BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƯỞNG CỦA MANNAN OLIGOSACCHARIDE (MOS)
TRONG CHẾ PHẨM ACTIGEN LÊN SỰ CẢI THIỆN
HỆ MIỄN DỊCH KHÔNG ĐẶC HIỆU CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus)

Họ và tên sinh viên: NGÔ LÂM TRUNG NGUYÊN
Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Chuyên ngành: NGƯ Y
Niên khóa: 2008 – 2012

Tháng 07/2012


Ảnh hưởng của Mannan Oligosaccharide (MOS) trong chế phầm Actigen
lên sự cải thiện hệ miễn dịch không đặc hiệu của cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus)

TRANG TỰA
Tác giả
NGÔ LÂM TRUNG NGUYÊN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
cấp bằng Kỹ sư Nuôi Trồng Thủy Sản chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn:
PGS - TS. LÊ THANH HÙNG

ii


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của Mannan Oligosaccharide (MOS) trong chế
phẩm Actigen lên sự cải thiện hệ miễn dịch không đặc hiệu của cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus)” được tiến hành tại Trại thực nghiệm Thủy Sản (trại cũ), phòng thí
nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, khoa Thủy Sản, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí
Minh từ tháng 8/2011 đến tháng 3/2012. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn
toàn ngẫu nhiên.
Thí nghiệm được tiến hành nhằm đánh giá ảnh hưởng của Mannan
Oligosaccharide (MOS) có trong chế phẩm Actigen lên sự cải thiện sức khỏe của cá
tra.
Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức (NT ĐC, NT A1, NT A2, NT A3) với các tỷ lệ
bổ sung MOS (Actigen) vào thức ăn khác nhau lần lược là 0; 0,4; 0,8 và 1,2 g/kg thức
ăn và tiến hành cho cá tra ăn trong thời gian 10 tuần.
Sau đó, chúng tôi tiến hành thu mẫu máu cá tra để kiểm tra lượng bạch cầu và
lysozyme trong máu. Tiếp theo cá được cảm nhiễm với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.
Kết quả thu được:
-

Lượng bạch cầu trong máu cá tăng theo thứ tự NT ĐC, NT A1, NT A3, NT A2.

Trong đó, sự khác biệt giữa NT A2 và NT A3 so với NT ĐC là có ý nghĩa về mặt
thống kê và khác biệt một cách tương đối so với NT A1. Còn giữa NT A2 và NT A3
thì hoàn toàn không có sai khác. Bên cạnh NT A2 có tác dụng làm tăng số lượng bạch
cầu rõ rệt thì NT A3 cũng làm tăng số lượng bạch cầu một cách đáng kể.
Kết luận: khi bổ sung MOS (Actigen) từ 0,8 g/kg thức ăn trở lên (đến 1,2 g/kg
thức ăn) giúp làm tăng số lượng bạch cầu trong máu cá tra và sự sai khác này (tăng) có
ý nghĩa về mặt thống kê so với NT ĐC.

iv


MỤC LỤC
Đề mục

Trang

TRANG TỰA ..................................................................................................................... i
LỜI CẢM TẠ .................................................................................................................... ii
TÓM TẮT......................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ......................................................................................................................... v
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ............................................................................................. ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................... x
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ ........................................................................................ xi
Chương 1 GIỚI THIỆU .................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu đề tài......................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Đặc điểm sinh học cá tra ......................................................................................... 3
2.1.1. Phân loại .......................................................................................................... 3
2.1.2. Phân bố ............................................................................................................ 3
2.1.3. Đặc điểm hình thái ........................................................................................... 3
2.1.4. Điều kiện môi trường sống .............................................................................. 4
2.1.4.1. Hàm lượng oxy hoà tan ............................................................................ 4
2.1.4.2. pH ............................................................................................................. 4
2.1.4.3. Nhiệt độ .................................................................................................... 4
2.1.4.4. Độ mặn ..................................................................................................... 4
2.1.5. Đặc điểm dinh dưỡng ...................................................................................... 4

