BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA Sangrovit®
LÊN KHẢ NĂNG ĐỀ KHÁNG CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878) ĐỐI VỚI
VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri

Họ và tên sinh viên: LÊ THỊ BÍCH LIỂU
Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Chuyên ngành: NGƯ Y
Niên khóa: 2008– 2012

Tháng 7/2012


ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA Sangrovit®
LÊN KHẢ NĂNG ĐỀ KHÁNG CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878) ĐỐI VỚI
VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri

Tác giả

LÊ THỊ BÍCH LIỂU

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng
Kỹ sư ngành Nuôi Trồng Thủy Sản, chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn:

ictaluri” được tiến hành từ tháng 10/2011 đến tháng 3/2012 tại Trại Thực Nghiệm và
Phòng Thí Nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản Trường Ðại Học Nông Lâm
Thành Phố Hồ Chí Minh, nhằm đánh giá hiệu quả của Sangrovit® lên khả năng đề
kháng của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878) đối với vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri.
Thí nghiệm được thực hiện trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giống
khỏe mạnh sạch bệnh, trọng lượng trung bình ban đầu từ 9,15 ± 0,06g có nguồn gốc từ
trại cá giống Củ Chi. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri từ Phòng Thí Nghiệm Bệnh Học,
Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh được dùng để
gây bệnh trong thí nghiệm này.
Thức ăn ép đùn bổ sung Sangrovit® với hàm lượng 0, 25, 50, 75, 100 g/tấn thức
ănđược sử dụng trong thí nghiệm, tương ứng với thức ăn của các nghiệm thức đối
chứng, nghiệm thức 1, nghiệm thức 2, nghiệm thức 3, nghiệm thức 4.
Sau khi gây cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm vi khuẩn Edwardsiella
ictalurivới mật độ 3,39 x 105 CFU/mL, tỉ lệ chết ở các nghiệm thức có sự khác biệt có
ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05), cụ thể là ở nghiệm thức đối chứng, nghiệm thức 1,
nghiệm thức 2, nghiệm thức 3, nghiệm thức 4 có tỉ lệ chết lần lượt là 88,89± 3,85%,
82,22± 3,85%, 86,67± 6,67%, 77,78± 3,85%, 80,00± 6,67%. Kết quả định danh vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng bộ test IDS 14GNR (công ty Nam Khoa) cho thấy vi
khuẩn này chính là tác nhân gây chết cá ở các nghiệm thức tương ứng. Về triệu chứng
bệnh tích ở các nghiệm thức cũng tương tự nhau.
Sau khi cảm nhiễm cá được kiểm tra 2 chỉ tiêu của đáp ứng miễn dịch không
đặc hiệu là hoạt lực lysozyme và khả năng tiêu diệt vi khuẩn của huyết thanh. Kết quả
thu được cho thấy, cá ở nghiệm thức có bổ sung Sangrovit® với tỉ lệ 75, 100 g/tấn thức
ăn cho hiệu quả cao trong việc tăngkích thíchmiễn dịch không đặc hiệu thông qua sự
gia tăng hàm lượng của lysozymeở các nghiệm thức đối chứng, nghiệm thức 3 và
nghiệm thức 4 lần lượt là 161,67 ± 34,03,381,67 ± 25,66 và 339,17 ± 61.Tuy nhiên,
iii



2.3 Sản phẩm Sangrovit® ...........................................................................................12
v


2.3.1 Cây Plume poppy (Macleaya cordata) ..........................................................12
2.3.2 Sanguinarine ..................................................................................................13
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................18
3.1 Thời gian và địa điểm...........................................................................................18
3.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................18
3.3 Vật liệu nghiên cứu ..............................................................................................18
3.3.1 Ðối tượng nghiên cứu ....................................................................................18
3.3.2 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm ....................................................................19
3.3.3 Nguồn nước ...................................................................................................20
3.3.4 Thức ăn ..........................................................................................................20
3.4 Phương Pháp Nghiên Cứu ....................................................................................20
3.4.1 Nuôi tăng trưởng và theo dõi sức khỏe cá trước khi gây cảm nhiễm ............20
3.4.2 Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng..............................................................21
3.4.3 Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn ..................................................22
3.4.4 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn sống ................................................22
3.4.5 Phương pháp gây cảm nhiễm thực nghiệm ...................................................23
3.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ...............................................................32
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................33
4.1 Kết Quả Kiểm Tra Sức Khỏe Cá Trước Khi Thí Nghiệm ...................................33
4.1.1 Kết quả kiểm tra ký sinh trùng ......................................................................33
4.1.2 Kết quả kiểm tra vi khuẩn..............................................................................34
4.1.3 Trọng lượng cá tiến hành thí nghiệm ............................................................34
4.1.4 Các chỉ tiêu môi trường nước trong quá trình thí nghiệm .............................34
4.2 Mật độ vi khuẩn ngâm cá .....................................................................................38
4.2.1 Mật độ vi khuẩn ngâm cá ở thí nghiệm 1 ......................................................38



