BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGÔ THANH MAI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY MÀI
GỪNG (Dioscorea zingiberensis C.H.Wright),
HỌ CỦ NÂU (Dioscoreaceae) Ở QUẢNG NGÃI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGÔ THANH MAI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY MÀI
GỪNG (Dioscorea zingiberensis C.H.Wright),
HỌ CỦ NÂU (Dioscoreaceae) Ở QUẢNG NGÃI
CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU - DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN

Ngô Thanh Mai


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

3

1.1. Chi Dioscorea L.

3

1.1.1. Vị trí phân loại

3

1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố

3

1.1.2.1. Đặc điểm thực vật



1.2.1. Đặc điểm thực vật

9

1.2.2. Phân bố, sinh thái

9

1.2.3. Thành phần hóa học

10

1.3. Các loài Dioscorea dùng làm nguyên liệu chiết xuất diosgenin

10

1.4. Diosgenin

12

1.4.1. Công thức cấu tạo, tính chất lý, hóa học

12

1.4.2. Ứng dụng của diosgenin

13

1.5. Các phƣơng pháp định lƣợng diosgenin

16

2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu

16

2.1.2. Hóa chất, thiết bị dùng trong nghiên cứu

16

2.1.2.1. Hóa chất

16

2.1.2.2. Dụng cụ

17

2.1.2.3. Thiết bị

17

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu về thực vật

18
18

2.2.1.1. Đặc điểm hình thái



19
20
22


3.1. Đặc điểm thực vật, dƣợc liệu

22

3.1.1. Mô tả đặc điểm thực vật, đặc điểm dƣợc liệu và giám định
tên khoa học của Mài gừng

22

3.1.1.1. Mô tả đặc điểm thực vật

22

3.1.1.2. Giám định tên khoa học

24

3.1.1.3. Mô tả bộ phận dùng

26

3.1.2. Hình ảnh, đặc điểm vi phẫu của lá, cuống lá, thân, thân rễ
cây Mài gừng


3.1.3.3. Đặc điểm bột thân rễ

32

3.2. Thành phần hóa học

33

3.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học

33

3.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

39

3.2.3. Chiết xuất, phân lập các hợp chất saponin có trong thân rễ
Mài gừng

40

3.2.4. Xác định cấu trúc của các hợp chất

43

3.3. Định lƣợng diosgenin trong thân rễ Mài gừng

54

3.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký


58

3.3.2.4. Độ đúng

59

3.3.2.5. Độ chính xác

60

3.3.2.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng
(LOQ)
3.3.3. Định lƣợng diosgenin trong các mẫu thân rễ Mài gừng

62
63

Chƣơng 4. BÀN LUẬN

64

4.1. Về thực vật

64

4.2. Về hóa học

65



H-NMR

aff.

: affinis

APCI-MS : Atmospheric pressure chemical ionization-Mass spectrometry
BuOH

: Butanol

d

: doublet

D.

: Dioscorea

DEPT

: Detortionless enhancement by polarisationtrasfer

EtOAc

: Ethyl acetat

EtOH


m/z

: Khối lƣợng/điện tích ion

NMR

: Nuclear Magnetic Resonance

Rf

: Hệ số di chuyển

RSD

: Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tƣơng đối)

s

: singlet

S/N

: Signal to noise ratio (Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu)


SKLM

: Sắc ký lớp mỏng

STT


5

Bảng 1.3. Các loài Dioscorea quan trọng đƣợc sử dụng để sản xuất
diosgenin trong công nghiệp

11

Bảng 3.1. So sánh đặc điểm thực vật của cây Mài gừng với loài có
đặc điểm gần nhất thuộc chi Dioscorea L., họ Củ nâu
(Dioscoreaceae)