3.2.1. Vật liệu........................................................................................................... 21
3.2.2. Dụng cụ và hoá chất ...................................................................................... 21
3.2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của MOS (Actigen) lên khả năng
miễn dịch không đặc hiệu của cá tra ................................................................... 21
3.2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của MOS (Actigen) lên khả
năng đề kháng của cá tra đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ....................... 22
3.2.3. Nguồn nước ................................................................................................... 23
3.2.4. Thức ăn .......................................................................................................... 23
3.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................... 23

vi


3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của MOS (Actigen) lên khả năng miễn
dịch không đặc hiệu của cá tra ................................................................................. 23
3.3.1.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm cho cá tra ăn thức ăn bổ sung MOS
(Actigen).............................................................................................................. 23
3.3.1.2. Kiểm tra số lượng bạch cầu trong máu cá .............................................. 24
3.3.1.3. Phân tích lysozyme ................................................................................ 26
3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của MOS (Actigen) lên khả năng đề
kháng của cá tra đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ......................................... 27
3.3.2.1. Bố trí thí nghiệm .................................................................................... 27
3.3.2.2. Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn .......................................... 27
3.3.2.3. Phương pháp gây bệnh thực nghiệm ...................................................... 28
3.3.2.4. Phương pháp theo dõi thí nghiệm .......................................................... 30
3.3.2.5. Xét nghiệm kiểm tra vi khuẩn gây bệnh ................................................ 31
3.3.3. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 31
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 32
4.1. Các yếu tố chất lượng nước trong thời gian tiến hành thí nghiệm........................ 32
4.1.1. Các yếu tố môi trường nước trong quá trình thí nghiệm (10 tuần) cho cá ăn

g: gram
IDS 14 GNR: Indentification System with 14 biochemical reationsfor
Indentification of non fastidious Gram Negative Rods.
kg: kilogram
mg: milligram
mL: milliliter
mm: millimeter
NA: Nutrient Agar
NH3: Ammonia
NT: nghiệm thức
o

C: degree Celsius

OD: Optical Density
PCR: Polymerase Chain Reaction
pH: Potential of hydrogen
TN: thí nghiệm
TSA: Tryptic Soy Agar

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng

Nội dung

Trang


Hình 3.5: Buồng đếm hồng cầu Neubauer ....................................................................... 26
Hình 3.6: Huyết thanh cá thu được sau khi ly tâm máu ................................................... 27
Hình 3.7: Đo OD của hỗn hợp huyết thanh và vi khuẩn M. lysodeikticus sau 1’ và 5’
thực hiện phản ứng ở 25oC ............................................................................................... 27
Hình 3.8: Vi khuẩn được tăng sinh trong bình tam giác chứa môi trường BHIB ............ 28
Hình 3.9: Cấy ria để phân lập vi khuẩn từ nội tạng cá thí nghiệm ................................... 28
Hình 3.10: Cấy trang để xác định mật độ vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm ..................... 29
Hình 3.11: Bố trí xô ngâm cá gây bệnh ............................................................................ 29
Hình 3.12: Vi khuẩn và dụng cụ gây bệnh ....................................................................... 30
Hình 3.13: Cá được ngâm với vi khuẩn và có sụt khí liên tục ......................................... 30
Hình 3.14: Cá được chuyển lại bể Composite sau khi ngâm với vi khuẩn ...................... 30
Hình 4.1: Các đốm mủ trắng xuất hiện trên nội tạng của cá thí nghiệm .......................... 37
Hình 4.2: Cá bị xuất huyết vây, hàm dưới, da .................................................................. 37
Hình 4.3: Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh............................................................................ 38
Hình 4.4: Kết quả định danh vi khuẩn phân lập từ cá bệnh ............................................. 38

x


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ

Nội dung

Trang

Biểu đồ 4.1: Số lượng bạch cầu trong máu cá ở các NT sau 10 tuần thí nghiệm ............ 34
Biểu đồ 4.2: Hoạt lực lysozyme trong huyết thanh máu cá sau 10 tuần thí nghiệm ........ 35
Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ cá chết ở các NT khi gây cảm nhiễm bởi E. ictaluri .......................... 36


