BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU SỰ ỔN ĐỊNH CỦA CÁC VI KHUẨN E. coli,
Salmonella, S. aureus, P. aeruginosa, C. perfringens, B. cereus
TRONG ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN ĐÔNG SÂU

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TRẦN THÙY TRANG

Niên khóa

: 2008 – 2012

Tháng 07/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU SỰ ỔN ĐỊNH CỦA CÁC VI KHUẨN E. coli,
Salmonella, S. aureus, P. aeruginosa, C. perfringens, B. cereus

Và sau cùng, con xin cảm ơn Ba, Mẹ - ngƣời đã sinh ra, nuôi dƣỡng và luôn giành
cho con những lời động viên, an ủi khi gặp khó khăn. Công ơn Ba, Mẹ con sẽ không bao
giờ quên.
Xin chân thành cảm ơn
Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng 7 năm 2011

Trần Thùy Trang

i


TÓM TẮT
Bảo quản vi sinh vật có tầm quan trọng rất đặc biệt, là nền tảng cho các nghiên cứu cơ
bản và ứng dụng liên quan đến nhiều lĩnh vực: sinh học, y học, nông nghiệp và môi trƣờng.
Trong quá trình bảo quản, các tế bào vi sinh vật sẽ bị chết, vì vậy cần tìm ra phƣơng pháp bảo
quản tối ƣu nhằm hạn chế thấp nhất khả năng chết của chúng. Hiện nay, phƣơng pháp bảo
quản đông sâu đƣợc nghiên cứu nhiều trên thế giới, đạt kết quả khá khả quan nhƣng ở Việt
Nam chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều. Sự ổn định khi bảo quản các chủng vi khuẩn qua một thời
gian dài có ý nghĩa thực tiễn rất lớn đối với các phòng thử nghiệm vi sinh thực phẩm. Vì thế,
đề tài: “Nghiên cứu sự ổn định các chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella, S. aureus, P.
aeruginosa, C. perfringens, B. cereus trong điều kiện bảo quản đông sâu” đƣợc thực hiện
nhằm thiết lập quy trình bảo quản tối ƣu cho các chủng vi khuẩn này.
Sau khi tối ƣu hóa quá trình đông sâu các yếu tố nhƣ nhiệt độ đông sâu, nhiệt độ rã
đông sẽ tiếp tục khảo sát sự ổn định lâu dài các chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella, S. aureus,
P. aeruginosa, C. perfringens, B. cereus trên các dung dịch bảo vệ khác nhau tôi đƣa ra một
số kết luận sau:
Nhiệt độ bảo quản đông sâu cho các chủng vi khuẩn khảo sát là -700C (trừ vi khuẩn S.
aureus thích hợp ở -200C). Dung dịch bảo quản tốt nhất của vi khuẩn Salmonella và P.
aruginosa là skim milk 10%; đối với vi khuẩn E.coli là hỗn hợp skim milk 10% và 10%
glycerol; đối với vi khuẩn S. aureus và B. cereus dung dịch bảo quản thích hợp là skim

Đặc điểm hình thái ....................................................................................... 3

2.1.4.

Đặc điểm nuôi cấy ....................................................................................... 3

2.1.5.

Đặc điểm sinh hóa ....................................................................................... 4

2.2. Vi khuẩn Salmonella ....................................................................................... 4
2.2.1.

Giới thiệu chung .......................................................................................... 4

2.2.2.

Phân loại khoa học ....................................................................................... 4

2.2.3.

Đặc điểm hình thái ....................................................................................... 4

2.2.4.

Đặc điểm nuôi cấy ....................................................................................... 4

2.2.5.

Đặc điểm sinh hóa ....................................................................................... 5


Tính chất sinh hóa. ...................................................................................... 7

2.4. Vi khuẩn B. cereus .......................................................................................... 7
2.4.1.

Giới thiệu về vi khuẩn B. cereus. ................................................................. 7

2.4.2.

Phân loại khoa học ....................................................................................... 7

2.4.3.

Đặc điểm và tính chất nuôi cấy vi khuẩn B. cereus ....................................... 7

2.4.4.