24

Bảng 3.2. Kết quả định tính các nhóm chất trong thân rễ Mài gừng

38

Bảng 3.3. Hàm lƣợng cao các phân đoạn chiết xuất từ thân rễ Mài
gừng

42

Bảng 3.4. Phổ 1D-NMR của 2D1 và dioscin

48

Bảng 3.5. Phổ 1D-NMR của 2E1 và deltonin

53

Trang

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của diosgenin

12

Hình 3.1. Một số đặc điểm hình thái của cây Mài gừng

23

Hình 3.2. Vi phẫu lá Mài gừng

27

Hình 3.3. Vi phẫu cuống lá Mài gừng

27

Hình 3.4. Vi phẫu phần cuống lá dày lên sát thân

28

Hình 3.5. Vi phẫu thân Mài gừng

29

Hình 3.6. Vi phẫu thân rễ Mài gừng

30



45

Hình 3.15. Phổ 13C-NMR của 2D1 trong pyridine-d5

46

Hình 3.16. Tƣơng tác HMBC của các proton anome trong 2D1

47

Hình 3.17. Cấu trúc hóa học của 2D1

47

Hình 3.18. Phổ 1H-NMR của 2E1 trong pyridin-d5

50

Hình 3.19. Phổ 13C-NMR của 2E1 trong pyridin-d5

51

Hình 3.20. Tƣơng tác HMBC của các proton anome

51

Hình 3.21. Cấu trúc hóa học của 2E1

52

hoặc từ các sapogenin và alcaloid steroid thực vật (diosgenin, hecogenin,
solasodin…) [13]. Khoảng 50 - 60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên
toàn cầu đƣợc sản xuất từ diosgenin. Nhiều nƣớc trên thế giới cũng nhƣ Việt
Nam đã và đang chú ý nghiên cứu các cây cỏ thuộc chi Dioscorea, họ Củ nâu
(Dioscoreaceae) với mục đích chiết xuất diosgenin sản xuất các chế phẩm
hormon steroid. Nhu cầu về lƣợng thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin
ngày càng lớn, trong khi đó nguồn nguyên liệu cung cấp diosgenin ngày càng
giảm do sự khai thác quá mức [35], [37], [40]. Điều này đòi hỏi cần tìm thêm
những nguồn nguyên liệu khác cung cấp diosgenin. Trong khi đó, chi
Dioscorea trên thế giới có khoảng 600 loài, ở Việt Nam có hơn 40 loài [5],
[10], [25]. Và còn nhiều loài trong số đó chƣa đƣợc nghiên cứu để xác minh
hàm lƣợng diosgenin.
Gần đây chúng tôi mới phát hiện một loài Dioscorea zingiberensis tại
Quảng Ngãi mà ngƣời dân địa phƣơng gọi là cây Mài gừng (từ đây chúng tôi
gọi loài này là Mài gừng). Trên thế giới có rất ít công trình nghiên cứu về loài
này [42]. Tại Việt Nam, theo tổng quan tài liệu chƣa thấy có nghiên cứu về
hóa học nào của cây này, nhất là thành phần saponin. Năm 1999, Nguyễn
Minh Khởi đã xác định hàm lƣợng diosgenin trong thân rễ Mài gừng từ 1,41
đến 1,92% bằng sắc ký khí [23]. Tuy nhiên phƣơng pháp này có quá trình
chuẩn bị mẫu phức tạp hơn so với phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC). Mặt khác, chƣa có nghiên cứu nào định lƣợng diosgenin trong thân
rễ Mài gừng bằng HPLC ở Việt Nam.

1


Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và
thành phần hóa học của cây Mài gừng (Dioscorea zingiberensis C.H.Wright),
họ Củ nâu (Dioscoreaceae) ở Quảng Ngãi” với mục tiêu:
- Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học và giám định tên khoa

nhau lắm, các đặc điểm không phong phú nhƣ hoa đực. Bầu 3 ô, mỗi ô chứa 2
noãn, noãn ngƣợc, đầu nhụy 6 tạo thành 3 cặp. Quả nang chẻ ô có 3 cánh.
Quả mở bằng cách nứt dọc theo mép của cánh với trục quả. Hạt có cánh ở tất
cả các loài.

