TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH HỌC THỦY SẢN
HỒ NGỌC THI
NGHIÊN CỨU SỰ KHÁNG THUỐC CỦA
NHÓM VI KHUẨN Aeromonas spp, Vibrio spp
TRONG MÔI TRƯỜNG AO NUÔI CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) THÂM CANH
Ở CẦN THƠ VÀVÙNG NƯỚC LỢ TỈNH TRÀ VINH
VÀ BẾN TRE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN
Vibrio spp trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)
thâm canh ở Cần Thơ, và vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh, Bến Tre. Vi khuẩn
Aeromonas spp trong môi trường (nước, bùn) được phân lập trên môi trường
GSP-Agar và Vibrio spp trên môi trường TCBS.
Kết quả kháng sinh đồ cho thấy Cần Thơ có nhiều vi khuẩn Aeromonas
spp kháng thuốc hơn tỉnh Trà Vinh và Bến Tre: 3/9 chủng kháng với SM, TE,
SXT; 2/9 chủng kháng với DO, không có chủng vi khuẩn nào kháng với CHL,
đồng thời Aeromonas spp đa kháng chiếm 3/9 chủng. Trong đó 1 chủng kháng
với SXT-DO-TE-SM, 1 chủng kháng với SXT-DO-TE và 1 chủng kháng với
SXT- SM. Tỉnh Trà Vinh có 2/9 chủng đa kháng thuốc (một chủng kháng
CHL-SM, một chủng kháng SXT-TE), vi khuẩn Aeromonas spp kháng với
CHL, SXT, DO, TE có cùng số lượng 1/9 chủng, 3/9 chủng kháng với SM.
Bến Tre có số lượng vi khuẩn kháng, đa kháng thuốc tương đương với tỉnh Trà
Vinh: 2/8 chủng đa kháng (1chủng kháng DO-TE, 1 chủng kháng SXT-SM),
vi khuẩn kháng thuốc SXT, DO, TE có cùng số lượng: 1/8 chủng, 5/8 chủng
kháng với SM và không có chủng nào kháng với CHL. Riêng các chủng
Vibrio spp tại Trà Vinh, Bến Tre có 9/11 chủng kháng với SM và không có
chủng nào kháng với CHL, SXT, DO, AM, TE.
Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các chủng vi khuẩn khảo
sát khá cao. Đối với SM có giá trị: 16-64 µg/ml, CHL là 1-32 µg/ml, OXT:
0,125- 64 µg/ml. Riêng chủng Vibrio spp VBT0930 với nồng độ thuốc OXT
là: 0,125 µg/ml rất thấp so với các chủng Aeromonas spp (32-64 µg/ml).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iii
MỤC LỤC
PHẦN I: GIỚI THIỆU 1
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản 3
4.2.4 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Vibrio spp ở Trà Vinh và Bến
Tre 27
4.3 Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh lên vi khuẩn 29
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iv
5.1 Kết luận 32
5.2 Đề xuất 32
PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 34
PHỤ LỤC 37 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
v
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 4.1 : Tính đa kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp ở Cần Thơ 23
Bảng 4.2: Tính đa kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp ở Trà Vinh 26
Bảng 4.3 : Tính đa kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp ở Bến Tre 27
Bảng 4.4 : Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 30
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
vi
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật
và con người………………………………………………………………… 4
Hình 4.1: Đĩa phân lập Aeromonas spp màu vàng (mũi tên) trên môi trường
GSP (a) , cấy Aeromonas spp trên môi trường GSP (b)…………………… 21
Hình 4.2: Hình đĩa kháng sinh đồ chủng Aeromonas spp ở Cần Thơ……… 22
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
vii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long
AM: ampicillin
CHL: chloramphenicol
DO: doxycyclin
FT: nitrofurantion
NA: nalidixic
NFXC: norfloxcin
OXLA: oxolinic acid
OXT: oxytetracyclin
SM: streptomycin
SMX: sulfamethoxazol
SXT: trimethoprim + sulfamethoxazol
TE: tetracyclin
TMP: trimethoprim
R: kháng
I: trung bình nhạy
S: nhạy
dụng kháng sinh bừa bãi trong nuôi trồng thuỷ sản có thể gây ra nhiều vấn đề
nghiêm trọng như gây độc, biến đổi hệ vi khuẩn ở người tiêu dùng
(www.nhanong.net).