Đặc điểm sinh hóa ....................................................................................... 8

2.5. Vi khuẩn P. aeruginosa .................................................................................. 8
2.5.2.

Giới thiệu chung .......................................................................................... 8

2.5.2.

Phân loại khoa học ....................................................................................... 8

2.5.3.


Phƣơng pháp giữ giống trên môi trƣờng thạch có lớp dầu khoáng ............... 10

2.7.3.

Giữ giống vi sinh vật trên đất, cát và trên hạt ............................................. 11

2.7.4.

Bảo quản vi sinh vật bằng phƣơng pháp đông khô ...................................... 11

2.7.5.

Phƣơng pháp bảo quản đông sâu (hay lạnh sâu).......................................... 12

2.8. Tình hình nghiên cứu về việc bảo quản đông sâu các chủng vi khuẩn ............ 13
2.8.1.

Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc. .............................................................. 13

2.8.2.

Tình hình nghiên cứu trong nƣớc. .............................................................. 14

Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 15
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 15

v



3.3.1.2.

Cấy mẫu bằng phƣơng pháp đổ đĩa. ........................................................ 16

3.3.1.3.

Đếm vi khuẩn bằng phƣơng pháp cấy trang ............................................. 17

3.3.1.4.

Cách tính kết quả khuẩn lạc .................................................................... 17

3.3.2.

Phƣơng pháp tối ƣu hóa quá trình đông sâu các vi khuẩn ............................ 18

3.3.2.1.

Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đông sâu lên mật số vi khuẩn ............... 18

3.3.2.2.

Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ rã đông sau bảo quản lên mật số vi khuẩn ... 19

3.3.3.

Phƣơng pháp khảo sát sự ổn định lâu dài vi khuẩn trên các dung dịch bảo quản .... 20

3.3.4.


Tối ƣu hóa quá trình bảo quản đông sâu Salmonella ................................... 26

4.1.3.

Tối ƣu hóa quá trình bảo quản đông sâu S. aureus ....................................... 27

4.1.4.

Tối ƣu hóa quá trình bảo quản đông sâu B. cereus ....................................... 28

4.1.5.

Tối ƣu hóa quá trình bảo quản đông sâu P. aeruginosa ................................ 30

vi


Tối ƣu hóa quá trình bảo quản đông sâu C. perfringens................................ 31

4.1.6.
4.2

Khảo sát sự ổn định lâu dài các vi khuẩn trên các dung dịch bảo quản ........... 32

4.2.1.

Khảo sát sự ổn định vi khuẩn E. coli ........................................................... 32

4.2.2.


TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 42
PHỤ LỤC .............................................................................................................. 44

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
GMO:

Genetically modified organism

XLD:

Xylose lysine deoxycholate

HE:

Hektoen enteric

BS:

Bismuth sulfite

BPLS:

Brilliant-green Phenolred Lactose Sucrose

BP:

Baird - Parker


Potato Glucose Carot

TSC:

Tryptose Sulfide Cycloserin

TBX:

Tryptone Bile X-Glucuronide

CFU:

Colony Forming Unit

viii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn E. coli ...................................................... 25
Bảng 4.2 Khảo sát nhiệt độ rã đông vi khuẩn E. coli......................................................... 26
Bảng 4.3 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn Salmonella ............................................... 26
Bảng 4.4 Khảo sát nhiệt độ rã đông vi khuẩn Salmonella ................................................. 27
Bảng 4.5 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn S. aureus .................................................. 27
Bảng 4.6 Khảo sát nhiệt độ rã đông vi khuẩn S. aureus .................................................... 28
Bảng 4.7 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn B. cereus .................................................. 29
Bảng 4.8 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn B. cereus .................................................. 29
Bảng 4.9 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn P. aeruginosa ........................................... 30
Bảng 4.10 Khảo sát nhiệt độ rã đông vi khuẩn P. aeruginosa ........................................... 30