3


1.1.2.2. Phân bố
Chi có khoảng 600 loài, phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và ôn đới châu Á,
Australia, châu Mỹ [47], [49] [57], [66]. Ở Việt Nam có hơn 40 loài [6], [25],
[68]. Ở châu Á có khoảng 140 loài [70].
1.1.3. Các nghiên cứu về phân loại thực vật của chi Dioscorea L. ở Việt
Nam
Nhiều tác giả Việt Nam và nƣớc ngoài đã nghiên cứu chi Dioscorea L. ở
Việt Nam về mặt phân loại thực vật.
Loureiro trong bộ “Thực vật chí Nam Bộ” đã mô tả 5 loài thuộc chi
Dioscorea L. ở Nam bộ nƣớc ta [39].
Prain và Burkill đã mô tả 51 loài thuộc chi Dioscorea L. ở Đông dƣơng,
trong đó Việt Nam có 27 loài [70] (Bảng 1.1). Đây là công trình lớn nhất và
có giá trị nhất về nghiên cứu phân loại chi Dioscorea L. ở Đông dƣơng cũng
nhƣ Việt Nam.
Bảng 1.1. Số lƣợng các loài trong chi Dioscorea L. ở Việt Nam
STT

Sections

Số loài có ở Việt Nam

1


Paramecocarpa Prain et Burkill

1

7

Lasiophyton Uline

7

8

Opsophyton Uline

1

9

Enantiophyllum Uline

10

Năm 1972, Phạm Hoàng Hộ trong cuốn “Cây cỏ miền Nam Việt Nam”
đã thống kê 24 loài ở Việt nam [30], tác giả đã tóm tắt nêu sự phân bố và bổ

4


sung thêm hình vẽ các loài mà Prain và Burkill đã công bố trong “Thực vật

2

D. membranacea Piere

Từ mỏng

[3], [10], [70]

3

D. dissimulan et Burkill

Từ dấu

[3], [10], [70]

4

D. hemsleyi Prain et Burkill

Từ hemsley

[10], [14], [70]

5

D. paradoxa Prain et Burkill

Từ ngƣợc


Có nhiều công trình nghiên cứu về mặt hóa học của các cây thuộc chi
Dioscorea. Kết quả nghiên cứu cho thấy thành phần chủ yếu trong rễ củ của
chúng là tinh bột [51], [ 56]. Nhiều loài đƣợc xếp vào danh sách nguyên liệu
để thu tinh bột (D. allata). Tinh bột trong củ của một số loài Dioscorea không
chỉ sử dụng làm lƣơng thực, thực phẩm mà còn làm tá dƣợc trong sản xuất
thuốc, một số loài có hàm lƣợng tanin cao. Các nhà khoa học cũng đã chiết ra
các dẫn chất phenanthren (từ loài D. delicata) [43].
Thành phần alcaloid cũng đƣợc Monroe E. Wall chứng minh có trong
loài Dioscorea dumetorum (Kunth) Pax [63]. Tuy nhiên, việc nghiên cứu về
các alcaloid chƣa đƣợc chú ý đến nhiều.
Các nhà khoa học cũng tìm thấy flavonoid, lipid, tanin, đƣờng có trong
một số loài Dioscorea [51], [56], [63].
Takeda đã nghiên cứu sapogenin steroid của họ Dioscoreaceae, ông nhận
thấy rằng có sự liên quan về mặt hóa học và hình thái giải phẫu giữa các loài
khác nhau trong chi Củ nâu (Dioscorea L.). Theo tác giả các loài thuộc
section Stenophora Uline thƣờng chứa saponin steroid trong thân rễ của
chúng, còn ở các section khác không tìm thấy các chất này [59]. Phần lớn các
công trình nghiên cứu về mặt hóa học của chi Dioscorea L. thƣờng quan tâm
đến thành phần saponin trong rễ củ và thành phần này thƣờng đƣợc coi là hoạt
chất chính. Các nghiên cứu về mặt hóa học của họ Củ nâu trƣớc đây cho thấy
có saponin steroid [48], [56], [63].
Các công trình nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ đã chứng minh các
saponin steroid có nhiều trong họ Hành (Liliaceae), họ Thủy tiên
(Amaryllidaceae) và họ Củ Nâu (Dioscoreaceae). Đáng chú ý nhất là các loài
trong chi Dioscorea L. [63]. Trong công nghiệp để tổng hợp các thuốc
hormon steroid trƣớc đây, ngƣời ta chủ yếu dùng diosgenin đƣợc chiết xuất từ
các loài thuộc chi Dioscorea L. Khoảng 90% các hormon đƣợc sản xuất từ
6