Thực trạng cho thấy, việc sử dụng thuốc kháng sinh trong thủy sản
không chỉ phổ biến ở ĐBSCL nói riêng, Việt Nam nói chung mà còn diễn ra ở
nhiều nước trên thế giới. Đây là vấn đề đáng quan tâm và đã được nhiều nhà
khoa học nghiên cứu (Phuong et al., 2005; Le et al., 2005; Sarter et al., 2006;
Dung et al., 2008).
Do nhu cầu của thị trường, nhu cầu cải thiện đời sống, chuyển đổi đối
tượng nuôi của các vùng nhằm hạn chế những rủi ro dịch bệnh cho đối tượng
nuôi của người dân. Hiện tại cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đã được
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
2
nuôi khá phổ biến ở các vùng nước lợ. Song song với những việc làm này thì
việc sử dụng thuốc kháng sinh của người dân là vấn rất quan trọng cần được
quan tâm. Việc sử dụng thuốc kháng sinh không đúng cách sẽ tạo ra nhiều
chủng vi khuẩn kháng thuốc, tạo nên một mối nguy hiểm tiềm tàng. Theo
Kruse (1994) và Prescott et al., (2000) các gen kháng thuốc từ vi khuẩn liên
quan đến động vật nuôi sẽ được truyền sang vi khuẩn liên quan đến người qua
chuỗi thức ăn hoặc qua tiếp xúc trực tiếp (được thể hiện qua hình 2.1) và tác
động đến khả năng kháng thuốc của các chủng vi khuẩn ở người . Xuất phát từ
những vấn đề trên cho thấy việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự kháng
thuốc của nhóm vi khuẩn Aeromonas spp, vibrio spp trong môi trường ao
nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh ở Cần Thơ và
vùng nước lợ tỉnh Trà vinh, Bến Tre” là rất cần thiết.
Mục tiêu
Đánh giá, sự kháng thuốc của hai nhóm vi khuẩn Aeromonas spp và
Vibrio spp trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)
thâm canh ở Cần Thơ và vùng nước lợ Trà Vinh, Bến Tre. Từ đó có cách nhìn
thụ hoặc kháng sinh đã được vật nuôi hấp thụ và đào thải ra môi trường.
Lượng kháng sinh này sẽ theo nguồn nước lan toả ra môi trường xung quanh,
một phần nhỏ sẽ hoà tan trong nước, nhưng một phần lớn lại lắng động cùng
với các chất trầm tích gây tác động đến môi trường sinh thái và đe doạ sức
khoẻ con người. Theo Rosenthal (1989) đã thông báo rằng, để sản xuất
120.000 tấn cá hồi, người ta phải dùng 1800 kg kháng sinh, trong đó ước tính
cơ thể cá chỉ hấp thụ tối đa khoảng 20-30% số thuốc, còn lại 70-80% số thuốc
đã dùng được đào thải ra môi trường. Cravedi (1987) đã xác định được rằng,
chỉ có khoảng 7-9% khối lượng kháng sinh oxytetracycline đã dùng được cá
hấp thu, còn lại 90% sẽ đào thải ra môi trường. Trong khi đó kháng sinh
oxytetracycline được dùng phổ biến trong nuôi trồng thuỷ sản ở khắp thế giới,
chủ yếu bằng phương pháp trộn thuốc vào thức ăn. Hanse (1992) đã thông
báo: dư lượng kháng sinh trong chất trầm tích có thể giảm 40-50% mật độ vi
khuẩn ở nền đáy, và giảm tới 90% hàm lượng phosphate trong chất trầm tích
(trích dẫn bởi Đỗ Thị Hoà và ctv, 2004).