Hình 4.4 Biểu đồ khảo sát sự ổn định lâu dài B. cereus
trên 4 dung dịch bảo vệ ...................................................................................................... 34
Hình 4.5 Biểu đồ khảo sát sự ổn định lâu dài P. aeruginosa
trên 4 dung dịch bảo vệ ...................................................................................................... 35

x


Hình 4.6 Biểu đồ khảo sát sự ổn định lâu dài C. perfringens
trên 3 dung dịch bảo vệ ...................................................................................................... 36
Hình 4.7 Biểu đồ khảo sát sự ổn định lâu dài C. perfringen
trên môi trƣờng nƣớc mắm .................................................................................................. 36
Hình 4.8 Vi khuẩn E. coli, Salmonella, S. aureus, P. aeruginosa,
C. perfringens , B. cereus trên môi trƣờng đặc trƣng. ........................................................ 38
Hình 4.9 Phản ứng đông huyết tƣơng ................................................................................ 38
Hình 4.10 Các thử nghiệm sinh hóa của vi khuẩn Salmonella. ......................................... 39
Hình 4.11 Các thử nghiệm sinh hóa vi khuẩn C. perfringens. .......................................... 39
Hình 4.12 Các thử nghiệm sinh hóa của vi khuẩn P. aeruginosa ..................................... 40
Hình 4.13 Các thử nghiệm sinh hóa của vi khuẩn B. cereus. ............................................ 40

xi


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Vi sinh vật phân bố ở khắp mọi nơi trên trái đất và rất đa dạng về chủng loài. Tuy

nhỏ bé nhất trong sinh giới nhƣng năng lực hấp thu và chuyển hóa của vi sinh vật vƣợt xa

pháp thử nghiệm (phát hiện các thông số giới hạn phát hiện, độ tái lập, độ lặp lại,…)
nhằm đảm bảo kết quả thử nghiệm đƣợc chính xác.
Hiện nay, số lƣợng vi sinh vật tƣơng đối lớn, thời gian thực hiện đề tài ngắn nên chỉ
nghiên cứu trên các đối tƣợng chính là E. coli, Salmonella, S. aureus, P. Aeruginosa, C.
perfringens , B. cereus. Đây là các chủng vi sinh vật đƣợc sử dụng phổ biến trong phòng
thử nghiệm.
Xuất phát từ những lý do trên, đƣợc sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Sinh học,
Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM và sự cho phép của Ban lãnh đạo Trung Tâm Kỹ
Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lƣờng Chất Lƣợng 3 hiện đề tài “Nghiên cứu sự ổn định các chủng
vi khuẩn E. coli, Salmonella, S. aureus, P. aeruginosa, C. perfringens, B. cereus trong
điều kiện bảo quản đông sâu” đƣợc tiến hành thực hiện.
1.2.

Yêu cầu
Thiết lập quy trình bảo quản tối ƣu E. coli, Salmonella, S. aureus, P. aeruginosa, C.

perfringens , B. cereus ở điều kiện đông sâu đồng thời khảo sát sự ổn định của chúng qua
các mốc thời gian bảo quản lâu dài.
1.3.

Nội dung thực hiện
Tối ƣu hóa quá trình đông sâu: khảo sát nhiệt độ bảo quản và nhiệt độ rã đông sau

bảo quản của các chủng vi khuẩn khảo sát.
Khảo sát sự ổn định lâu dài vi khuẩn trên các dung dịch bảo quản khác nhau: khảo
sát độ ổn định của E. coli, Salmonella, S. aureus, P. aeruginosa, C. perfringens , B. cereus
trong bảo quản đông sâu trên các dung dịch bảo quản khác nhau. Thử nghiệm đặc tính
sinh hóa của các chủng.

