BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU TẠO VI VẬT LIỆU LDHs (LAYERED DOUBLE
HYDROXIDES) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỒNG KẾT TỦA
LÀM CHẤT MANG HOẠT CHẤT SINH HỌC

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : LÊ THỊ ÁNH
Niên khóa

: 2007 – 2011

Tháng 7/2011

 


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO VI VẬT LIỆU LDHs (LAYERED DOUBLE
HYDROXIDES) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỒNG KẾT TỦA

TP. Hồ Chí Minh, tháng 7/2011
Lê Thị Ánh

 

i


TÓM TẮT KHÓA LUẬN
 
Đề tài nhằm tìm phương pháp tổng hợp vi hạt LDHs làm chất mang các hợp
chất sinh học với hiệu quả cao. Để tổng hợp vi hạt đáp ứng mục đích sử dụng, điều
kiện phản ứng được điều chỉnh sao cho phù hợp. Theo kết quả từ ảnh TEM, SEM vi
hạt LDHs được tổng hợp có dạng bản mỏng, hình bát diện, mỗi mặt là dạng lục giác.
Mẫu hạt LDHs được tổng hợp tốt nhất ở điều kiện: tỉ lệ nồng độ CM MgCl2/AlCl3 =
2:1, pH 12,55, đánh sóng siêu âm ở nhiệt độ 50oC, nung mẫu tại 550oC. Dùng mẫu tốt
nhất này gắn enzyme cellulase, hiệu quả gắn tốt nhất với thời gian gắn là 30 phút. Kết
quả thu được vi hạt LDHs gắn cellulase với hàm lượng gắn đạt 3,268 mg cellulase/g
LDHs, hiệu suất cố định enzyme cellulase trên bề mặt hạt đạt trên 70% và tỉ lệ phần
trăm hoạt tính enzyme còn lại sau khi gắn đạt 80%. Áp dụng quy trình hấp phụ
enzyme cellulase để tiến hành cố định chất phát huỳnh quang FITC–avidin lên vi hạt
LDHs, với hiệu suất hấp phụ đạt 72,97% và cho ảnh quan sát rõ dưới kính hiển vi
huỳnh quang.
Qua các kết quả thu được, có thể ứng dụng LDHs để làm chất mang các hợp
chất sinh học khác nhằm phát triển các mục tiêu trong nông nghiệp và nhiều lĩnh vực
khác.

 

ii

MỤC LỤC

Trang
Lời cảm ơn ............................................................................................................................ i
Tóm tắt khóa luận ................................................................................................................ ii
Summary ............................................................................................................................. iii
Mục lục ............................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................................ viii
Danh sách các bảng ............................................................................................................ ix
Danh sách các hình .............................................................................................................. x
Chương 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1.1 ........................................................................................................................... Đ
ặt vấn đề ......................................................................................................................... 1
1.2 ........................................................................................................................... Y
êu cầu của đề tài............................................................................................................. 1
1.3 ........................................................................................................................... N
ội dung thực hiện ........................................................................................................... 2
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1 Giới thiệu về công nghệ sinh học nano ......................................................................... 3
2.1.1 Công nghệ sinh học .................................................................................................... 3
2.1.2 Công nghệ nano .......................................................................................................... 3
2.1.3 Công nghệ sinh học nano ........................................................................................... 3
2.2 Phân loại vật liệu nano .................................................................................................. 3

 

iv


2.2.1 Phân loại theo hình dáng ............................................................................................ 3