Theo Prescott et al., (2000) tính kháng thuốc của vi khuẩn trên vật nuôi
có thể truyền sang vi khuẩn liên quan với con người bằng nhiều con đường
khác nhau. Những đối tượng có nguy cơ bị nhiễm các vi khuẩn kháng thuốc
cao là: công nhân lò mổ, người chế biến thức ăn và đặc biệt là người nông dân
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
4
trực tiếp cho vật nuôi ăn thuốc kháng sinh thì có khả năng nhiễm vi khuẩn
kháng thuốc nhiều hơn những người bình thường. Khả năng truyền tính kháng
thuốc có thể được thực hiện thông qua chuỗi thức ăn hoặc qua tiếp xúc trực
tiếp.
Hình 2.1: Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật và con người (Prescott
et al., 2000)
Tóm lại: dùng thuốc kháng sinh là sử dụng con dao hai lưỡi. Nếu biết
rõ tính chất, tác dụng, dùng đúng bệnh, đúng liều, đúng cách, nó giúp con
Lò
mổ
Th
ịt
Ngư
ời
tiêu
th
ụ
Ti
ếp xúc trực
Chế
biến
Ph
ế
Nguồn
nước, chất
thải nông
tr
ại
Nư
ớc uống
HỆ THỰC VẬT
Rau
Cây ăn quả
Nư
V
ật nuôi trong
P
h
ế phẩm
Ngu
ồn n
ư
ớc ,
chất thải của
nông trại
V
ật nuôi trong
nhà
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5
(APAB) là một tiền chất của acid folic mà vi khuẩn cần được cung cấp để tổng
hợp các chất purin, pyrimidin, thymin, làm ức chế sự tổng hợp purin, thymin
làm cho sự phân bào và tổng hợp protein khó thực hiện được (Bùi Kim Tùng,
2001). Một số vi khuẩn chủng kháng thuốc là do không sử dụng APAB, hoặc
tự thích ứng để không cần sử dụng APAB nữa. Ngoài ra sự nhiểm plasmid
cũng dẩn đến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn.
Trong nuôi trồng thuỷ sản hiện nay thường dùng
sulfamethoxazole,…và ở dạng kết hợp với trimethoprim để trị các bệnh như:
đỏ mỏ, viêm ruột, xuất huyết, đốm đỏ, trắng đuôi do vi khuẩn Vibrio gây ra
trên cá (Lê Thị Kiêm Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc, 2006; Đỗ Thị Hoà và
chuyển và ribosom 50S. Chloramphenicol thường có tác dụng kiềm khuẩn
nhưng có thể diệt khuẩn ở nồng độ cao hoặc đối với những vi khuẩn nhạy cảm
cao. Vi khuẩn lờn thuốc là do tiết ra acety transferaz làm chloramphenicol mất
hoạt tính. Hiện nay trên thế giới và ở Việt Nam đã ban hành luật cấm sử dụng
chloramphenicol vì nếu dùng thường xuyên để trị bệnh cho động vật sẽ rất
nguy hiểm cho chúng, thuốc có khả năng tồn lưu cao trong các sản phẩm thức
ăn của con người (Lê Thị Kim Liên và ctv, 2006).
Florfenicol là kháng sinh thế hệ mới nhất của nhóm Phenicol, có hiệu
quả trong điều trị các bệnh do vi khuẩn Gram âm, Gram dương
(www.laocai.gov.vn).
2.2.5 Nhóm aminosid
Là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng đối với hầu hết vi khuẩn
gram (-) và một số vi khuẩn gram (+) hiếu khí, ít tác dụng đối với vi khuẩn kỵ
khí vì Aminosid thấm qua màng tế bào vi khuẩn một phần nhờ hệ thống vận
chuyển hoạt động phụ thuộc vào oxygen nên vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối không
chịu tác động của Aminosid. Aminosid là kháng sinh diệt khuẩn, chúng ức chế
tổng hợp protein, (Trần Thị Thu Hằng, 2006). Streptomycin là loại thuốc
thường được dùng trong thuỷ sản. Bệnh chướng bụng đầy hơi do nhiễm khuẩn
ở cá, ếch, baba, tôm có thể dùng kháng sinh Aminosid trộn vào thức ăn cho ăn
(Lê Thị Kim Liên và ctv, 2007).