Colony Forming Unit

cm:

centimeter

ctv:

cộng tác viên

g:

gram

kg:

kilogram

mg:

milligram

mL:

milliliter

mm:

millimeter


Indentification of non fastidious Gram Negative Rods.
ONPG:

Ortho-Nitrophenyl-β-galactoside.

PAD:

Phenyl Alanin Deaminnase.

VP:

Voges-poskauer

LDC:

Lysin decarboncylase

SD:

Standard deviation

XHGV:

Xuất huyết gốc vây

XHTT:

Xuất huyết toàn thân


Trang
Hình 2.1 Macleaya cordata ...........................................................................................13
Hình 2.2 Công thức hóa học Sanguinarine ....................................................................14
Hình 2.3 Cơ chế tác động của sanguinarine lên sự hoạt hóa NF-κB.............................17
Hình 3.1 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ......................................................................19
Hình 3.2 Cá nuôi trong giai trước khi gây bệnh ............................................................21
Hình 3.3 Gây cảm nhiễm cho cá bằng phương pháp ngâm trong dung dịch vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri. ....................................................................................................25
Hình 3.4 Giải phẫu cá ....................................................................................................26
Hình 3.5 Thao tác thu máu cá ........................................................................................30
Hình 4.1 Sán lá đơn chủ ký sinh ở mang cá ..................................................................33
Hình 4.2 Đĩa cấy phân lập vi khuẩn sau 48 giờ ủ ở 30oC .............................................39
Hình 4.3 Kết quả bộ test IDS 14GNR đối với vi khuẩn E. ictaluri...............................40
Hình 4.4 Cá có biểu hiện lờ đờ, treo mình ở mặt nước .................................................43
Hình 4.5 Cá bệnh có biểu hiện xuất huyết.....................................................................43
Hình 4.6 Biểu hiện bệnh tích ở cá được gây cảm nhiễm ở các nghiệm thức ................44
Hình 4.7 Vi khuẩn E. ictaluri mọc trên đĩa thạch sau khi ủ 48 giờ...............................47

x


DANH SÁCH BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 4.1 Sự biến động nhiệt độ ở ao trong thời gian thí nghiệm. ............................35
Biểu đồ 4.2 Sự biến động DO ở ao trong thời gian thí nghiệm.....................................36
Biểu đồ 4.3 Sự biến động pH ở ao trong thời gian thí nghiệm. ....................................37
Biểu đồ 4.4 Tỉ lệ cá chết tích lũy ở các nghiệm thức ....................................................41
Biểu đồ 4.5 Sự thay đổi hoạt lực lysozyme theo thời gian ............................................46
Biểu đồ 4.6 Tỉ lệ sống sót của E. ictaluri sau khi tương tác với huyết thanh. ..............48


Tình trạng dư lượng kháng sinh trong sản phẩm cá nuôi xuất khẩu đã ảnh hưởng
không tốt đến uy tín, chất lượng của nghề nuôi trồng và xuất khẩu thủy sản của nước ta
hiện nay cũng như gây hại cho sức khỏe người sử dụng. Do đó, để đáp ứng được các
1


yêu cầu khắc khe của thị trường xuất khẩu, đồng thời phát triển bền vững nghề nuôi cá
nói riêng, nuôi trồng thủy sản ở nước ta nói chung, đòi hỏi người nuôi phải có biện
pháp chăm sóc an toàn, khoa học và thân thiện với môi trường.
Trước những yêu cầu đặt ra như thế, liệu pháp phòng bệnh cho cá bằng chế
phẩm sinh học được xem là phương pháp hữu hiệu nhất. Đặc biệt là sản phẩm
Sangrovit®với thành phần chính là sanguinarine, khi được sử dụng trên gia súc đã cho
kết quả trong việc kháng vi sinh vật, tác dụng tiết kiệm acid amin, điều hòa miễn dịch,
kháng viêm.Với những kết quả hữu hiệu như vậy, tuy nhiên vẫn chưa có một nghiên
cứu cụ thể nào đối với động vật thủy sản. Vì vậy, với mục đích tìm ra giải pháp an
toàn và phát triển bền vững cho nghề nuôi cá tra, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề
tài “Đánh giá hiệu quả của Sangrovit® lên khả năng đề kháng của cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878) đối với vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri”.
1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Đánh giá hiệu quả của Sangrovit® lên khả năng đề kháng của cá tra đối với vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri.