Saccharomyces cerevisiae, có tác dụng điều chỉnh khả năng đáp ứng miễn dịch, cải
thiện tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn (Miguel và ctv., 2004). Đã có nhiều
nghiên cứu đánh giá việc bổ sung MOS (Actigen) vào các loài vật nuôi. Các nghiên
1


cứu của MOS (Actigen) trên heo, gà thịt, gà tây và một số loài khác cho thấy có thể sử
dụng MOS (Actigen) liều thấp hơn nhiều lần so với Bio-Mos® (Tài liệu kỹ thuật của
Alltech, 2010). Tuy nhiên, hiện tại chưa có nghiên cứu về tác động của MOS
(Actigen) đối với cá tra.
Trước những yêu cầu đặt ra là tăng cường sức đề kháng và cải thiện tỷ lệ sống
để nâng cao hiệu quả kinh tế trên cá tra, đề tài “Ảnh hưởng của Mannan
Oligosaccharide (MOS) trong chế phẩm Actigen lên sự cải thiện hệ miễn dịch
không đặc hiệu của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được tiến hành.
1.2. Mục tiêu đề tài
 Đánh giá hiệu quả của MOS (Actigen) lên khả năng tăng cường tính miễn dịch
không đặc hiệu của cá tra.
 Đánh giá hiệu quả của MOS (Actigen) lên khả năng đề kháng của cá tra đối với vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đặc điểm sinh học cá tra
2.1.1. Phân loại
Lớp: Osteichthyes
Bộ: Siluriomes
Họ: Pangasiidae

Ở nhiệt độ 15oC thì cường độ bắt mồi của cá giảm, nhưng cá vẫn sống, ở nhiệt độ
39oC cá sẽ bơi lội không bình thường (Trần Thanh Xuân, 1994).
2.1.4.4. Độ mặn
Cá tra là loài sống chủ yếu ở nước ngọt, không sống được ở vùng nước mặn.
Nhưng có khả năng sống trong vùng nước lợ, độ mặn có thể chịu đựng tối đa là 10‰
(Mai Đình Yên và ctv., 1992).
2.1.5. Đặc điểm dinh dưỡng
Cá tra khi hết noãn hoàng thì thích ăn mồi tươi sống. Vì vậy, chúng ăn thịt lẫn
nhau ngay trong bể ấp và chúng vẫn tiếp tục ăn nhau nếu cá ương không được cho ăn
đầy đủ. Dạ dày của cá phình to hình chữ U và co giãn được, ruột cá tra ngắn, không
gấp khúc lên nhau mà dính vào màng treo ruột ngay dưới bóng khí và tuyến sinh dục.
Dạ dày to và ruột ngắn là đặc điểm của cá thiên về ăn thịt. Khi cá lớn thể hiện rõ tính
ăn rộng, ăn đáy và ăn tạp thiên về động vật nhưng dễ chuyển đổi thức ăn. Trong điều
kiện thiếu thức ăn cá có thể sử dụng các loại thức ăn bắt buộc khác như mùn bã hữu
cơ, thức ăn có nguồn gốc động vật.
2.1.6. Đặc điểm sinh trưởng
Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, còn nhỏ cá tăng nhanh về chiều
dài. Cá ương trong ao sau 2 tháng đã đạt chiều dài 10 - 12cm (khoảng 14 - 15g). Từ
4


khoảng 2,5 kg trở đi, mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với tăng chiều dài cơ thể. Cỡ
cá 10 tuổi trong tự nhiên tăng trọng rất ít và có thể sống trên 20 năm, kích thước tối đa
đạt được là 1,8 m. Nuôi trong ao 1 năm cá đạt 1 – 1,5 kg/con (năm đầu tiên), những
năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn, có khi đạt tới 5 – 6 kg/năm tùy môi trường, loại
thức ăn sử dụng.
2.1.7. Đặc điểm sinh sản
Tuổi thành thục của cá đực là 2 tuổi và cá cái là 3 tuổi, trọng lượng cá thành
thục lần đầu từ 2,5 – 3 kg. Trong tự nhiên chỉ gặp cá thành thục trên sông thuộc địa
phận Campuchia và Thái Lan.

do vi khuẩn E. ictaluri gây ra.
Cho đến năm 1992, bệnh đã xuất hiện trên cá tra, cá basa nuôi trong ao, bè ở
Việt Nam với những đốm hoại tử trên gan, thận, lách nhưng không rõ tác nhân gây
bệnh.
Vào cuối năm 1998, bệnh xuất hiện và được mô tả lần đầu tiên trên cá tra nuôi
ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (Ferguson và ctv., 2001).
Bệnh được người nuôi gọi tên là bệnh mủ gan hay bệnh gan thận mủ.
Ferguson và ctv. (2001) đã có công trình nghiên cứu đầu tiên mô tả về bệnh gan
thận mủ trên cá tra nuôi tại Việt Nam, vi khuẩn được định danh là Bacillus sp.
Cho đến năm 2002, các nhà nghiên cứu đã đính chính lại nguyên nhân gây bệnh
gan thận mủ trên cá tra Việt Nam là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Crumlish và
ctv., 2003).
Năm 2004, ở Thổ Nhĩ Kỳ, bệnh xuất hiện trên cá hồi cầu vồng Oncorhynchus
mykiss. Phát hiện mới đây cho thấy vi khuẩn cũng gây bệnh trên cá Ayu Plecoglossus
altivelis (Nhật).
2.2.2. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
2.2.2.1. Phân loại
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Giống: Edwardsiella
Loài: Edwardsiella ictaluri

6


Hình 2.2: Nhuộm Gram vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
2.2.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá
E.ictaluri là vi khuẩn yếm khí tùy nghi, gây bệnh bắt buộc. Nó có khả năng gây


-

Methyl red

-

Citrate simmons

-

Citrate christensens

-

Sinh H2S trong triple sugar iron

-

Sinh H2S trong pepton iron agar

-

Phát triển ở nồng độ muối 1,5%

+

Phát triển ở nồng độ muối 3 %

-

- E. ictaluri cũng có thể xâm nhập qua đường tiêu hóa. Đầu tiên vi khuẩn qua
đường miệng, phát triển ở ruột, gan, thận và cơ trong vòng 2 tuần gây cảm nhiễm làm
ruột trương to, đầy hơi (Fracis – Floyd và ctv., 1987). Bằng con đường này thì vi
khuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố da. Ngoài ra, vi khuẩn
cũng có thể xâm nhập qua đường tiêu hóa, qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm
trùng máu.
- E. ictaluri cũng xâm nhập qua mang . Thí nghiệm chứng minh trong suốt quá
trình ngâm, vi khuẩn sống thành tập đoàn trên biểu bì mang với số lượng lớn , sau đó
gia tăng ở gan và ít phát triển ở thận sau, ruột và não (Nusbaum và Plumb, 1996).
Phương thức lây lan: Vi khuẩn được bài thải từ phân, xác cá chết vào trong
nước đây là con đường truyền lây trực tiếp từ cá này sang cá khác trong ao nuôi. Bệnh
cũng có thể lây lan một cách gián tiếp như: chim, động vật, người, dụng cụ sử dụng
như lưới, vợt dùng chung cho các ao...
Bệnh thường bộc phát mạnh vào mùa xuân, mùa thu ở các tỉnh miền Bắc và
trong các ao nuôi mật độ cao, chất lượng nước xấu và trong nuôi cá lồng bè (Từ Thanh
Dung, 2000; Bùi Quang Tề, 2003). Bệnh cũng thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ và
kéo dài đến mùa khô, thời điểm bùng phát bệnh cũng khác nhau tùy theo từng năm.
Bệnh còn xảy ra phổ biến trong các tháng có thời tiết chuyển mát (tháng 9 - 12), trong
thời gian này nhiệt độ nước có thể giảm thấp đến 26 - 28oC (Nguyễn Hữu Thịnh và
Trương Thị Thanh Loan, 2007).
Theo Hawke và ctv (1998), E.ictaluri có khả năng gây bệnh cao nhất cho cá
nheo Ictalurus punctatus nuôi ở Hoa Kỳ khi nhiệt độ nước trong khoảng 20 - 28oC.
Như vậy, có khả năng E.ictaluri gây bệnh trên cá tra tại Việt Nam có đặc điểm gây
bệnh trong điều kiện nhiệt độ nước mát tương tự như trên cá nheo (Nguyễn Hữu Thịnh
và Trương Thị Thanh Loan, 2007). Nhưng gần đây do mật độ nuôi ngày càng cao,
môi trường ô nhiễm, mầm bệnh tích tụ trong ao nên bệnh cũng xuất hiện thường xuyên
trong tháng thời tiết nóng (tháng 4, 5 và 6) mặc dù mức độ thiệt hại có thấp hơn
(Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thị Thanh Loan, 2007).
9