2.5.4.5 Các ứng dụng như là chất phụ gia trong Vật liệu Polymer chức năng................. 16
2.5.4.6 Ứng dụng khác ...................................................................................................... 16
2.6 Enzyme cellulase ......................................................................................................... 17
2.6.1 Định nghĩa ................................................................................................................ 17
2.6.2 Ứng dụng của enzyme cellulase ............................................................................... 17
Chương 3.VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................... 19
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. .............................................................................. 19
3.2 Vật liệu thí nghiệm ...................................................................................................... 19
3.2.1 Thiết bị và dụng cụ ................................................................................................... 19
3.2.1.1 Thiết bị.................................................................................................................. 19
3.2.1.2 Dụng cụ.................................................................................................................. 19
3.2.2 Hóa chất .................................................................................................................... 19
3.2.2.1 Hóa chất dùng để tạo vật liệu LDHs ..................................................................... 19
3.2.2.2 Hóa chất để xác định hàm lượng và hoạt tính của cellulase sau khi hấp phụ ....... 19
3.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................. 20
3.3.1 Phương pháp tạo vật liệu LDHs bằng phương pháp đồng kết tủa ........................... 20
3.3.2 Phương pháp chuẩn bị cellulase ............................................................................... 21
3.3.3. Phương pháp hấp phụ lên vi hạt LDHs ................................................................... 21
3.3.4 Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái vi hạt LDHs ........................................... 21

 

vi


3.4 Bố trí thí nghiệm .......................................................................................................... 22
3.4.1 Thí nghiệm1: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình tạo vi hạt LDHs .... 22
3.4.1.1 Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ nồng độ MgCl2 /AlCl3 ............................... 22
3.4.1.2 Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của pH lên quá trình tạo vi hạt LDHs ..................... 23
3.4.1.3 Thí nghiệm 1.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng .............................................. 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 46

 

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CBB: Coomassie Brilliant Blue
CMC: Sodium carboxymethyl cellulose
DNA: Deoxyribonucleic acid
DNS: acid 2 – hydroxyl – 3,5 – dinitrobenzoic
FITC – avidin: avidin fluorescien iso thiocyanate
LDHs: Layered double hydroxides
Mg – Al LDHs: Magnesium and Aluminum based LDHs
PVC: poly vinyl clorua
SEM: Scanning Electron Microscope
TEM: Transmission Electron Microscopy

 

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Tran
g
Bảng 2.1 Phân loại vật liệu nano theo hình dáng ........................................................ 3

Hình 4.1 Vi hạt LDHs sau khi tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa............ 31
Hình 4.2 Hình SEM của LDHs ở các tỷ lệ CM MgCl2 /AlCl3 khác nhau .............. 32
Hình 4.3 Hình TEM của LDHs ở các tỷ lệ CM MgCl2 /AlCl3 khác nhau.............. 32
Hình 4.4 Hình SEM của LDHs được tổng hợp ở các pH khác nhau .................... 34
Hình 4.5 Hình TEM của LDHs được tổng hợp ở các pH khác nhau .................... 35
Hình 4.6 Hình SEM của LDHs được tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau ............ 37
Hình 4.7 Hình TEM của LDHs được tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau ............ 37
Hình 4.8 Hình SEM của LDHs được tổng hợp ở các nhiệt độ nung khác nhau ... 39
Hình 4.9 Hình TEM của LDHs được tổng hợp ở các nhiệt độ nung khác nhau... 40
Hình 4.10 Hình dưới kính huỳnh quang của LDHs sau khi gắn FITC – avidin ... 44

 

xi


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Bên cạnh công nghệ sinh học được xem là công nghệ của thế kỷ 21, công nghệ
nano - ngành công nghệ mới nghiên cứu vật liệu ở mức vi mô cũng đang được quan
tâm. Sự kết hợp giữa công nghệ sinh học và công nghệ nano hứa hẹn mang lại nhiều
sự thay đổi mạnh mẽ cho khoa học và đời sống. Tuy nhiên, lĩnh vực này còn quá mới
và các nghiên cứu còn chưa sâu rộng, đặc biệt là ở Việt Nam.
Việt Nam là một nước nông nghiệp nên việc sử dụng các chế phẩm bảo vệ thực
vật rất rộng rãi. Tuy nhiên tàn dư của các sản phẩm phân bón, thuốc trừ sâu hóa học lại
làm ô nhiễm môi trường trầm trọng, đặc biệt là các mạch nước ngầm. Sự phát triển của
khoa học, đặc biệt là công nghệ sinh học tạo ra các chế phẩm sinh học mới đã giảm
thiểu được vấn đề trên. Mặc dầu vậy, các sản phẩm sinh học lại có nhược điểm là thời
gian tồn tại bên ngoài môi trường rất ngắn, dễ bị tác động bởi các tác nhân môi trường
dẫn tới hiệu quả sử dụng không cao. Do đó nghiên cứu giải quyết tăng hiệu suất phân



•

Từ phương pháp hấp phụ cellulase ở trên áp dụng vào việc hấp phụ một loại
protein khác, ở đây chọn protein có khả năng phát huỳnh quang FITC–avidin.

