
Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41 –
47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tƣơng tự nhƣ chitinase nhóm I,
phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhƣng kích thƣớc phân tử nhỏ hơn đáng kể so
với chitinase nhóm I.

Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-9Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, ngƣời ta nhận thấy vùng gắn
chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở
thực vật bậc cao.
1.1.3. Nguồn thu nhận chitinase
Chitinase hiện diện ở hầu hết các giới sinh vật bao gồm vi sinh vật, thực vật
và động vật [37], [60], [94].
 Chitinase vi khuẩn
Chitinase đƣợc tìm thấy ở Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas,
Clostridium, Vibrio, Bacillus và đặc biệt ở nhóm Streptomycetes. Vi khuẩn tổng
hợp chitinase để phân giải chitin trong môi trƣờng nhằm sử dụng nguồn cacbon cho
sự sinh trƣởng và phát triển.
Chitinase ở vi khuẩn có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng. Tuy
nhiên trong các môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật. ngƣời ta đều cho thêm chitin nhƣ
nguồn cơ chất kích thích làm tăng khả năng tổng hợp chitinase, đồng thời ổn định
hoạt tính chitinase sau quá trình tách chiết.
 Chitinase nấm
Các loài nấm sợi cũng có khả năng tạo ra chitinase. Các chủng nấm mốc cho
chitinase cao nhƣ Trichoderma, Aspergillus, Gliocladium, Calvatia ... và đặc biệt ở
các nấm lớn nhƣ Lycoperdon, Coprinus ...

trình biến thái hay lột xác [33].
1.2. NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHITINASE
1.2.1. Sơ lƣợc nghiên cứu về chitinase
 Nghiên cứu trên thế giới
So với các enzyme nhƣ protease, amylase… thì chitinase đƣợc nghiên cứu
chậm hơn. Chitinase lần đầu đầu tiên đƣợc mô tả bởi Bernad (1911) về ảnh hƣởng
Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-11của nhiệt độ đến chitinase và khả năng kháng nấm ở cây hoa phong lan [7]. Đối với
vi sinh vật, đối tƣợng đƣợc nghiên cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn
Streptomyces nhằm thu nhận chitinase ứng dụng trong việc phá vỡ vách tế bào nấm
[23], [42]. Năm 1987, Mark O'Brien và Rita R. Colwell đã tiến hành xác định hoạt
tính chitinase của 101 chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ các nguồn môi trƣờng khác
nhau bằng cách kiểm tra tại chỗ trên giấy lọc với 4-methylumbellifety-N-acetyl-Dglucosamine [84]. Henrissat (1991) dựa trên sự tƣơng đồng về trình tự amino acid ở
vùng xúc tác đã phân loại nhóm protein glycosyl hydrolases thành hơn 50 họ trong
đó chitinase đƣợc chia thành hai họ 18 và 19 [52]. Năm 1993, Henrissat và Bairoch
phân loại thêm những enzyme từ các loài Flavobacterium, endo-Nacetylglucosaminidase. Hai họ này chứa cả endochitinase và exochitinase [53].
Những năm gần đây, một số nghiên cứu trên chitinase từ nấm ký sinh côn
trùng. Năm 1998, Kang và cộng sự (cs) đã tinh sạch và xác định các đặc tính của
chitinase trên nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae [62]. Năm 2002,
Tikhonov và cs tiến hành tinh sạch và xác định đặc tính chitinase từ 2 chủng nấm
Verticillium chlamydosporium và V. Suchlasporium [100]. Năm 2003, LI và cs
nghiên cứu việc tăng hoạt tính của β-1,3-glucanse và chitinase trong mô sẹo trên
cây bông bằng salicylic acid và sự tác động của độc tính nấm Verticillium dahliae
[74]. Năm 2005, Duo-Chuan và cs đã tinh sạch và xác định tính chất của chitinase
từ Talaromyces flavus. Laura và cs (2006) tiến hành nghiên cứu sản xuất
oligosaccharides bằng enzyme thủy phân chitin là chitinase từ nấm Lecanicillium

nuôi, ảnh hƣởng trực tiếp đến sản xuất nông nghiệp. Theo Hirohi Ihui, chitinase
luôn có mặt trong cơ thể thực vật mặc dù trong cây không chứa chitin. Khi thực vật
bị nhiễm nấm gây bệnh chứa chitin, các tế bào sẽ bị kích thích sinh ra chitinase và
β-1,3-glucanase xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển của
bệnh [54]. Sự kích thích hoạt tính chitinase là dấu hiệu trả lời của tế bào đối với tác
động của tác nhân gây bệnh, đi kèm với sự kích thích hoạt tính phân giải amoniac,
phenylalamin làm tiền đề cho sự tổng hợp lignin và phytoalexin ở thực vật. Vì
Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-13chitin không phải là thành phần phổ biến ở thực vật và động vật có xƣơng nên
ngƣời ta sử dụng các tác nhân kìm hãm sự sinh tổng hợp chitin trong các nấm và
côn

trùng

nhƣ

1-(1,6-dichlorobenzoyl)-3-(3,4-dichlorophenol),

nikkomycin,

polyxin D… Khi áp dụng trên thực vật và động vật, những tác nhân trên có nhiều
ƣu thế trong việc diệt nấm mốc, côn trùng có hại mà không gây hại đáng kế cho
thực vật hoặc động vật có xƣơng sống. Chitinase sản xuất bởi Enterobacter sp.
NRG4 có hoạt tính cao đối với Fusarium moniliforme, Aspergillus niger, Mucor
rouxii và Rhizopus nigricans [34]. Bhushan và Hoodal (1998) nghiên cứu về tính
tƣơng thích của những chitinase chịu nhiệt từ Bacillus sp. BG-11 với thuốc diệt côn