khoai mỡ (D. alata), củ từ (D. esculenta), khoai rạng (D. glabra), củ mài (D.
persimilis)…[6], [15], [25].
- Thân rễ chứa tanin, dùng để nhuộm lƣới và quần áo nhƣ: củ nâu (D.
cirhosa), từ ngƣợc mùa (D. intempestiva)…[6], [25].
- Thân rễ một số loài có độc, dùng để diệt chấy rận, duốc cá, tẩm mũi tên
nhƣ: củ mài gừng (D. zingiberensis), từ poilane (D. deltoidea), củ nần (D.
hispida)…[6], [25].
1.1.5.2. Ứng dụng trong y học
Một số loài dùng để chiết xuất diosgenin từ thân rễ. Ngoài ra, nhiều loài
trong chi Dioscorea đƣợc sử dụng làm thuốc. Dƣới đây là một số tác dụng
của các loài thuộc chi Dioscorea:
- Bổ dƣỡng nhất là khi cơ thể suy nhƣợc, thận suy: D. alata, D.
asculenta, D. glabra, D. persimilis…[5], [6], [25].
- Chỉ huyết, tiêu ứ huyết: D. bulbifera, D. cirrhosa, D. esculenta...[5],
[6], [25].
- Mạnh gân xƣơng, trị phong thấp, đau lƣng, mỏi gối: D. hispida, D.
pentaphylla, D. collettii…[5], [6], [25].
- Trị sƣng tấy, vết thƣơng phần mềm: D. esculenta, D. chingii, D.
subcalva, D. pentaphylla, D. hispida…[5], [6], [25].
- Giải độc: D. esculenta…[5], [6], [25].
Các loài Dioscorea có chứa phytoestrogens, các chất này có nhiều tác
dụng kháng độc tố nhƣ làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể và tăng cƣờng
sức khỏe toàn diện nhất là ở phụ nữ [54]. Gần đây, thân rễ Dioscorea đƣợc
xác định có tác dụng điều chỉnh đáp ứng miễn dịch, kháng viêm, chống loãng
xƣơng [50], [54]. Thêm nữa, tác dụng chống oxy hóa của dioscorin, một
protein dự trữ trong thân rễ Dioscorea cũng đƣợc nghiên cứu rộng rãi. Đã
chứng minh đƣợc rằng sử dụng thân rễ Dioscorea có thể cải thiện một số bất

8




1.2.3. Thành phần hóa học
Cho đến nay, theo tổng quan tài liệu, chƣa có nghiên cứu nào sâu về đặc
điểm vi phẫu, đặc điểm bột, thành phần hóa học và định lƣợng diosgenin bằng
phƣơng pháp HPLC của cây Mài gừng. Vì vậy việc nghiên cứu đặc điểm thực
vật, thành phần hóa học của cây Mài gừng là cần thiết, là tiền đề cho công tác
tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu Mài gừng và tăng giá trị ứng dụng của cây vào thực
tế - một nguồn nguyên liệu chiết diosgenin tiềm năng, góp phần làm phong
phú hơn những hiểu biết về hóa thực vật của các cây thuộc chi Dioscorea, bổ
sung thêm thông tin vào cơ sở dữ liệu khoa học của Việt Nam.
1.3. Các loài Dioscorea dùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất diosgenin
Khoảng 90% các dẫn chất steroid dùng làm thuốc đƣợc sản xuất đều đi
từ nguyên liệu là diosgenin. Mặc dù diosgenin có gặp trong họ Liliaceae (chi
Trillium), họ Zingiberaceae (chi Costus), họ Taccaceae (chi Tacca) nhƣng chỉ
có họ Dioscoreaceae mới có giá trị thực tế [7], [17].
Theo số liệu của Barua và cộng sự năm 1954, 1956 có trên 50 loài
Dioscorea chứa diosgenin [54]. Những loài Dioscorea có hàm lƣợng
diosgenin đáng kể thƣờng có thân quấn ngƣợc chiều kim đồng hồ [17]. Phần
lớn diosgenin đƣợc sản xuất trên thế giới xuất phát từ các loài Trung Mỹ, chủ
yếu là D. floribunda và D. composita, cả hai đều mọc hoang ở bản địa [54].
Trong thân rễ của D. floribunda, D. composita thành phần diosgenin và
yamogenin chiếm gần 90% glycosid toàn phần, cả hai đều là những tiền chất
steroid có giá trị. Sapogenin thu đƣợc từ D. deltoidea không có tạp chất
pennogenin nên có giá trị cao trên thị trƣờng steroid [62].
D. nipponica và D. zingiberensis chứa diosgenin và đƣợc trồng nhiều ở
Trung Quốc, nƣớc sản xuất diosgenin nhiều nhất hiện nay [35].