1.3. Nội dung thực hiện
•

Nghiên cứu tạo vật liệu LDHs bằng phương pháp đồng kết tủa.

•

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến việc tạo hạt: tỷ lệ nồng độ CM MgCl2/AlCl3,
pH, nhiệt độ phản ứng, nhiệt độ nung.

•

Nghiên cứu khả năng hấp phụ một hoạt chất sinh học: enzyme cellulase, FITCavidin.

•

 

Xác định hiệu suất hấp phụ enzyme cellulase, FITC–avidin.

2



dẫn
vàng, Indiumarsenid

bạc, sắt,vv.

(chế tạo từ indium

liệu

từ tính

sinh học

Fe3O4

Nano

nano

chitosan,vv.

và vàng)
(http: //www. nano2life. org).

2.2.2. Phân loại theo hình dáng
Vật liệu nano là vật liệu có ít nhất một trong ba chiều có kích thước nano. Dựa
trên sự khác biệt đó có thể chia làm các loại với các đặc điểm ở bảng sau
 

3

chiều tự do nào một chiều
cho

điện

trúc của nó có nano
không chiều, một

tử,

chiều hoặc hai chiều

dạng cầu

đan xen lẫn nhau
Ví dụ

Đám nano, hạt Dây nano, ống Màng nano
nano,vv.

Nanocomposite

nano,vv.

(http: //www. nano2life. org).

2.3. Chế tạo vật liệu nano
Theo Leslie và ctv (2005), vật liệu nano được chế tạo bằng hai phương pháp:
phương pháp từ trên xuống (top-down) và phương pháp từ dưới lên (bottom-up).
Phương pháp từ trên xuống là phương pháp tạo hạt kích thước nano từ các hạt có kích

định tần số radio, mạch tích hợp, cảm biến sinh học cực nhỏ và các loại vải, màng
“thông minh” (http: //www. nano2life. org).
2.4.2. Giảm kích thước, tăng dung lượng thiết bị điện tử
Điện tử dân dụng và máy tính là những lĩnh vực sớm biết tận dụng ưu điểm của vật
liệu nano vào sản phẩm, nổi bật có thể kể đến là nâng cao chất lượng màn hình và khả
năng dẫn điện (http: //www. nano2life. org).
2.4.3. Năng lượng xanh, môi trường sạch
Vật liệu nano đã bắt đầu được sử dụng để làm sạch rác thải, thay thế các nguồn năng
lượng không tái tạo bằng năng lượng tái tạo, giảm ô nhiễm, tăng hiệu suất của pin mặt
trời. Vật liệu nano còn được sử dụng để chế tạo các loại bao bì từ rác thải, dùng thay
thế các loại vật liệu tráng phủ truyền thống sản xuất từ nguyên liệu dầu mỏ không tái
tạo.
Trong tương lai, vật liệu nano có thể giúp tạo ra các dạng năng lượng thay thế. Sử
dụng các chất xúc tác nano, người ta có thể sản xuất hyđro (một dạng năng lượng thay
thế) từ nước. Hệ thống lọc và khử mặn nước ứng dụng công nghệ nano cho phép các
phân tử nước đi qua nhưng giữ lại các phân tử có kích thước lớn hơn như ion muối và
các tạp chất như vi khuẩn, virus, kim loại nặng, vật chất hữu cơ (http: //www.
nano2life. org).

