BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG in vitro
TỪ LÁ CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ
(Polygonum multiflorum Thunb)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: PHẠM MINH TÂM
Niên khóa: 2008 – 2012

Tháng 07 năm 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG in vitro
TỪ LÁ CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ
(Polygonum multiflorum Thunb)

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện


Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb) là một thảo dược quý chứa các
thành phần: emodin, chrysophanol, rhein, physcion, protid, tinh bột, lipid, lecitin,
rhaponticin (rhapontin, ponticin). 2,3,5,4 tetrahydroxytibene -2-O-b-D-glucoside,
Tanin…là một loại thuốc truyền thống ở Việt Nam, Trung Quốc. Nhân giống hà thủ ô
đỏ in vitro tạo ra số lượng lớn cây trong thời gian ngắn giúp đáp ứng cho nhu cầu
trồng trọt và các mục đích sử dụng khác.
Nội dung của nghiên cứu này bao gồm sự tái sinh chồi từ lá và tạo cây hoàn
chỉnh để nuôi trồng ngoài vườn ươm.
Lá cây hà thủ ô đỏ được cấy vào môi trường MS bổ sung alphanaphthaleneacetic acid (NAA), andbenzyladenine (BA) thidiazuron (TDZ) 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4D). 93% mẫu cho cảm ứng trong môi trường chứa
0,75 mg/l TDZ, 2,0 mg/l BA và 0,5 mg/l 2,4D tạo mô sẹo nặng trung bình 0,419 g.
Sau đó mô sẹo được cấy chuyền sang môi trường MS chứa 4mg/l BA and 1.5mg/l
Kinitin để tạo chồi với trung bình 3,933 chồi tái sinh trên mẫu. Chồi sẽ được nhân cụm
chồi trong môi trường MS bổ sung 4 mg/l 6-benzylaminopurine (BAP), 0,25 mg/l
NAA với trung bình 7,44 chồi trên một cụm chồi và tạo rễ trong môi trường MS bổ
sung 0,5 mg/l NAA. Cuối cùng, cây hoàn chỉnh được trồng ngoài vườn ươm trên giá
thể chứa 50% xơ dừa và 50 % tro trấu cho tỷ lệ sống 57%, chiều cao cây trung bình
đạt 5.27 cm và số lá trung binh 4,41 lá trên mổi cây.

ii


SUMMARY

The title of thesis “Regenerate shoots form leaf Polygonum multiflorum
Thunb.”
Polygonum multiflorum Thunb is valuable herb containing components:
emodin, chrysophanol, rhein, physcion, proteins, starch, lipid, lecitin, rhaponticin
(rhapontin, ponticin). 2,3,5,4 tetrahydroxytibene -2-O-b-D-glucoside, Tanin…It is also
known as tradition medicine of China and VietNam. Micropropagation of Polygonum
multiflorum Thunb in vitro produce large amounts of plants in a short time to respond

Key words: Polygonum multiflorum Thunb, in vitro, micropropagation…

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i
TÓM TẮT ......................................................................................................................ii
SUMMARY .................................................................................................................. iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG .........................................................................................vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ........................................................................................ viii
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Yêu cầu của đề tài ...................................................................................................... 1
1.3 Nội dung thực hiện .................................................................................................... 1
Chƣơng 2 TỔNG QUAN ............................................................................................... 2
2.1Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ ................................................................................. 2
2.1.1Phân loại .................................................................................................................. 2
2.1.2 Đặc điểm hình thái .................................................................................................. 2
2.1.3 Phân bố .................................................................................................................... 2
2.1.4 Tác dụng dược lý ..................................................................................................... 2
2.2Khái niệm nuôi cấy mô tế bào .................................................................................... 3
2.2.2 Sự tạo mẫu cấy in vitro vô trùng ............................................................................ 3
2.2.2 Sự tăng sinh tế bào có định hướng và tái sinh cây hoàn chỉnh .............................. 4
2.2.3 Nuôi trồng ngoài vườn ươm ................................................................................... 4
2.2.4 Auxin và Cytokinin ................................................................................................ 5
2.2.4.1 Auxin ................................................................................................................... 5
2.2.4.2Cytokinin .............................................................................................................. 6

3.4.6 Nuôi trồng ngoài vườn ươm ................................................................................. 18
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 20
4.1 Thời gian và nồng độ javel thích hợp để khử trùng mẫu cấy .................................. 20
4.2 Sự tạo mô sẹo .......................................................................................................... 20
4.3 Sự tái sinh chồi từ sẹo.............................................................................................. 22
4.4 Sự nhân cụm chồi .................................................................................................... 24
4.5 Sự tạo rễ ................................................................................................................... 26
4.6 Nuôi trồng ngoài vườn ươm .................................................................................... 27
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 30
PHỤ LỤC
v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BA:N6 – benzyladenine
BAP:6-Benzylaminopurine
ĐC: đối chứng
MS:môi trường Murashige and Skoog (1962)
NAA:α – napthylacetic acid
TDZ:Thidiazuron ( N-phenyl-N-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea)
NT: Nghiệm thức
2,4D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang

Hình 4.3 Mô sẹo cảm ứng tái sinh chồi sau 10 ngày môi trường K6 .......................... 23
Hình 4.4 Mô sẹo cảm ứng tái sinh chồi sau 10 ngày môi trường K4 .......................... 23
Hình 4.5 Mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường K2 ....................................... 24
Hình 4.6 Mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường K5 ....................................... 24
Hình 4.7 Mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường K6 ....................................... 24
Hình 4.8 Mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường K3 ....................................... 24
Hình 4.9 Chồi sau cấy 25 ngày................................................................................... 25
Hình 4.10 Cụm chồi sau cấy 25 ngày trên môi trường V6 ......................................... 25
Hình 4.11 Rễ sau cấy 30 ngày .................................................................................... 27
Hình 4.12 Cây con trồng trong 15 ngày……………………………………………..28
Hình 4.13 Cây con sau 15 ngày trồng trong H2 ......................................................... 28

viii


Chƣơng 1 GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb.) từ xa xưa đã được mệnh danh là
một loại thần dược với các sự tích và các câu tục ngữ do tính dược liệu quý của nó. Do
đặc điểm dược liệu quý nên hà thủ ô đỏ bị khai thác quá mức và nằm trong sách đỏ
(Trần Ngọc Ninh, 2006), cần được bảo vệ. Hiện nay hà thủ ô đỏ đang được quan tâm
và bảo vệ bởi nhiều cơ quan (Sở Khoa học Công nghệ Đồng Nai, Phú Yên …) và tiềm
năng trên thị trường rộng mở do tính dược liệu quý của nó giúp làm giảm nguy cơ tim
mạch, làm đen tóc, mọc tóc, có tính an thần, diệt khuẩn... (Fnimh, 2001)
Trong tự nhiên, hà thủ ô đỏ được nhân giống bằng cách giâm cành, trồng bằng
hạt (Đỗ Tất Lợi, 2005).Vấn đề gặp phải với phương pháp nhân giống truyền thống đối
cây hà thủ ô đỏ là khả năng nảy mầm hạt chậm, tỷ lệ sống thấp còn phương pháp giâm
cành tạo ra cây con có tuổi thọ ngắn. Theo Lin (2003), các cây hà thủ ô đỏ nguồn gốc
in vitro cho tỉ lệ các chất emodin và physcion cao hơn so với cây ngoài tự nhiên.
Từ những nhận định trên, được sự đồng ý của bộ môn Công nghệ sinh học Đại

:Caryophyllales

Họ (Familia) :Polygonaceae
Chi (Genus) : Fallopia
Loài (Species): Fallopia multiflora
Tên gọi khác: Giao đằng, dạ hợp.
Hình 2.1: Hà thủ ô đỏ.
2.1.2. Đặc điểm hình thái
Hà thủ ô đỏ là cây dây leo, sống nhiều năm. Thân rễ phồng thành củ.Thân quấn,
mọc xoắn vào nhau, mặt ngoài thân có màu xanh tía, nhẵn, có vân. Lá mọc so le,
cuống dài. Phiến lá hình tim, dài 4-8cm, rộng 2,5-5cm, đầu nhọn, mép nguyên hoặc
hơi lượn sóng, cả hạị mặt đều nhẵn. Bẹ chìa mỏng, màu nâu nhạt, ôm lấy thân. Hoa tự
chùm nhiều nhánh. Hoa nhỏ, đường kính 2mm, mọc cách xa nhau ở kẽ những lá bắc
ngắn, mỏng. Bao hoa màu trắng, 8 nhụy (trong số đó có 3 nhụy hơi dài hơn). Bầu hoa
có 3 cạnh, 3 vòi ngắn rời nhau. Đầu nhụy hình mào gà rủ xuống. Quả 3 góc, nhẵn
bóng, đựng trong bao hoa còn lại, 3 bộ phận ngoài của bao hoa phát triển thành cánh
rộng, mỏng, nguyên. (Đỗ Tất Lợi, 2005).
2.1.3. Phân bố
Trên thế giới Hà thủ ô đỏ phân bố nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan, bắc
Lào. Ở Việt Nam chúng phân bố ở vùng có điều kiện khí hậu ẩm mát: Hà Giang, Lai
Châu, Lào Cai, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An…(Đỗ Tất Lợi, 2005).
2.2.5 Tác dụng dƣợc lý
Hà thủ ô có tác dụng hạ cholesterol huyết thanh, được chứng minh rõ trên mô
hình gây cholesterol cao ở thỏ nhà, thuốc còn có tác dụng làm giảm hấp thu cholesterol
của ruột thỏ, theo tác giả, thuốc có thành phần hữu hiệu kết hợp với cholesterol.Thuốc
2


có tác dụng phòng chống và giảm nhẹ xơ cứng động mạch.Tác dụng giảm xơ cứng
động mạch và do thuốc có thành phần Lecithin (Fnimh, 2001)

3


hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, javel… Tỉ lệ vô trùng thành
công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và khả năng xâm
nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các
bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Các dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo
vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm
là nấm và vi khuẩn (Dương Công Kiên, 2002).
2.2.2. Sự tăng sinh tế bào có định hƣớng và tái sinh cây hoàn chỉnh
Mục đích của giai đoạn này là nuôi cấy một cách định hướng các mô, tế bào, cơ
quan sau khi được khử trùng tạo ra cây hoàn chỉnh gồm các bước: tái sinh mẫu nuôi
cấy thành chồi, nhân chồi, tạo cây hoàn chỉnh (Đặng Thị Thanh Thúy, 2006).
Tái sinh mẫu nuôi cấy thành chồi: là giai đoạn tái sinh nguồn mẫu vật liệu nuôi
cấy mô ban đầu như: đỉnh sinh trưởng, đốt thân, lá, hạt, tế bào đơn…một cách có định
hướng, phát sinh trực tiếp hoặc gián tiếp ra chồi. Quá trình này phụ thuộc vào đặc
điểm di truyền của mổi loài thực vật khác nhau mà lựa chọn phương pháp xử lý phù
hợp nhưng mục đích cuối cùng đều là tạo chồi. Các phương pháp xử lý được điều
khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ hai chất điều hòa sinh trưởng là auxin và cytokinin có thể
trực tiếp tạo thành chồi hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn mô sẹo, phôi.
Nhân chồi: là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy mô vì quyết định năng
suất bởi hệ số nhân chồi. Hệ số nhân chồi là số chồi phát triển từ một chồi ban đầu sau
một thời gian nuôi cấy. Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, để tăng hệ số nhân
chồi, ta thường bổ sung vào môi trường dinh dưỡng các chất điều hòa sinh trưởng
(auxin, cytokinin, gibberellins), nước dừa, dịch chiết nấm men…
Tạo cây hoàn chỉnh: là giai đoạn phát sinh rễ cho chồi. Khi đạt được kích thước
nhất định, chồi sẽ được cấy sang môi trường tạo rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở gian
đoạn này, ta có thể bổ sung vào môi trường dinh dưỡng các chất điều hòa sinh trưởng
thuộc nhóm auxin là nhóm hormone thực vật có chức năng tạo rễ.
2.2.3. Nuôi trồng ngoài vƣờn ƣơm

axetatamit …Chức năng auxin liên kết: Là nguồn dự trữ auxin cho cây, liên kết các
đường, axit amin và các chất khác làm tăng độ bền cho auxin.
Sự biến đổi thuận nghịch của IAA tự do và IAA liên kết bị ảnh hưởng dưới tác
nhân kích thích của môi trường, góp phần điều khiển sự cân bằng auxin trong cây và
do đó điều chỉnh quá trình sinh trưởng của cây.
Sự vận chuyển auxin trong cây:
Auxin được tổng hợp ở đỉnh ngọn và được vận chuyển xuống các cơ quan phía
dưới với tốc độ vận chuyển khoảng 1cm/giờ ở rễ và thân.
Sự tổng hợp auxin trong cây:

5


Cơ quan tổng hợp auxin là đỉnh sinh trưởng ngọn. Sau đó auxin được vận
chuyển xuống phía dưới. Ngoài ra còn có 1 lượng ít auxin được tổng hợp ở: lá non,
chồi non, quả đang lớn, rễ non. Chất tiền thân tổng hợp auxin là amin tryptophan.
Sự phân hủy auxin:
Sự phân hủy auxin xảy ra khi có sự dư thừa do tổng hợp quá nhiều auxin trong
cây bằng con đường oxi hóa bằng enzym IAA-oxidaza có nhiều ở rễ, ngoài ra sự mất
hoạt tính của auxin do ánh sáng tử ngoại.
Ảnh hưỡng sinh lý của auxin đối với thực vật:
Sự phát triển phôi (development of embryo).
Sự hình thành lá (leaf formation).
Hướng động ánh sáng (phototropism).
Hướng động với lực hút của trái đất (gravitropism).
Hiện tượng ưu thế ngọn(apical dominace).
Sự phát triển trái (fruit development).
Sự rụng lá và trái (abscission).
Kích hoạt tạo và phát triển rể (root initiation and development).
Hiệu ứng tránh bóng (the shade-avoidance effect).


2.
Hình2.2 Mô tả sự ảnh hưởng của cytokinin va auxin lên tế bào thực vật nuôi cấy của
Mauseth 1995.
2.2.5. Môi trƣờng dinh dƣỡng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Sự thành công hay thất bại nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc nhiều vào
thành phần môi trường nuôi cấy có hoặc không có hormone thực vật.
Các môi trường khoáng cơ bản được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy là MS
(Murashige và Skoog,1962), B5 (Gamborg cs. 1968), hoặc White (1963).
7


2.2.5.1. Các chất khoáng
Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng.Ví dụ, Mg là một
phần của phân tử diệp lục, Ca là thành phần của màng tế bào, N là thành phần quan
trọng của amino acid, vitamin, protein và các acid nucleic.
Các môi trường khác nhau có hàm lượng và thành phần các chất khoáng khác
nhau, ví dụ thành phần và nồng độ khoáng của môi trường White hoặc Knop khá
nghèo nàn, nhưng lại rất giàu ở môi trường MS và B5.
Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy mô
và tế bào thực vật. Nitơ, lưu huỳnh, phospho là các thành phần không thể thiếu của các
phân tử protein, các acid nucleic và nhiều chất hữu cơ khác.Canxi và acid boric được
tìm thấy chủ yếu ở thành tế bào, đặc biệt là canxi có nhiệm vụ quan trọng giúp ổn định
màng sinh học. Muối khoáng còn đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm thấu
của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá của thực vật. (Mai Xuân Lương, 2005)
Trong môi trường, các muối khoáng chia thành nhóm vi lượng và đa lượng:
- Các nguyên tố đa lượng gồm 6 nguyên tố: Mg, Ca, P, S, N và K.
- Các nguyên tố vi lượng gồm: Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, Co, B, I, Ni, Cl, Al.
Nhu cầu của cây đối với các nguyên tố vi lượng là rất thấp. Do vậy những
nguyên tố này cũng có mặt trong môi trường ở các nồng độ tương ứng. Một số các

khẳng định vai trò rất quan trọng của B1 trong nuôi cấy mô. Inositol thường được nói
đến như là một vitamin kích thích một cách tích cực đối với sự sinh trưởng và phát
triển của thực vật, mặc dù nó không phải là vitamin cần thiết trong mọi trường hợp.
Các vitamin khác, đặc biệt là nicotinic acid (vitamin B3), canxi pantothenate (vitamin
B6) và biotin cũng được sử dụng để nâng cao sức sinh trưởng của mô nuôi cấy.
Vitamin ảnh hưởng lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác
nhau là khác nhau hoặc thậm chí còn có hại (gây độc). (Mai Xuân Lương, 2005)
2.2.5.4.Các điều kiện vật lý trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Ánh sáng: cần thiết cho sự phát sinh hình thái của mô cấy. Trong tạo chồi ban
đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng chỉ cần trong khoảng 1000 lux. Nhưng
trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao từ 3000 - 10000 lux để kích
thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng có khả năng quang hợp. Có
nhiều nghiên cứu về nguồn ánh sáng nhân tạo mới trong hệ thống nuôi cấy in vitro đã
chỉ ra nguồn ánh sáng và cường độ ánh sáng thích hợp cho cây in vitro phát triển tốt.
Kết quả sau 3 tuần nuôi cấy và 6 tuần tập cho cây con quen với điều kiện trong
nhà lưới đã cho thấy cây in vitro được nuôi cấy với hệ thống đèn Compact 3U thì có
biểu hiện sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với cây dưới hệ thống đèn neon (Dương
Tấn Nhựt, Mai Thị Ngọc Hương, 2006). Bên cạnh đó, việc thay thế đèn Neon bằng

9


đèn Compact 3U trong phòng nuôi cấy mô đã giảm giá thành cây giống và chi phí sản
xuất đồng thời tiết kiệm được điện năng.
Ngoài ra, để mô cấy phát triển tốt thì môi trường nuôi cấy phải thông thoáng và
có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường giữ ở 25 – 280 C.
Độ pH môi trường: pH của môi trường thường ở khoảng 5,7 - 5,8. pH thấp hơn
4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
Agar: Đối với nuôi cấy tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị chìm
và sẽchết vì thiếu oxy. Để tránh tình trạng này, môi trường nuôi cấy được làm đặc lại

2.2.6.3. Sự phát sinh các chất độc trong quá trình nuôi cấy
Trong quá trình nuôi cấy mô, hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu thường làm
sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có
chứa các hợp chất Tannin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô
non. Có vài phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu:
Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình hóa nâu hay đen,
đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalaenopsis, Cattleya và Aeridesvới
nồng độ thường dùng 0,1-0,3%. Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá trình
phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác.
Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thu phenol qua
vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loại cây trồng khác nhau.
Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi trường
ngăn chặn quá trình oxy hóa phenol, chất khử thường được dùng như ascorbic acid,
citric acid, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol, glutathione và mecaptoethanol.
Để hạn chế ảnh hưởng phenol cómột số kỹ thuật khi thao tác trên mẫu:
-Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non.
-Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng.
-Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid, citric acid vài giờ trước khi cấy.
-Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1-2 tuần.
2.2.6.4. Hiện tƣợng thủy tinh thể
Trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện tượng thủy tinh thể mẫu nuôi cấy.
Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước và tỷ lệ sống sót thấp. Dạng
này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường bán rắn, đặc biệt
khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây.
Để hạn chế quá trình thủy tinh thể, ta sẽ sử dụng phương pháp: làm giảm ảnh
hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôi cấy, tăng nồng độ đường và tạo
điều kiện môi trường nuôi (nhiệt độ, ánh sáng, trao đổi khí) thích hợp.