10


Costaceae (chi Costus), Zygophyllaceae (chi Tribulus), Taccaceae (chi
Tacca). Qua đó phát hiện 4 loài có triển vọng làm nguyên liệu chiết xuất
diosgenin [19], [20]:
- D. dissimulans (hàm lƣợng diosgenin 2%).
- D. membranacea (hàm lƣợng diosgenin 2 - 2,3%).
- D. collettii (hàm lƣợng diosgenin 2,5 - 4,4%).
- D. zingiberensis (hàm lƣợng diosgenin 1,4 - 2,4%).
Về mối liên quan giữa hình thái thực vật và thành hóa học, các loài
Dioscorea có hàm lƣợng saponin steroid đáng kể ở Việt Nam, bên cạnh có

11


đặc điểm thân rễ và dây leo quấn trái, đều có những cặp gai cong ở cuống lá
[20].
Cũng trong thời gian này Viện Dƣợc liệu [18], [33], di thực 3 loài
Dioscorea vào Việt Nam: D. composita, D. floribunda và D. deltoidea. Đã
xác định điều kiện trồng chăm sóc phù hợp với 3 loài trên. Tuy nhiên
sapogenin thu đƣợc từ D. composita và D. floribunda đều có tạp chất
pennogenin (hàm lƣợng pennogenin trong sản phẩm từ vết đến 35% đối với
D. composita, và từ 1 - 5% đối với D. floribunda). Loài D. deltoidea có ƣu
điểm chỉ chứa một sapogenin là diosgenin. Các nhà khoa học đã nghiên cứu
xử lý tạp chất pennogenin song không thành công. Nghiên cứu bán tổng hợp
16-DPA từ hỗn hợp diosgenin-pennogenin chƣa biết tỷ lệ thành phần, chiết
xuất từ D. composita và D. floribunda cho thấy hiệu suất chỉ bằng 1/2 so với
điều chế từ diosgenin có hàm lƣợng trên 90% [12], [18] .
Các nhà khoa học tại Viện Dƣợc liệu đã xây dựng quy trình chiết xuất
diosgenin từ dƣợc liệu, áp dụng để chiết diosgenin từ D. floribunda trên quy
mô phòng thí nghiệm và quy mô bán công nghiệp. Từ diosgenin chiết đƣợc đã
tổng hợp 16-DPA và các dẫn chất steroid [18].

* Tính chất hóa học: diosgenin là một sapogenin steroid thuộc nhóm
spirostan nên có các đặc tính sau:
- Có tính chất tạo bọt: tạo bọt trong môi trƣờng kiềm.
- Các phản ứng màu:
+ Acid sulfuric đậm đặc hòa tan các saponin và cho thấy màu thay đổi từ
vàng, đỏ, lơ-xanh lá hay lơ-tím (Phản ứng Salkowski).
+ Sapogenin hòa tan vào 1ml anhydrid acetic, cho thêm 1 giọt H 2SO4
đậm đặc cho màu xanh lá (Phản ứng Liebermann - Burchardt).
1.4.2. Ứng dụng của diosgenin
- Diosgenin đƣợc chứng minh là có tác dụng duy trì ổn định mức
cholesterol máu và là nguyên liệu khởi đầu cho việc tổng hợp một số sản
phẩm nội tiết tố nhƣ: dehydroepiandrosteron, progesteron. Diosgenin có tác
dụng ngăn ngừa sự mất xƣơng ở mức độ tƣơng tự estrogen. Do vậy diosgenin
đƣợc sử dụng để điều trị cho bệnh nhân sau mãn kinh để làm giảm sự tiến
triển loãng xƣơng [40].
- Diosgenin có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu và huyết khối, kéo dài
thời gian thromboplastin (APTT), thời gian thrombin (TT), thời gian
prothrombin (PT). Do đó, nó có tác dụng trong việc điều trị các bệnh về tim
mạch nhƣ bệnh mạch vành và cơn đau thắt ngực [42].

13