 

5


2.4.4. Ứng dụng vật liệu nano trong y sinh
2.4.4.1. Sử dụng trực tiếp hạt nano
Sử dụng trực tiếp hạt nano không qua xử lí trung gian là ứng dụng đơn giản nhất
của vật liệu nano. Hạt nano từ tính ô xít sắt có bề mặt tích điện âm ở pH trung tính có
khả năng hấp phụ các ion kim loại nặng như As. Kết hợp hạt nano với phèn chua tạo ra
cách để làm sạch nước đơn giản và hiệu quả. Hạt nano bạc có khả năng diệt khuẩn cao,

thích hợp, bề mặt của silica có thể hấp phụ một gốc hydroxyl làm cho tích điện âm.
Lúc này DNA sẽ rời khỏi hạt nano từ tính do chúng có cùng điện tích. Loại bỏ hạt
nano từ tính bằng từ trường ngoài sẽ thu được dung dịch gồm toàn các DNA. Nhân
bản DNA của siêu vi viêm gan bằng PCR rồi xác định sự có mặt của chúng bằng phép
đo diện di (Rohan và ctv, 2007).
2.4.4.5. Hạt nano vàng để phát hiện tế bào ung thư vú
Hạt nano vàng, bạc được sử dụng trong y sinh học để đánh dấu tế bào. Nhờ kích
thước của hạt nano nhỏ hơn nhiều bước sóng ánh sáng chiếu vào mà xuất hiện hiện
tượng cộng hưởng plasmon bề mặt làm cho khả năng tán xạ ánh sáng của các hạt nano
kim loại rất mạnh (Rohan và ctv, 2007).
2.5. LDHs (Layered Double Hydroxides)
2.5.1. Định nghĩa và tính chất của LDHs
Theo Duan và ctv (2005), LDHs thuộc nhóm có tên gọi là anionic clay minerals
(khoáng ion âm). Công thức hóa học tổng quát của clay LDHs có dạng [MII1-x
MIIIx(OH)2]x+ [An–]x/n.yH2O, trong đó MII là ion kim loại hóa trị 2 như: Mg2+, Ca2+,
Zn2+,vv, MIII là ion kim loại hóa trị 3 như: Al3+, Fe3+, Cr3+,vv và An- là ion âm như: Cl-,
CO32-, NO3-, vv, những ion âm này hiện diện ở giữa các lớp vật liệu mạng tinh thể, giá
trị của x là tỷ lệ phân tử của M2+/(M2+ + M3+) và thường trong khoảng 0,2 - 0,33.
LDHs có thể được tổng hợp hoặc có nguồn gốc tự nhiên. Phổ biến nhất là loại clay
LDHs tự nhiên có công thức hóa học là Mg6Al2(OH)16CO3.4H2O.
Cấu trúc LDHs có thể được hiểu là một dạng cấu trúc có những đặc tính tương đồng
với cấu trúc của các lớp hidroxide kim loại trong khoáng bruxit. Bruxit bao gồm tám
mặt, mỗi mặt có dạng hình lục giác mà mỗi đỉnh là một ion hydroxide gói chặt các ion
Mg2+ bên trong. Hydroxide kim loại trong tinh thể khoáng bruxit thì trung hòa về điện
tích và xếp thành một khối bởi lực liên kết Van der Waal’s, khoảng cách giữa hai lớp
hydroxide của bruxit là 0,48 nm.

 

7



•

Những tác động tương hỗ giữa những yếu tố là động lực thúc đẩy sự phát triển
các đặc tính base hay hydrogen hóa chuyên biệt.

•

“Hiệu ứng nhớ” là hiệu ứng cho phép tái cấu trúc lại mạng tinh thể trong điều
kiện nung ở nhiệt độ cao và tương tác với dung dịch chứa những loại ion âm
khác nhau.

•

Khả năng trao đổi anion tốt (Duan và ctv, 2005).
2.5.3. Phương pháp tổng hợp LDHs
Theo Duan và ctv (2005), một số phương pháp tổng hợp đã được sử dụng để tổng

hợp LDHs. Phổ biến nhất là phương pháp đồng kết tủa (coprecipitation), phương pháp
thứ hai dựa trên quá trình trao đổi ion, thứ ba dựa trên các "hiệu ứng nhớ" để tái tạo lại
cấu trúc.
Một số phương pháp khác, chẳng hạn như tổng hợp sol-gel bằng cách sử dụng
dung dịch ethanol và aceton,vv cũng được sử dụng.
2.5.3.1. Phương pháp đồng kết tủa
Trong phương pháp đồng kết tủa, các dung dịch muối của M2+ và M3+ được cho
phản ứng với nhau theo một tỉ lệ nhất định về số mol.
Một ưu điểm của phương pháp tổng hợp này là có thể xen trực tiếp nhiều loại
anion vào giữa các lớp hydroxides. Để đảm bảo sự kết tủa đồng thời của các cation,
phản ứng tổng hợp cần thiết phải thực hiện trong điều kiện bão hòa. Nói chung, điều