2.2.6 Nhóm trimethoprim
Trimethoprim có tác dụng kìm khuẩn, ức chế enzyme dihydroflolate-
reductase của vi khuẩn, thường phối hợp với sulfamethoxazole. Thuốc hấp thu
nhanh và hoàn toàn qua đường tiêu hoá, đào thải chủ yếu qua thận và phần lớn
dưới dạng không đổi (www.thuocbietduoc.com.vn). Theo Nguyễn Phước
Tương và Trần Diễm Uyên (2000) Trimethoprim là nhóm kháng khuẩn tổng
hợp tương tự như kháng sinh. Trimethoprim có tác dụng diệt khuẩn đối với
các vi khuẩn gram (-) và gram (+), đặc biệt rõ nét trên E. coli, Salmonella,
Shigella, Enterobactera, Citrobacter và cầu ký trùng Eimeria …
2.3 Vi khuẩn Aeromonas spp và Vibrio spp
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2006) một nhóm vi khuẩn thuộc
giống Vibrio spp đã gây thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm công nghiệp ở
Philippin, Ấn Độ và Indonesia là nhóm vi khuẩn phát sáng. Bệnh phát sáng do
một số vi khuẩn có khả năng phát sáng gây ra như Vibrio harveyi, V.
splendida, V. orientalis, V. ifscheri, V. vulnificus. Ở Việt Nam, những dạng
nhiễm vi khuẩn phát sáng thường thấy ở trại sản xuất hoặc ương tôm giống.
Khi vi khuẩn phát sáng hiện trong cơ thể tôm với số lượng lớn có thể làm tôm
nhiễm bệnh phát sáng trong bóng tối. Vibrio phát sáng có thể phát thành dịch
và gây chết đến 100% ấu trùng tôm, tôm giống và kể cả tôm trưởng thành.
Do có đặc điểm tương tự nhau nên lúc đầu giống Aeromonas spp và
Vibrio spp nằm chung họ Vibrionaceae. Giữa thập niên 80 Aeromonas spp lại
được tách ra một họ riêng là Aeromonadaceae (Horneman và Mori, 2007) do
Aeromonas spp không nhạy với phản ứng O/129 (150µg) (ngoại trừ A.
caviae). Theo Barrow và Feltham (1993) Aeromonas spp được chia thành 2
nhóm dựa trên khả năng di động và ngưỡng nhiệt độ phát triển của chúng.
Nhóm vi khuẩn A. hydrophila, A. sobria và A. caviae có các đặc điểm là có
khả năng di động, 2 đầu hơi tròn, Gram âm, hình que ngắn, hiếu khí không bắt
buộc, phát triển được ở 37
o
C. Nhóm thứ hai A. salmonicida (3 loài phụ gồm:
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
8
A. salmonicida, A. achromogenes và A. nova) có đặc điểm tương tự nhưng
chúng chỉ phát triển tốt nhất ở 22
o
C hoặc thấp hơn và không có tiêm mao cũng
như chúng không có khả năng di động (trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008).
Trong báo cáo về dịch bùng phát bệnh của Sanarelli (1891) nhóm gây
bệnh thường gặp là A. hydrophila, A. caviae, A. sobria được phát hiện đầu tiên
trường bị nhiễm bẩn hay các yếu tố môi trường không ổn định cũng gây ảnh
hưởng sức khoẻ của tôm. Tôm mới bị bệnh thường yếu hoạt động chậm chạp
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
9
và nằm yên ở đáy ao, kém ăn hoặc bỏ ăn. Trên các phần phụ như (râu, chân
bò, chân bơi và đuôi), vỏ có các vết ăn mòn chuyển từ màu nâu sang đen và
các phần phụ cụt dần. Phía trong vỏ kitin của mang có đốm đen (Bùi Quang
Tề, 2003)
2.4 Một số nghiên cứu về mật độ vi khuẩn tổng cộng trong môi trường
nước
Theo Tô Công Tâm (2002) mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước ao
nuôi cá tra vào những tháng lũ tại 3 tỉnh Đồng Tháp, Cần Thơ An Giang. Vi
khuẩn tổng cộng trong nước ở tháng 8, tháng 10, tháng 11 và tháng 12 là :
187,2x10
3
; 1237,5x10
3
; 259,5x10
3
; 223,2x10
3
(CFU/ml). Tương tự ở An
Giang là: 267,5x10
3
; 341,3x10
3
; 385,7x10
3
; 223,1x10
1,5x10
3
- 43,5x10
3
CFU/ml) và nhỏ nhất lại là ao thải (dao động từ 1,05x10
3
–
23,5x10
3
CFU/ml).