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Sơ Lược Về Bệnh Gan Thận Mủ
2.1.1 Lịch sử bệnh và một số nghiên cứu bệnh do E. ictaluri gây ra

Bệnh xảy ra cả trong mô hình nuôi bè và nuôi ao đất.
Những khu vực bị ảnh hưởng chủ yếu là những vùng có nghề nuôi cá tra phát
triển mạnh, mang tính chất công nghiệp như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và Vĩnh
Long, sau đó lây lan sang các vùng lân cận. Đặc biệt những năm gần đây bệnh này
cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nghề nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và
Sóc Trăng (Từ Thanh Dung và ctv., 2004).
Năm 2004, ở Thổ Nhĩ Kỳ, bệnh xuất hiện trên cá hồi vân Oncorhynchus mykiss.
Phát hiện mới đây cho thấy vi khuẩn cũng gây bệnh trên cá Plecoglossus altivelis.
2.1.2 Tác nhân gây bệnh
2.1.2.1 Phân loại
Edwardsiella ictaluri thuộc:
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Giống: Edwardsiella
Loài: Edwardsiella ictaluri
2.1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn yếm khí tùy nghi và cũng là vi khuẩn gây
bệnh bắt buộc.
Vi khuẩn E. ictaluri là trực khuẩn gram âm, có kích thước 0,7 x 1,25 µm. Vi
khuẩn thường đứng riêng lẻ, một số tạo thành chuỗi 2 - 3 tế bào và bắt màu hồng nhạt
(Nguyễn Hữu Thịnh, 2007). Vi khuẩn di động yếu, có thể khảo sát tính di động của vi
khuẩn ở 28oC. Vi khuẩn không sinh bào tử, cho phản ứng Oxidase âm tính, Catalase
dương tính, lên men trong môi trường O/F glucose, H2S âm tính, Indol âm tính.
E. ictaluri là vi khuẩn yếu, nuôi cấy phát triển chậm trên môi trường dinh
dưỡng thông thường. Trên môi trường giàu dinh dưỡng như BHIA, ở nhiệt độ 28 30oC, khuẩn lạc sau 24 giờ ủ trong suốt và nhỏ li ti; sau 36 - 48 giờ ủ, khuẩn lạc phát
4



5


giống chết có thể cao đến 100% sau 5 ngày mắc bệnh, cá thương phẩm mắc bệnh chết
30 - 50% sau một đợt dịch (Nguyễn Hữu Thịnh, 2007).
Bệnh thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ và kéo dài đến mùa khô. Thời điểm
bùng phát bệnh khác nhau tùy theo từng năm. Cao điểm bệnh thường xảy ra khoảng
tháng 9 đến tháng 12 hàng năm vào thời kỳ thời tiết chuyển mát. Bệnh bộc phát mạnh
khi nhiệt độ nước thấp, khoảng 20 - 28oC, đặc biệt khi nhiệt độ 25 - 28oC, nhưng khi
nhiệt độ nước khoảng 30oC trở lên, cá bệnh sẽ tự động hết bệnh và tỉ lệ chết giảm
xuống.
2.1.4 Dấu hiệu bệnh lý
Khi nhiễm bệnh, cá thường lờ đờ, tấp bờ, bơi xoay vòng và treo lơ lửng cơ thể
trên mặt nước.
Giảm ăn hay bỏ ăn sau khi nhiễm khuẩn.
2.1.4.1 Triệu chứng bên ngoài
Cá bệnh thường thấy có xuất huyết quanh hậu môn, miệng, hàm dưới, bụng, các
vây và các gốc vây. Cá có thể xuất huyết điểm trên thân hay xuất huyết toàn thân.
Có hiện tượng phù đầu do tích dịch dưới da vùng sọ. Khi dịch quá nhiều sẽ
chảy xuống hốc mắt và gây lồi mắt.
Do vi khuẩn có khả năng dung huyết làm mất máu nên khi quan sát thường thấy
mang nhạt màu.
2.1.4.2 Bệnh tích bên trong
• Bệnh tích đại thể
Gan, thận, lách cá bệnh sưng rất to, thận thường bị nhũn.
Trên bề mặt gan, thận, lách xuất hiện các đốm trắng hoại tử, với đường kính 0,5
- 2 mm. Khi cá bệnh nặng, trên gan, thận, lách có thể xuất hiện các mảng trắng hoại tử
hay cá có tích dịch mủ trắng trong xoang bụng.
Nhiều vùng mô hoại tử ở gan hóa lỏng.
Cá bệnh có thể có xuất huyết điểm ở ruột, cơ và mỡ, lòng ruột chứa dịch có lẫn