Hạn chế s ử dụng hóa chất diệt kí sinh trùng như CuSO4 vì có thể sẽ làm giảm
chất lượng nước và khả năng đề kháng của cá.
Đối với cá bệnh, cá yếu, cá chết nên vớt và chôn hố có rải vôi.
Giảm lượng thức ăn hoặc ngưng cho ăn để giảm ô nhiễm nước ao và giảm khả
năng lây lan vi khuẩn khi thấy xuất hiện cá bệnh.
Dụng cụ sử dụng nên phơi nắng hay ngâm Chlorine, BKC để diệt mầm bệnh tốt
nhất sử dụng dụng cụ riêng cho mỗi ao để tránh lây lan mầm bệnh.
2.2.6. Trị bệnh
Bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E. ictaluri gây ra nên do đó có thể điều trị bằng
kháng sinh. Song việc sử dụng kháng sinh phải đúng nguyên tắc đó là: đúng liều, đúng
lượng, đúng loại kháng sinh, đúng liệu trình, tránh phối hợp các loại kháng sinh ức chế
nhau.
Tuy nhiên với việc sử dụng kháng sinh tràn lan như hiện nay đã dẫn đến hệ quả
là vi khuẩn không còn nhạy cảm với kháng sinh, gây tốn kém và không đạt hiệu quả
trong điều trị. Do đó nguyên tắc chính trong nuôi trồng thủy sản nói chung và nuôi cá
tra nói riêng vẫn là phòng bệnh hơn chữa bệnh.
2.2.7. Một số đối tượng cảm nhiễm khác của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Vi khuẩn E. ictaluri có khả năng gây bệnh tự nhiên trên nhiều loài cá như bệnh
viêm ruột và nhiễm trùng máu trên cá nheo Ictalurus punctatus (Hawke, 1979; Hawke
và ctv., 1981); cá dao xanh Eigemannia virescens (Kent và Lyons, 1982); cá danio
Danio devano (Blazer và ctv., 1985, Waltman và ctv., 1985), và cá trê Clarias
batrachus (Kasornchandra và ctv., 1987).
Vi khuẩn E. ictaluri còn gây bệnh trên một số loài trong điều kiện thí nghiệm
như cá hồi chinook Oncorhynchus tshauytscha và cá hồi vân Oncorhynchus mykiss
(Baxa và ctv., 1990; trích dẫn bởi Võ Thị Thanh Bình, 2008).
2.3. Prebiotic
Prebiotic được định nghĩa là những thành phần thức ăn không tiêu hóa được
nhưng có tác dụng kích thích sự phát triển hoặc tăng cường hoạt động của các vi
11



Hình 2.5: Cấu trúc vách tế bào Saccharomyces cerevisiae
(Nguồn: />
Vách tế bào Saccharomyces cerevisiae có khả năng hấp thụ hoặc kết dính các
độc tố, các tác nhân kháng vitamin, virus, vi khuẩn có hại nên được chiết xuất để bảo
vệ môi trường đường ruột.
2.3.2. Mannan oligosaccharide (MOS)
2.3.2.1. Giới thiệu MOS
Carbohydrate (hay còn gọi là đường đơn) đóng vai trò độc nhất trong sự sống,
chức năng của carbohydrate rất đa dạng nhờ vào cấu trúc và vị trí của chúng trong hệ
thống sinh học. Carbohydrate là thành phần quan trọng của phần lớn cấu trúc bề mặt tế
bào (Osborn và Khan, 2000). Và cũng là nguồn năng lượng chuyển hóa chủ yếu trong
thức ăn. Các oligosaccharide được hình thành từ 2 đến 10 phân tử monosaccharide.
Hơn 10 phân tử monosaccharide sẽ liên kết lại với nhau và tạo thành một
polysaccharide. Mannose là một monosaccharide để xây dựng lên MOS. Ở ruột non
MOS sẽ không bị phá vỡ liên kết bởi các enzyme tiêu hóa, vì vậy MOS sẽ không bị
biến tính khi tới ruột già (Strickling và ctv., 2000).
MOS được ly trích từ vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae và thu
nhận bằng phương pháp ly tâm nấm men đã được tách vỏ (Spring và ctv., 2000).
Chúng có tác dụng tương tự như β – glucan. Do đó, trong sản xuất, phối hợp cả β –
glucan và MOS trong cùng một sản phẩm sẽ kích hoạt hệ miễn dịch của động vật thủy
sản (Lê Thanh Hùng, 2008).
13