2.5 Một số nghiên cứu về sự kháng thuốc của các vi khuẩn trong nuôi
thuỷ sản
Theo nghiên cứu của Trần Thị Tuyết Hoa và ctv (2004) về thành phần
loài và khả năng gây bệnh của nhóm vi khuẩn Vibrio phân lập từ hệ thống
ương tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) ở trại sản xuất giống Khoa
Thuỷ Sản-Trường Đại Học Cần Thơ và Long Mỹ-Cần Thơ đã có 50 chủng vi
khuẩn Vibrio được định danh với 4 nhóm loài chủ yếu: Vibrio choleerae (31
chủng), Vibrio alginolyticus (10 chủng), Vibrio carchriae (5 chủng) và Vibrio
mimicus (4 chủng). Các chủng vi khuẩn này đều cho kết quả nhạy với các
kháng sinh gentamicin, tetraciline, nalidix-Sav, chlortetracylin, neomycin,
oxytetracylin. Bên cạnh đó, một số kháng sinh cũng có khả năng kháng lại 50
chủng phân lập này với các tỷ lệ tương ứng: kanamicin (49/50), streptomicin
(40/50), carbenicilin (42/50) và ) oleandomycin (33/50). Ngược lại, 50 chủng
vi khuẩn này lại kháng với các loại kháng sinh sau: penicilin (49/50),
vancomycin (45/50) và polymycin-B (32/50). Ngoài ra, một số chủng vi khuẩn
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
10
( nồng độ 105-107 tế bào/ml) cũng thể hiện độc lực qua các thí nghiệm gây
cảm nhiễm trên ấu trùng tôm càng xanh.
nitrofurantion, nalidixic acid và ampicillin) cho thấy phần lớn các chủng vi
khuẩn đều có hiện tượng đa kháng thuốc: kháng với AM-OXT-SXT-NA
chiếm 17,8%, kháng với OXT-SXT-NA chiếm 15,1%, kháng với AM-CHL-
FT-SXT-NA chiếm 13,7%, kháng với AM-FT-OXT chiếm 9,6%, kháng với
AM-CHL-FT-OXT-SXT-NA chiếm 8,2%. Từ kết quả cho thấy, sự kháng
thuốc trong thuỷ sản đang ở mức cao. Những kết quả này cho thấy được khả
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
11
năng kháng thuốc kháng sinh trong các loài vi khuẩn bản địa là một mối quan
tâm lớn trong nuôi cá da trơn ở vùng ĐBSCL.