2

E. coli là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi, phát triển ở nhiệt độ từ 5 - 440C,
thích hợp nhất ở 370C và pH (7,2 – 7,4), phát triển dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy
thông thƣờng. Trên môi trƣờng thạch thƣờng có khuẩn lạc dạng S (nhẵn bóng, bờ đều),
đôi khi hình thành khuẩn lạc dạng R (nhăn nheo) hoặc dạng M (nhày). Trên môi trƣờng
lỏng, E. coli làm đục môi trƣờng sau 4 – 5 giờ. Trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng NA

3


(Nutrient agar) hay TSA (Trypticase soy agar) tạo khóm tròn ƣớt màu trắng đục nếu để
lâu khóm sẽ nhăn nheo. Khóm có kích thƣớc 2 - 3 mm.
2.1.5. Đặc điểm sinh hóa
E.coli lên men đƣờng lactose, có phản ứng Indole dƣơng tính, VP âm tính, Methy
Red Voges-Proskauer dƣơng tính, kiểm tra trên môi trƣờng thạch simmon citrate âm tính
(Lê Văn Việt Mẫn và Lại Mai Hƣơng, 2011).
2.2.

Vi khuẩn Salmonella

2.2.1. Giới thiệu chung
Salmonella thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột đƣợc phát hiện từ năm 1885 do
Salmon tại Mỹ. Salmonella thƣờng xuyên sinh sống trong đƣờng ruột của ngƣời và một số
động vật. Chúng gây ra các bệnh nhƣ sốt thƣơng hàn, viêm ruột, nhiễm khuẩn huyết.
2.2.2. Phân loại khoa học
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Giống: Salmonella

mannitol sinh acid nhƣng không lên men saccharose và lactose, không sinh indole, không
phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều
sinh H2S (Trần Linh Thƣớc, 2006).
2.2.6. Đặc điểm kháng nguyên của Salmonella
Salmonella có 3 loại kháng nguyên. Kháng nguyên O là kháng nguyên thân ở vách
tế bào vi khuẩn, bản chất là lipopolysaccharide, có tính kháng nguyên mạnh và đặc hiệu.
Đây cũng chính là nội độc tố của Salmonella. Kháng nguyên O của các chủng rất khác
nhau. Kháng nguyên H là kháng nguyên lông của vi khuẩn, có bản chất là một protein
kém chịu nhiệt, dễ bị phá hủy bởi cồn nhƣng chịu đƣợc formalin 5%. Kháng nguyên Vi là
kháng nguyên bề mặt của vi khuẩn, chúng bao bọc bề ngoài kháng nguyên O. Vì vậy,
chúng cản trở quá trình thực bào và ngăn chặn hoạt động của bổ thể. Ở những chủng mà
kháng nguyên Vi phát triển, nó thƣờng ức chế quá trình ngƣng kết của kháng nguyên O.
Có 2 chủng có kháng nguyên Vi là S. typhi và S. paratyphi (Nguyễn Thị Chính và Trƣơng
Thị Hòa, 2005).
2.2.7. Đặc điểm sinh hóa
Vi khuẩn Salmonella có khả năng di động, không tạo bào tử, lên men glucose và
mannitol sinh acid nhƣng không lên men saccharose và lactose, không sinh indole, không

5


phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine trừ tryptophane, hầu hết các chủng
đều sinh H2S (Trần Linh Thƣớc, 2006).
2.3.

Vi khuẩn S. aureus

2.3.1. Giới thiệu chung
S. aureus là vi khuẩn phân bố khắp nơi, nhƣng chủ yếu phân lập từ da, màng nhầy
của ngƣời và động vật máu nóng. Đây là một vi khuẩn đƣợc xem là khá nguy hiểm vì

2.3.5. Tính chất sinh hóa
S. aureus có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+), có khả
năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Một số dòng có khả năng tan
máu trên môi trƣờng thạch máu. Đƣờng kính vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng
nhƣng đều nhỏ hơn đƣờng kính của khuẩn lạc (Trần Linh Thƣớc, 2006).
2.4.