sự hình thành các hexamer [101].
Nhiều phƣơng pháp chẩn đoán bệnh nấm nhƣ ELISA, sự ngƣng kết kháng thể,
mẫu dò phân tử… tuy nhiên giá thành cao. Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên
cứu sử dụng chitinase trong việc chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do nấm gây ra.
Chitin hiện diện trong vách hầu hết các nấm gây bệnh, ít nhất là một giai đoạn
trong chu trình sống của nấm. Hay ở nấm men thì chitin hiện diện trong những vết
chồi. Do đó có thể dùng phƣơng pháp nhuộm chitin đặc hiệu cho nấm, tạo cơ sở
xây dựng một phƣơng pháp chẩn đoán nhanh các loài nấm gây bệnh. Các nhà khoa
học đã đề xuất một phƣơng pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách
sử dụng chitinase đã đƣợc phân lập tạo dòng từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên
chitinase VP1), enzyme này kết hợp chặt chẽ với chitin và có thể sử dụng nhƣ một
mẫu dò trong việc chẩn đoán với độ nhạy cao đểnhận diện một cách đặc hiệu các
vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh
[57], [71].
Ngoài ra, chitinase có tiềm năng trong việc sản xuất các loại kem hay thuốc
bôi ngoài da chứa chất chống nấm bệnh thƣờng xảy ra các nƣớc vùng nhiệt đới bởi
khả năng phân hủy vách tế bào vi nấm của chúng. Các nhà khoa học đề nghị sử
dụng chitinase với các tác nhân kháng nấm có thể chấp nhận khác (nhƣ
Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-15-

amphotericin B, 5-fluorocytosin, các dẫn xuất azol, allylamines-thiocarbamastes,
griseofulvin, bezoic…) nhằm bổ trợ cho hoạt động nội sinh của chitinase. Chitinase
có thể phát huy hiệu quả của các tác nhân kháng nấm ở liều lƣợng không gây tác
dụng phụ cho bệnh nhân. Ngoài ra, việc kết hợp giữa chitinase và laminarinase
đƣợc ghi nhân là hữu hiệu hơn trong việc tấn công vào vách tế bào nấm so với chỉ

-16Lecanicillium spp. đƣợc sử dụng trong việc tạo ra thuốc trừ sâu sinh học với một số
loài côn trùng có hại trên cây trồng.
Bào tử nấm Lecanicillium spp. rất đƣợc quan tâm trong vấn đề kiểm soát côn
trùng và sâu bệnh hại cây trồng. Đặc biệt, L. lecanii có độc lực rất mạnh đối với
một số loài rệp nhƣ rệp đào (Myzus persicae) và rệp bông (Aphis gossypii) [50].
Năm 2001, Kim và cs đã cho ra một sản phẩm thƣơng mại mang tên Vertalec™
đƣợc tạo ra từ bào tử nấm L. lecanii [67]. Vũ Văn Hạnh và các cs đã phân lập
Lecanicillium spp. từ rệp đào, có khả năng diệt rệp bông 100% sau 4 – 5 ngày trong
điều kiện phòng thí nghiệm và trên 78% trong điều kiện nhà kính sau 14 ngày. Các
bào tử của nấm này cũng có khả năng diệt rệp đào hại rau cải, dau diếp, ớt 100%
sau 5 ngày phun trong điều kiện phòng thí nghiệm [50]. Bên cạnh đó, nấm này
cũng đã đƣợc chứng minh có hoạt tính chống nấm mốc gây bệnh nấm mốc trên
nhiều loại cây trồng [22], [104]. Nấm Lecanicillium spp. cũng kí sinh trên nhiều
loại côn trùng bao gồm bộ cánh đều, bộ cánh cứng, cánh thẳng và bƣớm. Năm
2006, North và cs đã thử nghiệm và cho ra kết quả Lecanicillium muscarium diệt
đƣợc khoảng 70% bọ dừa Thripspalmi sau 4 ngày [83]. Lecanicillium spp. đƣợc sử
dụng để tạo chế phẩm diệt bƣớm trắng Mycotal™ [44], [56], [78]. Ngoài ra, loại
nấm này cũng có thể kiểm soát giun tròn nang gây hại đậu tƣơng, nấm mốc gây hại
dƣa chuột và các loại nấm gỉ gây hại cây hoa cúc [75], [103].
Mặc dù tiềm năng kiểm soát công trùng gây hại cây trồng của nấm
Lecanicillium spp. rất lớn nhƣng việc nghiên cứu ứng dụng của nấm này để bảo vệ
cây trồng cũng nhƣ kết quả đạt đƣợc còn rất hạn chế, nhất là ở Việt Nam. Hiệu quả
diệt côn trùng của chế phẩm từ Lecanicillium spp. cũng nhƣ các chế phẩm sinh học
khác còn kém, khối lƣợng chế phẩm diệt côn trùng sinh học đƣợc sử dụng chiếm tỷ
trọng thấp trong tổng khối lƣợng các loại thuốc diệt côn trùng. Do vậy, việc tăng

Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B



Luận án đầy đủ ở file: Luận án Full