Le et al., (2005) cũng đã nghiên cứu tính kháng thuốc của vi khuẩn đối
với norfloxacin (NFXC), oxolinic Acid (OXLA), trimethoprim (TMP) và
sulfamethoxazole (SMX) tìm thấy ở bốn vùng nuôi tôm có trồng đước ở Việt
Nam. Kết quả nghiên cứu cho thấy, đều có sự tồn dư của NFXC, OXLA,
TMP, và SMX trong tất cả các mẫu nước. Lượng kháng sinh tồn dư trong
nước ở Cà Mau cao hơn ở những tỉnh khác. Trong số đó, NFXC và TMP tồn
dư có nồng độ rất cao với giá trị 1.64 và 1.69 ppm, nồng độ SMX không có sự
khác biệt nhiều ở các tỉnh với nồng độ dao động từ 0.97-1.27ppm. Mật độ vi
khuẩn trong nước cao nhất ở tỉnh Cà Mau và thấp nhất ở Nam Định. Sự kháng
thuốc của vi khuẩn trong nước đối với NFXC, OXLA, TMP và SMX ở những
khu vực khác nhau. Phạm vi kháng thuốc của vi khuẩn đối với những loại
thuốc kháng sinh giảm khi nồng độ của thuốc kháng sinh trên môi trường
thạch gia tăng từ 0.1-10µg/ml. Phạm vi kháng thuốc cao nhất của vi khuẩn
đối với NFXC, OXLA, TMP và SMX khi có nồng độ 0.1µg/ml, được xác định
ở Cà Mau với giá trị lần lượt: 52.11%, 42.33%, 67.97%, và 67.22%. Trong lúc
đó, phạm vi này thấp nhất ở Cần Giờ (NFXC – 22.47%, OXLA – 28.19%,
TMP – 57.20%, và SMX – 54.11%). Sự phát hiện này đã chỉ ra được phạm vi
kháng thuốc cao nhất của vi khuẩn đối với NFXC, TMP và SMX với nồng độ
0.1, 1 và 10µg/ml và OXLA với nồng độ 0.1µg/ml ở tỉnh Cà Mau, nơi có nồng
Định trong khi nồng độ NFXC trong bùn ở Nam Định cũng cao nhất, nhưng
nồng độ OXLA trong bùn lại cao nhất ở Cần Giờ. Mặc dù nồng độ NFXC và
OXLA trong mẫu bùn ở Cần Giờ hoàn toàn thấp (1.85 và 1.23ppm) nhưng
phạm vi kháng thuốc của vi khuẩn đối với hai loại thuốc kháng sinh này lại
cao, 38.24% đối với NFXC 0.1µg/ml và 39.87% đối với OXLA 0.1µg/ml.
Theo nghiên cứu của Petersen et al., (2002) về sự tác động của mô
hình nuôi cá kết hợp đến mức độ kháng thuốc kháng sinh xảy ra trong mội
trường ao nuôi. Mô hình nuôi kết hợp giữa gà-cá đã được nghiên cứu trong
vòng 2 tháng sau khi bắt đầu một chu kỳ nuôi mới. Kết quả cho thấy có sự gia
tăng có ý nghĩa về tính kháng thuốc đối với 6 loại thuốc kháng sinh khác nhau
của vi khuẩn Acinetobacter spp được phân lập từ mẫu nước và bùn đáy. Mức
độ kháng thuốc ban đầu trước khi bắt đầu chu kỳ nuôi mới (trước khi tiến hành
thí nghiệm) là 1-5%. Sau 2 tháng mức độ kháng thuốc đối với oxytetracyline
và sulfamethoxazole đạt đến 100% và mức độ kháng với ciprofloxacin hơn
80%. Ảnh hưởng lâu dài của tính kháng thuốc ở mô hình nuôi kết hợp cũng đã
được nghiên cứu thêm trên 7 ao nuôi ( gồm các mô hình: gà-cá, heo-cá, vịt-
cá). Mức độ kháng thuốc của các dòng Enterococcus spp và Acinetobacter spp
được phân lập từ mẫu nước và bùn đáy ở các ao này đặc biệt cao so 4 ao đối
chứng (mô hình đơn hoặc không sử dụng thuốc kháng sinh). Nhận thấy rằng
mô hình nuôi kết hợp dường như tạo cơ hội cho vi khuẩn phát sinh tính kháng
thuốc trong môi trường ao nuôi. Điều này có thể do yếu tố áp lực chọn lọc của
thuốc kháng sinh hoặc do ảnh hưởng của các vi khuẩn mang tính kháng thuốc
từ trong phân của động vật.