trong nuôi trồng thủy sản. Do đó, việc phòng bệnh là đòi hỏi cấp thiết nhất để đảm bảo
sức khỏe cho cá nuôi.
2.2 Sơ Lược Về Miễn Dịch Học Ở Cá Xương
Cũng như các loài động vật có xương sống khác hệ thống miễn dịch ở cá cũng
được chia làm 2 nhóm: miễn dịch không đặc hiệu (miễn dịch tự nhiên) và miễn dịch
đặc hiệu (miễn dịch thu được).
7


2.2.1 Miễn dịch không đặc hiệu (miễn dịch tự nhiên)
Đây là loại miễn dịch có sẵn khi cơ thể cá được sinh ra, và nó được di truyền từ
thế hệ này sang thế hệ khác.
Những yếu tố cấu thành nên miễn dịch không đặc hiệu ở cá gồm có:
2.2.1.1 Các hàng rào bảo vệ đầu tiên
Da của cá là một hàng rào bảo vệ khỏi các tác nhân gây bệnh xâm nhập từ bên
ngoài. Nhớt trên da có chức năng loại thải những vật lạ, cùng với nhớt mang và ruột,
chúng chứa các chất kháng khuẩn như lysozyme, bổ thể, protein C phản ứng (C
reactive protein, một chỉ số để nhận biết tình trạng viêm nhiễm của cơ thể; Do gan tiết
ra, khi có viêm thì nó được tiết ra nhiều hơn), lectins và các glubulin miễn dịch
(Fletcher, 1982; Ellis, 1989; Yano, 1996).
Các loại bạch cầu ở cá nhìn chung tương tự như động vật hữu nhũ mặc dù có
một ít khác biệt nhỏ về hình dạng giữa các loài cá khác nhau hoặc giữa cá và động vật
hữu nhũ đặc biệt là sự khác biệt về loại bạch cầu hạt hiện diện (Ellis, 1977; Rowley và
ctv., 1988; Hine, 1992)
2.2.1.2 Các yếu tố dịch thể không đặc hiệu
Ở cá, một số các yếu tố thể dịch không đặc hiệu tham gia vào việc tăng cường
khả năng kháng bệnh tự nhiên của cá. Chúng hoạt động theo nhiều cách khác nhau với
mục đích kiềm chế sự tăng trưởng và lan truyền của các tác nhân gây bệnh. Một trong
số những yếu tố được nghiên cứu nhiều nhất là một loạt các protein có trong huyết
thanh hay còn được biết như là các bổ thể.

được nhận biết bởi khả năng tương tác với các carbohydrate. Với đặc điểm này, chúng
được xem là các phân tử nhận diện (Yano, 1996).
Transferrin là một glycoprotein liên kết với sắt. Sắt là một nguyên tố quan trọng
cần thiết cho sự tăng trưởng của vi sinh vật và do đó transferrin hoạt động bằng cách
sử dụng khả năng liên kết mạnh của chúng với sắt để ức chế sự phát triển của vi sinh
vật bằng cách cô lập chất dinh dưỡng thiết yếu này.
Anti-proteases là những chất ức chế enzyme, hoạt động theo cách trung hòa các
ngoại độc tố protease được tạo ra bởi vi sinh vật. Các anti-protease được tìm thấy ở cá
bao gồm chất đồng đẳng của α2-macroglobulin trên động vật hữu nhũ được phân lập
từ cá Bơn (Starkey và ctv., 1982) và một protein tương tự α1-antitrypsin ở cá Tuyết
(Hielmeland, 1983). Trên cá Hồi, α2-macroglobulin cho thấy có khả năng ức chế hoạt
động phân giải protein của protease ở vi khuẩn Aeromonas salmonicida, điều này cho