trình như sau
LDH.Am- + Xn- → LDH.(Xn-)m/n + Amhoặc
LDH.Am- + Xn- + mH+ → LDH.(Xn-)m/n + HmA.
Có một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng trao đổi ion
•

Thứ tự trao đổi
Nói chung, khả năng trao đổi anion tỉ lệ thuận với sự tăng mật độ điện tích,
giảm bán kính ion. Trình tự trao đổi anion vô cơ giảm theo thứ tự: CO32- >
HPO42- > SO42- và OH- >F- > Cl- > Br- > NO3- > I-. Vì nitrate được trao đổi một
cách dễ dàng nhất, do đó nitrate LDHs thường được sử dụng như là tiền chất để
trao đổi ion.

•

Dung môi trao đổi ion
Không gian lớp xen của LDHs có thể được mở rộng đến mức độ nào đó cho phù
hợp với quá trình trao đổi ion. Trong môi trường nước thì thuận lợi cho trao đổi
các anion vô cơ, trong khi một dung môi hữu cơ lại dễ dàng cho trao đổi các
anion hữu cơ.

•

Giá trị pH
Đối với các anion có tính acid yếu giả sử như terephthalate hoặc benzoate, pH
thấp hơn độ pH của dung dịch phản ứng thì có sự tương tác yếu giữa các lớp

 

10

đổi ion.
Cần lưu ý rằng cả hai yếu tố: nhiệt độ nung và thành phần hóa học của tấm LDHs
có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình tái tạo cấu trúc. Muốn sử dụng "hiệu ứng nhớ" thì
phải giảm nhiệt độ nung của LDHs cha mẹ, bởi vì sự tăng nhiệt độ nung gây ra sự
khuếch tán trạng thái rắn của các cation hóa trị hai vào vị trí tứ diện, kết quả là hình
thành cấu trúc ổn định. Sau khi tái tạo cấu trúc nhờ quá trình bù nước, cơ cấu lớp

 

11


LDHs được hồi phục với mức độ khác nhau, tùy thuộc vào nhiệt độ nung trước đây,
cũng như thời gian cộng nước ở 25oC. Tái thiết được hoàn tất sau khi bù nước trong
24h khi mẫu đã được nung ở nhiệt độ bằng hoặc thấp hơn 550oC, trong khi cần 3 ngày
để tái tạo lại mẫu trước đó nung tại 750oC, chỉ có một phần nhỏ được tái tạo lại sau khi
nung ở 1000oC.
2.5.4. Ứng dụng của LDHs
LDHs được ứng dụng trong xúc tác, hấp thụ, dược phẩm, điện hóa, quang hóa, và
nhiều lĩnh vực khác, đó là do tính linh hoạt cao, dễ dàng thay đổi các thuộc tính của
LDHs.
2.5.4.1. Ứng dụng trong xúc tác
LDHs có thể được dùng làm chất hỗ trợ xúc tác, tiền xúc tác hoặc các chất xúc tác.
Năm 1971, người ta phát hiện ra LDHs có chứa các cation kim loại khác nhau (như
Mg, Zn, Ni, Cr, Co, Mn và Al) với anion lớp xen là cacbonate, nung ở 473 - 7230K và
được clo hóa một phần hoặc hoàn toàn có hiệu quả hỗ trợ cho chất xúc tác Ziegler
trong việc trùng hợp từ olefin.
Gần đây LDHs và các sản phẩm có nguồn gốc hữu cơ đã được báo cáo là hỗ trợ
cho việc cố định các enzyme. Ví dụ, Duan và ctv (2005) đã nghiên cứu sự cố định của
acylase penicillin G trong khoảng không gian lớp hydroxide của một LDHs Mg/Al