Ở Nhật Neela et al., (2006) đã nghiên cứu sự đa kháng thuốc của các
dòng vi khuẩn Vibrio spp phân lập từ lớp bùn đáy và nước thuộc vùng ven
biển với tetracycline. Nghiên cứu này đã kiểm tra tính đa kháng thuốc của
giống vi khuẩn Vibrio spp với kháng tetracycline nhằm xác định rõ tính mẫn
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13
sóng 590 nm, điều chỉnh mật độ đạt giá trị OD = 0.1±0.02 (khoảng 10
8
cfu/ml).
Kết quả nồng độ MIC của kháng sinh chloramphenicol lên vi khuẩn
Vibrio (Vibrio sp (P
1
O
10
), V. ordalii (P
2
O
3
), V. anguilyticus (P
2
O
9
), V.
navarrensis (P
5
O
2
), V. carchariae (P
5
O
9
), V. minicus (P
5
O
11
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15
PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện: từ 11/2008-5/2009
Địa điểm thực hiện:
- Thu mẫu nước và mẫu bùn tại tỉnh Cần Thơ, Trà Vinh và Bến
Tre.
- Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thuỷ Sản-
Khoa Thuỷ Sản-Trường Đại Học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ
Phiếu ghi nhận thông tin khi thu mẫu (phụ lục 1), giấy vệ sinh, bao tay, giấy
nhôm, giấy làm dấu, bọc nylon, dây thun, thùng trữ lạnh, …
Chai nút mài 100 ml, ống nghiệm 10ml, đĩa petri, đèn cồn, que trãi thuỷ tinh,
bình xịt cồn, cốc đốt 250 ml, hộp đầu col pipet 0.5ml và 1ml, pipet 100-
1000ml, lame, lamelle.
Cân điện tử, máy trộn mẫu nước (vortex), máy khuấy từ, nồi khử trùng áp
suất, tủ sấy khô, tủ ấm, tủ lạnh, tủ vô trùng.
3.2.2 Môi trường, hoá chất và vật liệu nghiên cứu
Hoá chất: NaCl, cồn 96
o
, cồn 70
o
, glycerol, nước cất, các loại hoá chất nhuộm
Gram,.…
Thuốc kháng sinh dùng trong kháng sinh đồ (6 loại): ampicillin-10µg (AM),
chloramphenicol-30 µg (CHL), tetracyclin-30 µg (TE), doxycycline-30 µg
o
C và chuyển về phòng thí nghiệm phân tích
trong vòng 24 giờ.
3.3.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn
Mẫu nước
Các chai nước được lấy ra khỏi thùng và điều chỉnh về nhiệt độ phòng.
Sau đó rút bỏ một ít nước trong mỗi chai sao cho có thể đảo đều mẫu nước
trong chai. Ở mỗi chai hút 30ml/chai cho vào một chai rỗng đã được khử
trùng. Trộn đều mẫu nước và tiến hành phân tích theo phương pháp của (Le, et
al., 2005).
Pha loãng 1 ml mẫu nước ban đầu thành 10ml trong nước muối sinh lý
đã được tiệt trùng ở 121
o
C trong 15 phút. Mẫu được pha loãng đến 10
-4
. Rút
0.1ml từ những mẫu pha loãng trãi đều trên môi trường thạch TSA, TCBS,
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
17
GSP Agar sau đó đem ủ trong điều kiện hiếu khí ở 28
o
C và đọc kết quả khi
mẫu được ủ sau 24 giờ. Tất cả các thao tác đều được thực hiện trong điều kiện
vô trùng.
Mẫu bùn
Các chai bùn được lấy ra khỏi thùng và điều chỉnh về nhiệt độ phòng.
Sau đó, cho tất cả bùn từ 3 chai được thu tại 3 điểm trong ao vào cùng một
chai đã tiệt trùng và đảo đều mẫu sau đó tiến hành phân tích theo phương pháp
của (Le, et al., 2005).
trị OD = 0,1 ± 0,02 thì mật độ vi khuẩn là 10
8
tế bào/ ml.
Sau khi xác định mật số vi khuẩn thì tiến hành cho dung dịch vi khuẩn
lên môi trường thạch.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
Copyright: Tài liệu đại học ©