9


thấy vai trò của α2-macroglobulin trong việc phòng vệ chống lại sự lây nhiễm của vi
khuẩn này (Ellis, 1987).
Interferins tạo nên một họ protein không đồng dạng để tạo nên sự bảo vệ chống
lại sự lây nhiễm của virus. Chúng gồm 3 nhóm: interferon α, β và γ. Các interferon
hiện diện để tham gia vào các cơ chế dẫn đến sự loại thải sự nhiễm bệnh do virus
(Renault và ctv., 1991).
Eicosanoids bao gồm prostaglandin, thromboxane và leukotriene. Leukotriene
và lipoxin có thể làm gia tăng sự thực bào và hoạt động như các chất hấp dẫn hóa học
đối với các bạch cầu trung tính (Rowley, 1991; Secombes, 1996).
2.2.1.3 Các yếu tố miễn dịch tế bào không đặc hiệu
Bạch cầu đơn nhân và đại thực bào là các tế bào sơ khởi tham gia vào quá trình
thực bào và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh sau khi có sự nhận diện lần đầu và sự
nhiễm bệnh sau đó.
Bạch cầu trung tính là các tế bào đầu tiên tham gia vào các giai đoạn đầu của

Dùng để tiêu diệt các mầm bệnh nội bào (ví dụ như vi khuẩn, virus, ký sinh
trùng). Nhờ vào sự tiếp của các vật lạ xâm nhập với sự hiện diện tiếp theo cùa một
kháng nguyên có cùng phức hệ phù hợp với tổ chức chủ yếu (MHC – Major
Histocompatibility Complex I hoặc II) đối với các tế bào trợ giúp T. Một khi các tế
bào trợ giúp T được kích hoạt, chúng sẽ sản sinh cytokine là chất kích thích hoạt động
của các đại thực bào.
Quá trình này rất hữu hiệu để chống lại vi khuẩn, chẳng hạn như vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri (Shoemaker và ctv., 1999)
2.2.2.3 Kí ức miễn dịch
Thể hiện thông qua hiện tượng đáp ứng miễn dịch thứ phát mà điển hình là thời
gian hình thành kháng thể sớm hơn và cường độ phản ứng mãnh liệt hơn so với đáp
ứng miễn dịch nguyên phát.
Không giống như giáp xác, ở cá có quá trình ghi nhớ miễn dịch (Arkoosh và
Kaattari, 1991).
Kí ức miễn dịch mang tính đặc hiệu đối với kháng nguyên. Tuy nhiên hàm
lượng kháng thể cực đại hình thành trong đáp ứng miễn dịch thứ phát so với hàm
lượng này trong đáp ứng miễn dịch nguyên phát ở cá nhìn chung vẫn còn thấp hơn
nhiều so với động vật có vú và phụ thuộc vào nhiệt độ.

11


2.2.3 Các đáp ứng miễn dịch niêm mạc
Trong lớp niêm mạc của hệ tiêu hóa và hô hấp có sự tụ tập của nhiều tế bào
lympho và tế bào trình diện kháng nguyên có vai trò khởi động đáp ứng miễn dịch đối
với kháng nguyên đường tiêu hóa (ăn vào) và hô hấp (hít vào). Cũng giống như da, lớp
niêm mạc là hàng rào quan trọng ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật.
Các đáp ứng miễn dịch trên bề mặt da và niêm mạc ruột ở cá vẫn còn ít được
chú ý nghiên cứu mặc dù tầm quan trọng của các đáp ứng này rất rõ rệt.
Ruột: Niêm dịch ruột là nơi cư trú của rất nhiều tế bào bạch cầu bao gồm các

2008; trích bởi Ouyang và ctv., 2010).

Hình 2.1 Macleaya cordata
Thành phần
Macleaya cordata mang một số alkaloid như: oxysanguinarine, protopine,
protopine-N-oxide, sanguinarine,… (Duke, 1992; Kiryakov và ctv., 1967; trích bởi
Vienna và ctv., 2007). Nghiên cứu của Kosina và ctv (2010) cho thấy hàm lượng
sanguinarine và chelerythrine cao nhất ở vỏ cây. Protopine và allocryptopine là các
alkaloid chủ yếu ở cuống. Thêm vào đó ezyme sanguinarine reductase – ezyme điều
hòa cân bằng sanguinarine/dihydrosanguinarine cũng được tìm thấy trong protein hòa
tan từ lá.
2.3.2 Sanguinarine
Sanguinarine là một benzo[C] phenanthidine alkaloid bậc 4 (Mackraj và ctv.,
2008), tồn tại ở các cây họ anh túc (Papaveraceae), họ lam cận (Fumariaceae) và họ
cam (Rutaceae). Nguồn sanguinarine chủ yếu ở các loài cây Chelidonium majus,
Macleaya cordata và Sanguinaria canadensis (Dvorak và Simanek, 2007).
13