Vi khuẩn B. cereus

2.4.1. Giới thiệu về vi khuẩn B. cereus
B. cereus cũng là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có mặt khắp nơi. Vi khuẩn này có
khả năng gây viêm ruột (vi khuẩn S. aureus cũng có khả năng gây viêm dạ dày ruột). Ngƣời
bị phơi nhiễm vi khuẩn có thể bị viêm ruột trong vòng 1 đến 6 giờ, và dẫn đến tiêu chảy, ói
mửa, và đau bụng trong vòng 6 đến 24 giờ. Ở Mĩ, cơm chiên đƣợc xem là một trong những
nguyên nhân hàng đầu của nhiễm vi khuẩn B. cereus (Nguyễn Văn Tuấn, 2008).
2.4.2. Phân loại khoa học
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp:Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceaem
Chi:Bacillus
Loài: B. cereus
(Garrity và ctv, 2004)

Hình 2.4 Vi khuẩn B. cereus dƣới kính
hiển vi (www.sciencephoto.com)

2.4.3. Đặc điểm và tính chất nuôi cấy vi khuẩn B. cereus
B. Cereus là những trực khuẩn, Gram dƣơng, hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, di động,

Hình 2.5 Vi khuẩn P. aeruginosa dƣới
kính hiển vi (www.lisando.com)

2.5.3. Đặc điểm vi khuẩn P. aeruginosa
Vi khuẩn P. aeruginosa là trực khuẩn gram âm, hình que, kích thƣớc 0,6 x 2 μm có
khả năng di động nhờ một tiêm mao đơn cực, không bào tử, đứng một mình hay thành đôi
hoặc kết hợp thành chuỗi ngắn. Đây là vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối, nhƣng P. aeruginosa
có thể phát triển trong môi trƣờng kỵ khí nếu có NO3 làm chất nhận điện tử (Nguyễn
Quốc Tuấn, 2009).
2.5.4. Tính chất nuôi cấy
Vi khuẩn hiếu khí, mọc dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng nhƣ
thạch dinh dƣỡng, thạch máu, canh thang, nhiệt độ thích hợp 30 - 370C, nhƣng có thể phát
triển đƣợc ở 410C, pH thích hợp là 7,2 - 7,5 nhƣng có thể phát triển đƣợc ở pH 4,5 - 9,0.

8


Khuẩn lạc thƣờng lớn, trong, bờ đều hoặc không đều, có thể có ánh kim loại, màu xám
nhạt trên nền môi trƣờng màu hơi xanh, mùi thơm (Hoàng Thế Hƣng, 2010).
Một đặc điểm khác của P. aeruginosa so với các loài Pseudomonas là sự sản xuất
sắc tố hòa tan gồm 2 loại là pyoverdine và pyocyanine. Pyoverdine là sắc tố phát huỳnh
quang màu xanh vàng khi đƣợc kích thích bởi bƣớc sóng thấp hơn 260 nm. Sắc tố này
đƣợc tạo ra trong môi trƣờng có nồng độ sắt thấp, dễ khuếch tán và có chức năng trong cơ
chế trao đổi sắt của vi khuẩn. Pyocyanine là sắc tố có màu xanh ở pH trung tính hay kiềm,
màu đỏ trong môi trƣờng acid. Sắc tố này là yếu tố tạo màu xanh trong mủ xanh là đặc
tính gây bệnh bởi P. aeruginosa (Trần Linh Thƣớc, 2009).
2.5.5. Đặc điểm sinh hóa
Một số đặc tính sinh hóa chính của P. aeruginosa nhƣ: không lên men glucose, có
khả năng thủy giải gelatin, tinh bột, khử nitrate (+), oxidase (+), ADC (+), khử nitrate (+),
sử dụng citrate (+), sử dụng malonate (+) (Trần Linh Thƣớc, 2009).

ở gần một đầu tế bào hình gậy. Nha bào của C. perfringens dễ đề kháng với nhiệt độ (Lê
Văn Việt Mẫn và Lại Mai Hƣơng, 2011; Trịnh Xuân Nhất, 2008).
2.7.