11


cho khả năng tái sinh cơ quan tốt là mô sẹo cứng, nhân to, tế bào chất đậm đặc, không
bào nhỏ (Vũ Văn Vụ, 1999). Ngoài ra, khi mô sẹo cấy chuyền nhiều lần sẽ làm giảm
xu thế tạo cơ quan vì cấy chuyền nhiều lần mô sẹo hình thành các tế bào đa bội, lệch
bội và có thể mất các yếu tố di truyền.
2.4. Các công trình nghiên cứu liên quan
Trên thế giới, năm 2003 Li Chang Lin và cộng tác viên đã xây dựng một quy
trình nhân giống hà thủ ô đỏ và đánh giá hàm lượng emodin và physcion trong cây
được nhân giống với cây trồng tự nhiên. Đây là nghiên cứu có giá trị quan trọng đối
với các công ty dược muốn chiết xuất hai chất này cho mục đích thương mại.
Ở trong nước, năm 2004 Trần Thị Liên đã nghiên cứu quy trình nhân giống cây
hà thủ ô đỏ bằng kỹ thuật in vitro và tiếp đó là các công trình nghiên cứu liên quan
như: sự phát sinh phôi soma từ mô sẹo lá cây hà thủ ô đỏ của Huỳnh Thị Đan San và
Võ Thị Bạch Mai vào năm 2009. Ngoài ra các nghiên cứu trong nước khác cũng
nghiên cứu về về nhân giống in vitro của Trần Thị Kim Thu năm 2008 hay Hoàng Thị
Kim Hồng vào năm 2011. Tất cả nghiên cứu trên đều có đóng góp quan trọng cho việc
nhân nhanh cây hà thủ ô đỏ cho mục đích thương mại, bảo tồn cây hà thủ ô đỏ.

13


Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm
Thí nghiệm đuợc thực hiện từ tháng 1- 2012 đến tháng 7- 2012 tại Trung tâm
ứng dụng Công nghệ sinh học Sở khoa học công nghệ tỉnh Đồng Nai.
3.2. Vật liệu
Mẫu nuôi cấy được lấy tại vườn của Trung tâm ứng dụng Công nghệ sinh học Sở
khoa học công nghệ Đồng Nai.
3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị sử dụng bao gồm: Nồi hấp khử trùng, tủ cấy, máy cất nước, máy đo
pH, cân tiểu ly, máy lạnh, máy điều hòa, máy lắc.

3.4.1. Quy trình khử trùng mẫu lá
Thí nghiệm khử trùng mẫu lá sẽ được xây dựng từ một quy trình khử trùngdo
Trung tâm ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai cung cấp.
Mẫu sau khi lấy tại vườn của trung tâm được rửa với xà phòng và nước sạch
trước khi đưa vào tủ cấy với các bước khử trùng tiếp theo:
Lắc thuốc diệt
nấm 30 phút

Lắc kháng
sinh 1 giờ

Lắc javel

Lắc cồn 70o 1
phút

Hình 3.1 Quy trình khử trùng (Thuốc diệt nấm 10 ml/l; kháng sinh 500mg/l)
Để tối ưu hóa quy trình mẫu lá sẽ được khử trùng với các nồng độ javel và thời
gian thay đổi như bảng 3.1
Bảng 3.1 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng
javel đến tỷ lệ sống của mẫu lá hà thủ ô đỏ
Nghiệm thức

Nồng độ javel

Thời gian khử trùng
(phút):

NT1


Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống trên tổng số mẫu.
Thí nghiệm 2 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm
thức với 3 lần lặp lại.
15