Giới thiệu một số phƣơng pháp bảo quản vi sinh vật

2.7.1. Phƣơng pháp cấy truyền vi sinh vật
Đây là phƣơng pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật đƣợc cấy trên môi trƣờng
thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện
thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng vi sinh vật này đƣợc chuyển đến nơi
bảo quản có nhiệt độ thích hợp. Quá trình này đƣợc lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm
bảo chủng vi sinh vật luôn đƣợc chuyển đến môi trƣờng mới trƣớc khi già và chết.
2.7.2. Phƣơng pháp giữ giống trên môi trƣờng thạch có lớp dầu khoáng
Phƣơng pháp này đƣợc Lumiere và Chevrotier tìm ra năm 1914, ứng dụng các
chủng dễ, nhƣ số lớn các vi khuẩn và nấm men cũng nhƣ tảo và nguyên sinh động vật.
Lúc đầu chỉ dùng với các chủng gây bệnh, ngày nay phƣơng pháp này đƣợc dùng trong kỹ
thuật vi sinh (Lƣơng Đức Phẩm, 1998).
Giống trên môi trƣờng thạch nghiêng thƣờng đƣợc bảo quản ở 4 - 50C. Ở điều kiện
này vẫn xảy ra hiện tƣợng mất nƣớc của môi trƣờng làm cho môi trƣờng khô dần và giống
có thể bị chết. Để khắc phục hiện tƣợng khô môi trƣờng ngƣời ta làm cách mặt thạch với
không khí bằng một lớp dầu khoáng (parafin, vazơlin hoặc các chất keo y học) (Lƣơng
Đức Phẩm, 1998).
Môi trƣờng đƣợc phủ một lớp dầu parafin dầy khoảng 10 mm. Lớp dầu này làm cho
nƣớc không bay hơi nên các chất hòa tan không thay đổi, do đó áp lực thẩm thấu cũng
không đổi nên không gây nguy hại đến đời sống của vi sinh vật. Mặt khác, lớp dầu chỉ
cho phép oxy của không khí thấm rất chậm vào môi trƣờng và việc cấy lại chủng không
kéo theo sự phá hủy chủng giống nguyên thủy. Những chủng đã xử lý đƣợc giữ trong tủ
lạnh ở nhiệt độ 50C và có thể bảo quản nhiều năm.

10

trọng cần đƣợc quan tâm khi thực hiện phƣơng pháp này là: Tuổi của vi sinh vật bảo

11


quản, thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật, tốc độ đông khô thấp nhất, nhiệt độ
đông khô thấp nhất, khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu.
Phƣơng pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lƣợng lớn mẫu. Thông
thƣờng theo phƣơng pháp này, vi sinh vật đƣợc bảo quản từ 10 - 20 năm. Nói chung, cả
hai phƣơng pháp này có nhiều ƣu điểm hơn so với các phƣơng pháp khác nhƣ thời gian
bảo quản lâu hơn, tiết kiệm đƣợc công sức, giảm sai sót nhãn mác và tạp nhiễm. Tuy
nhiên nhƣợc điểm lớn nhất phƣơng pháp này là giá thành thiết bị. Độ ổn đinh của các
chủng vi sinh vật theo các đợt đông khô là khác nhau. Hơn thế nữa, các chủng trƣớc khi
đem ra sử dụng phải đƣợc hoạt hóa trên môi trƣờng thích hợp một số lần để phục hồi các
đặc tính sinh học.
2.7.5. Phƣơng pháp bảo quản đông sâu (hay lạnh sâu)
Phƣơng pháp bảo quản đông sâu là phƣơng pháp vi sinh vật đƣợc bảo quản trong
môi trƣờng dịch thể và nƣớc cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ
đông sâu (-1960C -> -200C). Trong trƣờng hợp giữ giống ở nhiệt độ 4 - 60C bình thƣờng
thì không tránh khỏi sự phân chia tế bào. Sự phân chia tế bào chỉ dừng lại ở trƣờng hợp
lạnh đông hoặc sấy khô.
Phƣơng pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau nhƣ
nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut.
Tuy nhiên, với phƣơng pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và
làm tan mẫu. Nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải
trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nƣớc đá trong tế bào. Vì vậy, để khắc
phục nhƣợc điểm này, trƣớc khi làm đông sâu ta trộn sinh khối của giống cần bảo quản
với dung dịch bảo vệ (hay còn gọi là dung dịch nhũ hoá) nhƣ glycerin 15%, huyết thanh
ngựa, dung dịch glucose, lactose 10% hay skim milk 10%. Để hạn chế việc vi sinh vật
có thể bị chết, ngoài dung dịch bảo quản trên cần phải quan tâm đến các thông số nhƣ: